Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ved å bruke Published: September 9, 2014 doi: 10.3791/51601
Automatic Translation
1, 2, 1
1Section of Microbiology, MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London, 2Département de Biologie du Développement et des Cellules Souches, Institut Pasteur, Unité Macrophages et Développement de l'Immunité

Summary

For å motvirke patogen formidling, vertsceller omorganisere sin cytoskeleton å fordeler bakterier og indusere autofagi. Ved hjelp av Shigella-infeksjon av vevskulturceller, vert og patogen determinants bak denne prosessen er identifisert og karakterisert. Ved hjelp av sebrafisk modeller av Shigella-infeksjon, er rollen oppdaget molekyler og mekanismer undersøkt in vivo.

Abstract

Shigella flexneri er en intracellulær patogen som kan flykte fra phagosomes å nå cytosol, og polymer verten aktin cytoskjelettet å fremme sin motilitet og formidling. Ny arbeid har vist at proteiner som er involvert i aktin-baserte motilitet er også knyttet til autophagy, en intracellulær degradering prosess avgjørende for celle autonom immunitet. Påfallende, kan vertsceller hindre aktin-baserte motilitet av S. flexneri ved compartmentalizing bakterier i 'septin bur' og oppgi dem til autofagi. Disse observasjonene tyder på at en mer fullstendig forståelse av septins, en familie av trådformede GTP-bindende proteiner, vil gi ny innsikt i prosessen med autofagi. Denne rapporten beskriver protokoller for å overvåke autofagi-cytoskjelett interaksjoner forårsaket av S. flexneri in vitro ved hjelp av vevskultur-celler og in vivo ved hjelp av sebrafisk larver. Disse protokollene aktiver etterforskning av intracellulære mechanisms som styrer bakteriespredning på molekyl, cellulær, og hele organismen nivå.

Introduction

Shigella flexneri, en Gram-negative invasiv enteropatogene bakterier, kan flykte fra phagosomes til cytosol, og polymer verten aktin cytoskjelettet å unngå cytosolic immunresponser og fremme intra og inter bevegelse 1,2. Til tross for forståelsen av aktin-baserte motility in vitro 3,4, hvilke mekanismer begrenser bakteriespredning in vivo er ikke blitt fullstendig definert. Dette er kritisk for en mer fullstendig forståelse av medfødt immunitet og vert forsvar.

Septins, en svært konservert familie av proteiner blant metazoans, er guanosine trifosfat (GTP) -binding proteiner som montere inn hetero oligomeric komplekser og danner upolare filamenter som forbinder med cellemembraner og cytoskjelettet 5,6. Nyere arbeider har oppdaget at infiserte vertsceller kan hindre Shigella aktin basert bevegeligheten ved compartmentalizing bakterier rettet mot autophAGY inne 'septin bur', avslører den første cellulære mekanisme som motvirker aktin basert motilitet 7,8. Et stort åpent felt av etterforskningen nå ligger i 'septin biologi og infeksjon'. Septin montering, indusert av en rekke patogener (f.eks, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), kan fremstå som et sentralt tema i vertsforsvar 5,12.

Autofagi, en svært konservert intracellulær nedbrytning prosessen, blir sett på som en viktig del av celle-autonome immunitet på grunn av sin evne til å levere cytosoliske bakterier til lysosome 13,14. Men til rollen bakteriell autofagi in vivo begrense eller fremme bakteriell replikering fortsatt dårlig forstått 15,16. Sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som et virveldyr modell for studiet av infeksjoner fordi det er optisk tilgjengeligpå larvestadier når det medfødte immunsystemet er allerede funksjonell 17,18. Nyere arbeider har preget mottakelighet av sebrafisk larver til S. flexneri, et paradigme for bakteriell autofagi 15, og har brukt den Shigella -zebrafish infeksjon modell for å studere manipulering av autofagi for antibakteriell behandling in vivo 19.

Denne rapporten gir nye verktøy og metoder for å studere S. flexneri interaksjoner med autofagi og cytoskjelettet. I et første trinn, å overvåke protokoller autophagy-cytoskjelettet interaksjoner er beskrevet ved hjelp av Shigella infeksjon av human epitelial cellelinje HeLa. For å vurdere rollen autofagi-cytoskjelett interaksjoner på Shigella-infeksjon prosessen in vitro, metoder manipulere autofagi og cytoskjelett komponenter (ved hjelp av siRNA eller farmakologiske reagenser) er gitt. Ny arbeid har vist at ved hjelp av Shigella-infeksjon of sebrafisk larver, kan tilsvarende analyser anvendes for å studere den cellebiologi for infeksjon in vivo. Protokoller for å forberede og infisere sebrafisk larver er detaljert, og vurdere verten respons på Shigella-infeksjon in vivo, protokoller for å bestemme verts overlevelse og bakteriell byrden av infiserte larver er gitt. Metoder for å overvåke rekruttering av septin og autofagi markører til Shigella (ved hjelp av enten fast eller levende sebrafisk larver) og metoder for å teste hvilken rolle disse prosessene in vivo [hjelp morfolino- oligonukleotider (injisert i 1-4 cellestadiet embryoer) eller farmakologiske reagenser ( lagt direkte til sebrafisk badevannet)] blir også diskutert. Denne arbeidsprogram er forventet å gi innsikt i de mekanismer som kreves for kontroll av infeksjon av cytosoliske verts responser.

Protocol

1. Overvåking Autofagi og Cytoskjelettet In Vitro Bruke vevskulturceller

  1. Forbered S. flexneri
    1. Plate S. flexneri M90T (vill-type) fra -80 ° C glyserol lager på en Congo Red tryptisk soya kasein (TCS) agarplate. Inkuber over natten ved 37 ° C. Den samme plate kan brukes i flere eksperimenter.
    2. Plukk en individuell koloni og vokse i 8 ml TCS medier i en rister over natten ved 37 ° C.
      MERK: Kongo-red binding indikerer at virulensplasmid har blitt beholdt.
    3. Å subkultur bakterier for eksponentiell vekst, vaksinere friske TCS med overnatter bakteriekultur på 1/80 fortynning og vokse i en shaker ved 37 ° C til OD 600 = 0,3-0,6.
    4. Spinn bakteriell subkultur ved 1000 xg i 5 min. Vask pelleten med MEM og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min. Rekonstituere pelleten i MEM til OD 600 = 0,3-0,6.
  2. Forbered HeLa CeLLS for infeksjon
    1. Dyrk HeLa-celler i "komplett medium", dvs.., MEM pluss L-alanyl-L-glutamin supplert med 1 mM natrium-pyruvat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyre-løsning, og 10% føtalt kalveserum.
    2. Plate 1-1,5 x 10 5 celler i 6-brønners plater 24 eller 48 timer før forsøket begynner. Plate på glass Dekk i seks-brønns plater for mikroskopi, eller plate på 35 mm glassbunn retter å forberede for live imaging.
      MERK: (. F.eks, aktin haler, septin bur) for å følge autofagi (f.eks ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) og cytoskeleton dynamikk i sanntid under Shigella-infeksjon ved bruk av levende bilder kan vevskulturceller være forbigående transfektert ved hjelp GFP-, RFP- eller CFP-merkede konstruksjoner (se diskusjon).
  3. Infeksjon
    1. Infisere celler med 100: 1 multiplisitet av infeksjon (MOI) av Shigella (OD 600 = 0,3 til 0,6) fortynnet i MEM; direkte legge til HeLa-celler belagt i 6-well plater 24 - 48 timer før infeksjon (som beskrevet i avsnitt 1.2) i 2 ml MEM (serum utsultet).
    2. For å maksimere bakteriell tilslutning til vertsceller, bakterier og sentrifuger cellene ved 700 xg i 10 min ved romtemperatur. Etter sentrifugering, inkuber i 30 min ved 37 ° C, 5% CO 2 og tillater infeksjon for å fortsette.
    3. Vask infiserte cellene to ganger med friskt MEM og inkuberes med gentamicin inneholdende fullstendig medium (50 mikrogram / ml, for å eliminere ekstracellulære bakterier) i 1-4 timer, avhengig av forsøket.
  4. Fikse og merking Infiserte HeLa celler for Mikros
    1. Vask infiserte celler to ganger med 1x PBS, og fikse i 15 minutter i 4% paraformaldehyde i 1x PBS ved romtemperatur. For å fjerne paraformaldehyde, vaske celler 2x med 1x PBS.
    2. Inkuber faste celler i 50 mM ammoniumklorid i 10 min ved romtemperatur. Vask en gang med 1 x PBS, og permeabilize celler i 4 minutter med 0,1% oktylfenol etylenoksyd kondensat ved værelse temperatur.
      MERK: Alternativer til Oktylfenol etylenoksid kondensat for permeabilization, slik som saponin eller metanol, kan brukes for ulike bevaring av cellulære strukturer 20.
    3. Vask cellene i 1x PBS og inkuber i vått kammer med primære antistoffer mot autofagi kritiske komponenter (for eksempel P62 / SQSTM1) eller septin cytoskjelettet (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9, og sept11 er uttrykt i HeLa celler) i 30 min (ved romtemperatur) for å over natten (4 ° C).
    4. Vask cellene to ganger med 1 x PBS og inkuberes i fuktig kammer med sekundære antistoffer, og merke filamentøse aktin (F-aktin) med phalloidin, i 30 minutter (ved romtemperatur) til å over natten (4 ° C). For farging av vertscellekjerner legg 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    5. Vask cellene i 1x PBS og montere glassDekk på lysbilder ved hjelp av monteringsmedium.
  5. Mikroskopisk Imaging av infiserte HeLa celler
    1. Skal avbilde infected celler bruker en epifluorescence eller konfokal mikroskop og en 63X eller 100X mål å identifisere DAPI-merket Shigella.
      MERK: Som vist i figur 1A - 1C, kan septin bur bli visualisert som ring lignende strukturer, ~ 0,6 mikrometer i diameter, rundt cytosoliske bakterier polymeriserende aktin og rekruttere autofagi markører (for eksempel P62 og LC3) 7,8. Derimot, vil bakterier polymeriserende aktin haler ikke compartmentalized av septin bur og vil ikke være målrettet til autofagi 7,8.
    2. Bruke en epifluorescence eller konfokal mikroskop og en 63X eller 100X objektiv, kvantifisere antall intracellulære bakterier per mikroskopisk feltet. Også kvantifisere antallet bakterier fanget i septin bur og målrettet til autofagi, eller polymeriserende aktin haler og rømmer autofagi.
    3. For å bestemme hvor stor prosentandel av bakterier fanget i septin bur eller polymeriserende aktin haler, ta en Z-stack bildeserie av infected celler, prosess bildene og telle minst 500-1000 bakterier per eksperiment fra minst tre uavhengige eksperimenter.

2. Funksjonsanalyse Autofagi og Cytoskjelettet In Vitro

MERK: Både genetiske og farmakologiske metoder kan brukes til å forurolige autophagy i infiserte vevskulturceller, og virkningen av disse behandlinger på løpet av infeksjonen kan overvåkes.

  1. siRNA-mediert Silencing
    1. Plate 0,8 x 10 5 HeLa-celler på glassdekkglass i 6-brønns plater i fullstendig medium.
    2. Transfektere neste dag ved hjelp av en lipid-basert reagens transfeksjon med siRNA mot autophagy og / eller cytoskjelett markører.
    3. Etter at den ønskede inkubasjonsperiode, infisere cellene med Shigella som beskrevet i avsnitt 1.3.
    4. Fikse og merke cellene som beskrevet i kapittel 1.4.
  2. Farmakologisk Manipulation
    f.eks til depolimerisering aktin cytoskjelettet bruk cytokalasin D eller latrunculin B, for å depolimerisering mikrotubuli bruke nocodazole, å blokkere actomyosin aktivitet bruk Blebbistatin, eller å forstyrre septin montering brukes forchlorfeneuron. Autofagi kan stimuleres ved hjelp av rapamycin eller blokkert av hjelp bafilomycin.
    1. Å manipulere cytoskjelettet under Shigella-infeksjon, først infisere celler med Shigella som beskrevet i avsnitt 1.3 og gi tilstrekkelig tid for bakterier å angi celler og flykte fra phagosome til cytosol (f.eks.,> 1,5 t etter infeksjon).
    2. Fortynn medikamentene fra stamløsning [forrådsoppløsning suspendert i dimetylsulfoksyd (DMSO)] i MEM til en endelig konsentrasjon på 5 M (cytokalasin D, latrunculin B, nocodazole), 20 M (forchlorfeneuron) eller 50 M (Blebbistatin), og behandling av celler i 30 minutter ved 37 ° C. Den totale mengden av medikament (volum av DMSO / drug blandingen) tilsatt per plate / ampulle med celler er 1-5 mL (avhengig av stamløsningen) per 2 ml media. Unn-celler med en tilsvarende dose av DMSO fortynnet i MEM som en negativ kontroll.
    3. Fikse og merke cellene som beskrevet i kapittel 1.4.
      MERK: For manipulering av autophagic fluks (i infiserte eller noninfected celler), forlenge medikamentell behandling ved hjelp av rapamycin (20 nM) eller bafilomycin (160 nM) fra 4 til 12 timer.
  3. Western Blot
    MERK: autophagic aktivitet kan kvantifiseres ved å måle proteinnivået av autofagi markører som P62 og LC3.
    1. Etter at den ønskede inkubasjonsperiode, samle og lysere cellene for immunoblotting. Kjør proteinekstrakter på 8, 10, eller 14% akrylamidgeler.
    2. Autophagic flux, altså. frekvensen av autofagi, kan analyseres som beskrevet i 21,22.
  4. Mikroskopisk Imaging og kvantifisering
    1. Bruke en epifluorescence eller konfokal mikroskop og en 63X eller 100X objektive, effekten av siRNA eller medikamentbehandling på Shigella-infeksjon kan evalueres ved kvantitativ mikroskopi (dvs. telling av autophagosomes, septin bur og aktin haler) som beskrevet i seksjon 1.5 og som er vist i figurene 2A og 2B.

3. In vivo avbildning av S. flexneri Interaksjoner med Autofagi og Cytoskjelettet

MERK: sebrafisk-modellen av Shigella-infeksjon kan brukes til å undersøke septin caging og autofagi in vivo 19.

  1. Forbered S. flexneri
    1. Kultur S. flexneri, som beskrevet i avsnitt 1.1.
    2. Ved OD 600 = 0,3 til 0,6, spin 8 ml bakteriell subkultur ved 1000 xg i 10 min. Vask pelleten med 1 x PBS og sentrifuger ved 1000 xg i 10 min.
    3. Resuspender pelleten i 80 mL av 0,1% fenolrødt 1x PBS for å oppnå ~ 2000 bakterier / nl. Hold bacterial forberedelse på is for å bremse veksten.
      MERK: Legge fenolrødt vil bidra til å visualisere pode når injisere i larvene.
  2. Forbered Sebrafisk Larver for Injection
    MERK: Sebrafisk er lagt som egg og er identifisert som embryo før 72 timer post befruktning, når de kalles larver.
    1. Avle voksen sebrafisk som beskrevet i Westerfield 23 ved å plassere fire menn og åtte kvinner (vanligvis en 2: 1-forhold) i en separat akvarium med bunnen dekket med klinkekuler (som vil hindre voksne fra å spise gytt egg). Alternativt kan man legge egg samling kurver inne i avl tanks natten før.
      MERK: Egg blir befruktet ~ 30 min etter at lysene går på i sebrafisk anlegget 23, og bør samles så snart som mulig for å hindre muggvekst. Egg samling kurver tjene til å samle egg slik at de lett kan høstes og også beskytte eggene fra voksne.
    2. Samle embryoets og rengjør dem ved å vaske i embryo media (E2) med 0,003% blekemiddel for 10 min. Fjern E2 med blekemiddel, vaske embryoer 5x i E2 medium, og vokse embryoene i 10 cm petriskål (100 embryo / 50 ml E2 medium) ved 28 ° C.
    3. Hvis embryoer eller larver vil bli brukt til mikros studier, ved 24-timers post-fertilisering legge 0,003% N-phenylthiourea til E2 medium for å hindre melanization. Hold embryoene ved 28 º C for normal utvikling.
      MERK: Sebrafisk larvene er klar for infeksjon på 72 timer post befruktning.
    4. For infeksjon og mikros prosedyrer, bedøve sebrafisk larver i 200 g / ml Tricaine i E2.
  3. Utarbeidelse av Sebrafisk Larver for intravenøs og lokal infeksjon
    MERK: For å vurdere sebrafisk overlevelse under Shigella-infeksjon, utføre caudal intravenøse injeksjoner. For å visualisere rekrutteringen av septin og autofagi markører til Shigella, utføre infeksjon ved lokaliserte nettsteder som halen muskel.
    1. For en kaudal intravenøs injeksjon, plasser bedøvet larver lateralt med ryggsiden vendt mot nålen. Som vist i figur 3A, plasseres i nærheten av nålespissen (posterior) til den urogenitale åpning, med sikte på halevenen, og stikke hull på huden og gi den ønskede bakteriedose (injeksjonsvolum 1-5 nl).
      MERK: Intravenøs infeksjon er utfordrende å utføre og vil ta flere uker med trening å bli komfortabel med denne prosedyren. Injisering for trening fenolrødt (uten bakterier) vil bidra til å vurdere injeksjonsstedet riktig.
      NB: I tilfelle av Shigella, er doseavhengige forsøk vist at en lav dose infeksjon (<1000 CFU) blir fjernet i løpet av 48 timer, og en høy dose infeksjon (> 4000 CFU) fører til vert dødelighet innen 48 t 19.
    2. For en hale muskel infeksjon, plasserer du bedøvet larver som beskrevet i avsnitt 3.3.1. Som vist i figur 3A, plassere nålen forsiktigy enn muskel somites (dvs. segmenter av skjelettmuskulatur) og injisere et lite volum (ie., en nl) av bakteriell forberedelse.
  4. Intravenøs injeksjon av bakterier i Larver
    1. Trekk borsilikatglass microcapillaries som beskrevet i 24.
    2. Koble nål til innehaveren av den tredimensjonale grov manuell manipulator og bryte nålespissen med fine pinsett.
    3. Slik legger du nålen, plassere en dråpe bakteriekultur på et dekkglass. Slå på microinjector og gassflaske, litt senk nålespissen inn i drop, og fylle opp nålen med den ønskede mengden av bakteriell forberedelse.
    4. Slik kalibrerer injeksjonsvolum, plassere en dråpe mineralolje på et dekkglass og sprøyt bakteriell forberedelse. Mål diameteren på slipp ved hjelp av en mikrometer og beregne den injiserte volumet [V = (4/3) πr 3].
      MERK: Ved hjelp av injeksjon innstillinger av 40 psi og 50 msek med en bacterial forberedelse som beskrevet i kapittel 3.1 vil gi ~ 2000 CFU / nl.
    5. Tilbered injeksjonsplaten med en plast mold som beskrevet i Westerfield 23.
    6. Overfør larvene til injeksjon plate og line dem opp ved hjelp av en fin pensel. Orient og injisere larvene som beskrevet i avsnitt 3.3.1.
    7. For vurdering av sebrafisk overlevelse, overføring infiserte larver individuelt i 24-brønns plater i 1 ml E2 / brønn og inkubere ved 28 ° C. Overvåk infiserte larver daglig de neste 2-5 dagene og tomten overlevelse over tid (Figur 3B).
  5. Plating Sebrafisk Larver for Bakteriell Kvantifisering
    MERK: Arbeid under en steril hette for å unngå forurensning.
    1. For å evaluere antallet bakterier injisert inn i fisken (ved tid 0 timer etter infeksjon) og for bakteriell kvantifisering ved ønskede tidspunkter, ofre sebrafisk larver med en overdose av Tricaine (200-500 mg / l). Plasser enkelte larver i 1,5 ml polypropylene mikrosentrifugerør med 200 mL av 0,1% oktylfenol etylenoksyd kondensat 1x PBS og homogenisere mekanisk ved hjelp av en støter.
      MERK: For å bekrefte bakteriemengde i injeksjonsvolum, pumpe en lik dose i en steril 1x PBS slipp og porsjon det ut.
    2. Lag en seriell fortynning av sebrafisk larver homogenates i sterilt vann og plate på lysogeny kjøttkraft (LB) agar plater. Larver kan være belagt alternativt på Congo Red TCS plater for å diskriminere mellom Shigella å ha opprettholdt den virulente plasmid eller ikke.
      MERK: Plate 3 eller flere noninfected fisk som en kontroll for å sjekke status på sebrafisk larver brukes for infeksjon.
    3. Etter over natten inkubering av platene ved 37 ° C, telle bakteriekolonier. Som vist i figur 3C, representerer anvendelse av en log skala.
      MERK: Bakteriell belastningen under infeksjon av sebrafisk larver kan også visualiseres ved hjelp fluorescensmerkede Shigella og mikroskopisk imaging som beskrevet i punkt 3.7 eller 3.8 (Figur 3D).
  6. Sebrafisk Larver Immunostaining
    1. På ønskede tidspunkter, ofre larvene ved hjelp av en overdose av Tricaine. Samle fisken i 1,5 ml polypropylen mikrosentrifugerør (10 til 20 larver / tube).
    2. Fest larver ved anvendelse av 4% paraformaldehyd med 0,4% oktylfenol etylenoksyd kondensat i 1x PBS og inkuberes i en orbital omrører (for å unngå larve clustering) i 2 timer (ved romtemperatur), eller over natten (4 ° C).
      MERK: Elektronmikros kan brukes for ultra analyser av sebrafisk infiserte larver. I dette tilfellet bør bedøves embryoer være fast og behandlet i henhold til Mostowy et al 19.
    3. Vask 3 x i 1 x PBS 0,4% oktylfenol etylenoksyd kondensat i 5 min, og deretter blokkeres i blokkeringsløsning (10% kalvefosterserum, 1% DMSO, 0,1% polyoxyethylensorbitan-monolaurat i 1 x PBS) i 1 time ved romtemperatur.
    4. Dilutt det primære antistoff i blokkeringsløsning. Legg larver til utvannet primære antistoff og inkuber natten ved 4 ° C i en orbital agitator. Bruk primære antistoffer, som beskrevet ovenfor i avsnitt 1.4.3.
    5. Vask 4x larvene i 15 minutter i 0,1% polyoxyethylensorbitan-monolaurat 1 x PBS i romtemperatur.
    6. Fortynne den sekundære antistoff i blokkering løsning. Legg larver til utvannet sekundært antistoff og inkuberes over natten ved 4 ° C i en orbital agitator. Bruk samme sekundære antistoffer og phalloidin som beskrevet i avsnitt 1.4.4.
    7. Vask 4x i 15 minutter i 0,1% polyoxyethylensorbitan-monolaurat 1 x PBS i romtemperatur. For farging av vertscellekjerner legge DAPI (150 nM endelig konsentrasjon) i løpet av den første av disse 15 min vasker.
    8. For bevaring av fluorescensmerket merkede larver, inkuber dem progressivt i en glycerol-gradient på 15, 30, 60, og 80% fortynnet i 1 x PBS og 0,1% polyoxyethylensorbitan-monolaurat i 2 timer (ved værelses hodetature) for å over natten (4 ° C).
      MERK: Stained larver kan lagres i lange perioder av gangen i 80% glycerol ved 4 ° C (f.eks, 4 måneder.).
  7. Mikroskopisk Imaging av Fast Sebrafisk Larver
    1. Overfør fast glyserol innebygd larver til en liten dråpe av 80% glyserol i en 35 mm petriskål (for stereomikroskopi) eller full glassbunn fatet (for confocal miscopy).
    2. Ta Z-stabel bildeserie av infiserte larver og behandle bildene etter behov.
    3. Bruk en epifluorescence eller konfokal mikroskop og en 10X eller 20X objektiv for hele organismen imaging. Deretter bruker du en konfokal mikroskop og en 40X, 63X eller 100X mål å visualisere individuelle celler og rekruttering av autofagi og cytoskeleton markører til individuelle bakterier in vivo 19 (Tall 4A og 4B).
      MERK: Infect fisken i halemuskelen og montere i glyserol flate langs undersiden av glasset rett bunn for å muliggjøre easy fokus.
  8. Leve Mikroskopisk Imaging av infisert Sebrafisk Larver
    MERK: Larvene er optisk tilgjengelig, og dermed in vivo autophagosomes kan visualiseres ved hjelp av GFP-LC3 sebrafisk transgen linje 25. Infisere sebrafisk larver som beskrevet i kapittel 3.3 og montere som beskrevet i denne delen.
    1. Forbered lav-smelting 1% agarose (LMA) i E2 og la den avkjøles til 35-37 ° C for å unngå larver skade / drepe. Distribuere dråper LMA i en 35 mm petriskål (for stereomikroskopi) eller full glassbunn fatet (for konfokalmikroskopi).
    2. Overføring bedøvet sebrafisk larver individuelt (med så lite vann som mulig) til LMA dråper. Orient larver til ønsket posisjon ved hjelp av en pensel og vente på agarose å stivne.
    3. Dekke hele skåloverflaten med LMA og overlegg med E2 inneholdende 200 ug / ml Tricaine å unngå fremstillingen fra å tørke ut og for å tillate fisken å utveksle oksygen fra vannet.
    4. Bruk en epifluorescence eller konfokal mikroskop og en 10X eller 20X objektiv for å avbilde hele sebrafisk larver. Bruk en konfokal mikroskop og en 40X, 63X eller 100X mål å visualisere bakterie authopagosomes (dvs. GFP-LC3 + ve vacuoles rundt Shigella) in vivo.
    5. Ta en Z-stabel av infiserte larver over tid (f.eks. Hver 2 minutter i løpet av flere timer) for å visualisere autophagosomes, og deres dynamikk, i sann tid.

4. Funksjonsanalyse av Autofagi og Cytoskjelettet In Vivo

MERK: Virkningen av farmakologiske og genetiske forstyrrelser av autophagy på i løpet av infeksjonen kan overvåkes ved hel-dyret nivå, og på nivået av den enkelte celle.

  1. Autofagi Manipulering av Morpholino Injection
    1. Rekonstituer morfolino oligonukleotider i sterilt vann til en stamløsning av 1 mM ved oppvarming ved 65 ° C i 10 min. Butikkenved romtemperatur.
      MERK: morfolinogruppe oligonukleotid injeksjoner må utføres i 1-4 cellestadiet embryoer.
    2. Forbered morfolino oligonukleotid arbeidsløsning med steril 0,1% fenolrødt i Dulbeccos fosfatbufret saltvann. Laste nålen som beskrevet i avsnitt 3.4.2., Kan morfolino- oligonukleotid injeksjonsvolum kalibreres som beskrevet i avsnitt 3.4.3.
      MERK: fenolrødt vil bidra til å visualisere volumet injiseres.
    3. Forbered et embryo-posisjonering kammer (ie., Et objektglass limt med cyanoacrylate på en 10 cm petriskål lokk med kanter som vender nålen delvis fjernet). Overfør 1-4 cellestadiet embryoer til kammeret med en liten mengde vann og justere dem med en fin pensel.
    4. Penetrere chorion og plomme jevnt. Når du er inne, trykk på pedalen for å injisere den ønskede volum av morpholino oligonukleotid løsning.
      MERK: Minimer volumet av injeksjon til 0,5 til 2 nl; volumer høyere than 5 nl kan forårsake utviklingsmessige defekter og øke dødeligheten egg.
    5. Etter mikroinjeksjon, rene embryoer (ved bleking som beskrevet i kapittel 3.2) og inkuberes dem i en petriskål med E2 ved 28 ° C.
    6. Infisere 72 timer post befruktning kontroll (dvs. sebrafisk larver injisert med kontroll morpholino oligonukleotid) eller P62 morphants (ie., Sebrafisk larver injisert med p62 morpholino oligonukleotid) med Shigella som beskrevet i kapittel 3.4. Vurdere overlevelse og bakteriemengden for de neste 2-5 dager som beskrevet i kapittel 3.5. Bilde fast sebrafisk larver som beskrevet i punkt 3.7 og uthevet i figur 4C, eller bilde levende sebrafisk larver som beskrevet i kapittel 3.8.
      MERK: Den effektive morfolinogruppe oligonukleotid dose kan vurderes basert på dens effektivitet til å hemme transkripsjon spleising eller protein oversettelse (se diskusjon).

Representative Results

Ved infeksjon av vevskultur-celler in vitro, S. flexneri kan flykte fra phagosome og invadere cytosol. I cytosol, kan vertsceller hindre aktin-baserte bevegelighet av Shigella ved compartmentalizing bakterier inne septin bur (figur 1A). Bakterier innesperret etter septin bur kan også merkes ved autofagi markører p62 (figur 1B) og LC3 (figur 1C). Disse observasjonene markere en ny mekanisme av verten forsvar som begrenser spredning av invasive patogener, og også avsløre nye koblinger mellom autofagi og cytoskjelettet. Påfallende, uttømming av autofagi markører reduserer septin caging av bakterier (figur 2A), og arbeidet har også vist at nedbryting av septin caging reduserer rekruttering av autofagi markører 8 betydelig. Således, i det minste i tilfelle av Shigella, septin burenheten og autophagosome formation kan sees på som gjensidig avhengige prosesser. Andre cellulære krav til compartmentalization av Shigella etter septin bur inkluderer aktin polymerisasjon og actomyosin aktivitet (figur 2B).

Det er ingen naturlig musemodell av shigellose, og etterforskning av Shigella patogenesen, septin biologi og bakteriell autofagi in vivo kan dra nytte av en ny dyremodell for infeksjon, sebrafisk larver 19. Det er mulig å infisere sebrafisk larver ved injisering av bakterier i forskjellige anatomiske steder som caudal intravenøse injeksjoner til redningsforsøk, og halemuskel injeksjoner for in vivo-mikroskopi (figur 3A). Avhengig av dosen, S. flexneri injisert i sebrafisk larver kan enten bli slettet innen 48 timer etter infeksjon, eller kan føre til en progressiv og til slutt dødelig infeksjon (Tall 3B - 3D). Shigella virulens factors er uttrykt ved 28 ° C, den optimale veksttemperatur for sebrafisk, og sebrafisk infeksjon av Shigella er strengt avhengig av dens type III sekresjon system (T3SS) 19, en viktig virulens determinant i human sykdom. Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at sebrafisk larve representerer en verdifull ny vert for in vivo analyse av Shigella-infeksjon.

Den optiske tilgjengelighet av sebrafisk larver muliggjør visualisering av septin caging in vivo (figur 4A), en prestasjon som aldri før har blitt oppnådd ved hjelp av pattedyrmodeller. For å komplettere bevis for at septin bur lure bakterier målrettet til autofagi in vivo, kan man smitte transgen sebrafisk larver uttrykker GFP-LC3 og observere autofagi markør rekruttering til Shigella (Figur 4B). For ultrastrucutral analyse av Shigella autophagosomes in vivo, electron mikroskopi kan anvendes for å vise tydelig den cytosoliske lagring av bakterier ved dobbel membran vakuoler 19. Autofagi blir sett på som en viktig del av celle-autonome immunitet og en viktig forsvarsmekanisme mot intracytosolic bakterier 14-16. Å karakter autofagi funksjon in vivo, kan p62 morfolino- behandlet sebrafisk larver brukes. I motsetning til kjernen autofagi maskiner [f.eks., De 36 autofagi relaterte proteiner (ATGs) 26], er P62 ikke avgjørende for virveldyr utvikling 27 og dermed sebrafisk larver kan utvikle seg normalt før infeksjon. Påfallende, p62-utarmet larver inokulert med S. flexneri resultat i betydelig økt dødelighet og økt bakteriemengden 19. Etter avtale med in vitro arbeid viser at septin bur montering er avhengige av hverandre med autophagosome dannelse 7,8, er septin rekruttering til Shigella klart redusert i p62-utarmet larver (

Figur 1
Figur 1. septin bur in vitro. (A) HeLa celler ble infisert med S. flexneri for 4 timer 40 min, fast, merket med antistoffer mot SEPT9 og phalloidin, og avbildes ved confocal microcopy. Scale bar, en mikrometer. (B) HeLa celler ble infisert med S. flexneri i 4 timer 40 min, fast, merket med antistoffer mot p62 og SEPT2, og avbildes av fluorescerende lys mikroskopi. Scale bar, en mikrometer. (C) HeLa celler ble transfektert med GFP-ATG8 / LC3, infisert med S. flexneri i 4 timer 40 min, fast, merket med antistoffer mot SEPT2, og avbildes ved lysrør microscopy. Scale bar, en mikrometer. Disse tallene har blitt forandret fra Mostowy et al 7.

Figur 2
Figur 2. Cellular krav til Shigella -septin bur dannelse. (A) HeLa celler ble behandlet med kontroll (CTRL), P62, ATG5, ATG6 eller ATG7 siRNA. Hel-cellelysater av siRNA-behandlede celler ble immunoblotted for GAPDH, P62, ATG5, ATG6, eller ATG7 å vise effektiviteten av siRNA mangel (øverst). siRNA-behandlede celler ble infisert med S. flexneri i 4 timer 40 min, faste, og merket for kvantitativ mikroskopi. Grafer (nederst) representerer gjennomsnittet% ± SEM av Shigella inne SEPT2 bur fra n ≥3 eksperimenter per behandling. (B) HeLa celler ble infisert med S. flexneri, behandlet med DMSO, cytokalasin D (CytD), latrunculin B (LatB), nocodazole (Noco), eller Blebbistatin (bleb) og etter 4 timer 40 min ble fikset og merket for kvantitativ mikroskopi. Grafer representerer gjennomsnittet% ± SEM av Shigella inne SEPT2 bur fra to uavhengige eksperimenter per behandling. Disse tallene har blitt forandret fra Mostowy et al 7.

Figur 3
Figur 3. sebrafisk modell av Shigella infeksjon. (A) bilder for å illustrere orientering av sebrafisk larve under stereomikroskop. (Venstre panel) Sebrafisk larver 72 timer post befruktning ble plassert lateralt i injeksjon plate med sin ryggsiden mot kanylen. (Middle panel) blodet infeksjon ble utført av injecting bakterier (rød løsning) i halevenen, posterior til urogenitale åpning. (Høyre panel) Infeksjon i halen muskelen ble utført ved å injisere bakterier (rød løsning) over et somitt. (B) Overlevelseskurver av 72 timer post befruktning larver injisert med ulike doser av S. flexneri og inkubert ved 28 ° C i 48 timer etter infeksjon. Den effektive inokulum ble klassifisert som lav (<10 CFU 3, åpne sirkler), middels (~ 4 x 10 CFU 3, åpne trekanter) eller høy (~ 10 4 CFU, åpne firkanter). Gjennomsnittlig% ± SEM (vannrette streker) fra n ≥3 eksperimenter per inoculum klasse. (C) Telling av levende bakterier i homogenates fra enkelte larver på ulike tider etter infeksjon målt ved belegging på LB. Note, bare larver har overlevd infeksjonen er inkludert i opptellingen analyse. Gjennomsnitt ± SEM (vannrette streker) også vist. (D) Fordeling av GFP- Shigella bestemmes avdirekte avbildning ved hjelp av en fluorescerende stereo på ulike tidspunkter etter infeksjon ved hjelp av en lav, middels eller høy dose inoculum (caudal intravenøse injeksjoner). Overlegg for overføring image (grå) og GFP fluorescens (grønn) (B) -. (D) Disse tallene har blitt forandret fra Mostowy et al 19.

Figur 4
Figur 4. cellebiologi Shigella-infeksjon in vivo. (A) Sebrafisk larver ble infisert i halemuskelen med GFP- Shigella (lav dose) i 24 timer, løst, merket med antistoffer mot SEPT7 (rød) og GFP (grønt ), og avbildes ved konfokal mikroskopi. Scale bar, ble fem mikrometer. (B) GFP-LC3 sebrafisk larver infisert med mCherry- Shigella (medium dose) for4 timer, fast, merket med antistoffer mot mCherry (rød) og til GFP (grønt), og avbildes ved konfokalmikroskopi. . Skala bar, 1,5 mikrometer (C) Sebrafisk larver behandlet med enten kontroll (Ctrl; venstre bildet) eller p62 (høyre bilde) morpholinos var infisert med GFP- Shigella for 4 timers (medium dose), fast, merket med antistoffer mot SEPT7 ( rød) og til GFP (grønt), og avbildes ved konfokalmikroskopi. Piler fremheve noen eksempler på Shigella fanget i septin bur (Ctrl) eller ikke (P62 utarmet) en 4 timers etter infeksjon. Scale bar, 5 mikrometer. Disse tallene har blitt forandret fra Mostowy et al 19.

Discussion

Ved overvåkning autophagy og cytoskjelettet in vitro ved hjelp av vevskultur-celler, kan de protokoller som er beskrevet i avsnitt 1 og 2 anvendes på et bredt utvalg av vev kultur celletyper. Videre, for å følge autofagi (f.eks ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) og cytoskjelettet (f.eks., Aktin haler, septin bur) dynamikk i sanntid under Shigella-infeksjon ved bruk av levende bilder kan vevskulturceller være forbigående transfektert ved hjelp GFP-, RFP- eller CFP-merkede konstruksjoner som tidligere beskrevet 7,8. Å øke andelen av celler infisert av Shigella (dvs. vanligvis ønskelig for sanntids analyse med tanke på at Shigella kan invadere 5-30% av HeLa celler ved 100:. En MOI), direkte legge 400 mL av Shigella (OD 600 = 0,3 -0,6) til cellene i 2 ml MEM (serum-sultet) og vent i minst 1,5 timer etter infeksjon for tilstrekkelig bakteriell oppføring, flykte fra phagosome, replikering, autophagy anerkjennelse og septin caging. Alternativt kan man bruke Shigella M90T AfaI stamme som uttrykker adhesin AfaE og har mye høyere invasjons egenskaper i epitel-celler i forhold til M90T stamme 28. Av notatet, den M90T AfaI belastningen har ennå ikke blitt testet in vivo ved hjelp av sebrafisk. Plater av Shigella kolonier kan holdes ved 4 ° C i 2-3 dager og brukt i flere eksperimenter. Imidlertid, over tid, kolonier av Shigella som har mistet virulens-plasmidet kan også absorbere Congo rød og synes å ha beholdt sin virulens-plasmidet. Av denne grunn anbefaler vi å bruke ferske bakterielle aksjer når det er mulig.

Når overvåke cellebiologi for infeksjon in vivo, protokoller beskrevet i kapittel 3 og 4 bruk villtype AB linje sebrafisk. For å overvåke Shigella -leukocyte interaksjoner, kan transgene sebrafisk linjer brukes, f.eks, MPX: GFP eller lyz: DsRed til visuellize nøytrofile 19,29,30 eller MPEG1: mcherry å visualisere makrofager 19,31. For å visualisere autofagi in vivo, kan brukes GFP-LC3 sebrafisk transgen linje 19,24 som beskrevet i kapittel 3.8.

For å forurolige autophagy in vivo, har den effektive morfolino oligonukleotid dose som skal vurderes eksperimentelt basert på dets effektivitet for å hemme transkripsjon spleising eller protein oversettelse. Det anbefales å utføre en titrering eksperiment og for å bekrefte uttømming av RT-PCR (for skjøte morpholino oligonukleotid) eller ved SDS-PAGE (for translasjonell morpholino oligonukleotid) 32. RNA isolert fra sebrafisk embryo eller larver kan utføres ved hjelp guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjon. For å utvinne protein fra sebrafisk larver (8 til 15 larver / rør), mekanisk homogenisere ved hjelp av en støter i 200 ul lyseringsbuffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylfenol etylenoksyd kondensate, og proteasehemmer). Sentrifugerør ved 19.000 xg ved 4 ° C i 15 min og Overfør supernatanten til et nytt rør. Legg Laemmli buffer og oppvarming av prøven ved 95 ° C i 15 min. Lysater kan lagres ved -80 ° C inntil det er nødvendig, og kan evalueres ved Western-blotting som beskrevet i seksjon 2.3.

Sebrafisk er en utmerket modell for in vivo medikament søknad. Analyse ved hjelp morfolino- oligonukleotider kan kompletteres med etablerte medikamenter for å manipulere autofagi (f.eks rapamycin og bafilomycin). Uinfiserte og / eller infiserte larver kan behandles med rapamycin (1,5 pM) eller bafilomycin (80 nM) fortynnet i E2 og autophagic fluks kan evalueres ved Western-blotting som beskrevet i 25,33. Konsekvensen av autofagi manipulasjon på utfallet av infeksjonen og overlevelse av infiserte larver kan evalueres som beskrevet i kapittel 3.5.

I tillegg til å studere vertscelledeterminanter, in vitro og in vivo-protokoller kan brukes til å vurdere bakterielle determinants kreves for autofagi anerkjennelse, ved hjelp av bakterielle mutante stammer som er ulikt anerkjent av autofagi, f.eks., Shigella ΔicsA (den Shigella protein ICSA rekrutterer N-WASP og deretter Arp2 / 3 for aktin hale og septin bur formasjon; i sitt fravær det kan være noen aktin haler, ingen septin bur) og ShigellaΔicsB (Shigella unngår autophagic respons via bakteriell effektor protein IcsB, som hindrer rekruttering av autofagi maskiner til ICSA, i sitt fravær det kan være flere septin bur, mer autofagi) 7,8.

Shigella er ikke en naturlig patogen av sebrafisk og vokser optimalt ved 37 ° C. Imidlertid har arbeidet vist at virulens faktorer som kreves for Shigella invasjon, flykte fra phagocytic vakuole og replikering i cytosol kan uttrykkes og er funksjonelle i sebrafisk larver ved 28 ° C 19. 28 ° C er den mest brukte temperatur for sebrafisk oppdrett og standard temperatur for å sikre normal sebrafisk utvikling 23. Påfallende at de viktigste sykdomsfremkallende hendelser som fører til shigellose hos mennesker (dvs. makrofag celledød, invasjon og multiplikasjon innen epitelceller, celle-til-celle spredning, inflammatorisk ødeleggelse av verts epitel) reproduseres for sebrafisk-modellen av Shigella-infeksjon 19.

Autophagy og cytoskjelett gener er ubikvitært uttrykt, og har et bredt spekter av biologiske funksjoner. Muse studier har vist at utstansing av essensiell autophagy 26 eller septin gener 5 er i sin spede dødelig, og det er sannsynlig at noen av disse genene vil også være avgjørende for sebrafisk utvikling (selv om dette problem kan reduseres ved at sebrafisk har multipleParaloge gener 33). I så fall er det flere alternativer for å overvinne dette problemet, inkludert (i) bruk av farmakologiske reagenser for å regulere autophagy og cytoskjelettet, (ii) morpholinos kan titreres ned, kan (iii) utstansing av gener bli konstruert for bare bestemt celle typer, og / eller (iv) gener involvert i autophagic erkjennelse som ikke er essensielle for utvikling av dyr (f.eks., p62) kan være rettet.

Mens sebrafisk er et ideelt modellsystem for å undersøke autofagi og cytoskjelettet under Shigella-infeksjon, er molekylære verktøy for tiden mangler. Feltet må generere nye verktøy og driv celle spesifikk ekspresjon av proteiner av interesse. Å slå ned uttrykk for autofagi / cytoskjelett gener, er nye morfolino- sekvenser nødvendig, og nye metoder for genomet teknikk (for eksempel, TALEN, CRISPR / Cas9) kan også brukes. I mellomtiden, flere verktøy som tidligere er generert for menneske eller musestudierkan like arbeide for sebrafisk.

De intracellulære bakterier S. flexneri har dukket opp som en eksepsjonell modellorganisme for å ta opp sentrale problemstillinger i biologi, inkludert muligheten av bakterier for å bli gjenkjent av immunsystemet 1,2. Den vertscelle anvender septins å begrense bevegeligheten av S. flexneri og målrette dem til autofagi, en kritisk komponent i celle autonom immunitet 7,8. Disse observasjonene tyder på en ny molekylær rammeverk for å studere autofagi og dens evne til å degradere cytosoliske bakterier. Et stort problem nå er å fullt dechiffrere de underliggende molekylære og cellulære hendelser, og for å validere disse hendelsene som er analysert in vitro under bakteriell infeksjon in vivo ved hjelp av relevante dyremodeller. For å oppnå dette, har sebrafisk er etablert som en verdifull ny vert for analyse av S. flexneri infeksjon 19. Interaksjoner mellom bakterier og vertsceller kan avbildes med høy oppløsning, ogsebrafisk-modellen skulle vise seg nyttig for å forstå cellebiologi av Shigella-infeksjon in vivo. Sebrafisk larver kan brukes til å undersøke hvilken rolle bakteriell autofagi i host forsvar, og arbeidet har vist at at endringen av autofagi kan påvirke verts overlevelse som svar på Shigella-infeksjon 19.

Observasjonene generert fra studie av Shigella, septin caging og autofagi in vitro ved hjelp av vev kultur celler og in vivo ved hjelp av sebrafisk larver kan gi grunnleggende fremskritt i forståelsen av vertsforsvar. De kunne også foreslå utvikling av nye strategier for å bekjempe smittsomme sykdommer.

En kritisk Målet med denne rapporten er å gi mening av de molekylære og cellulære hendelser analysert in vitro (dvs. autofagi, aktin haler, septin caging) under bakteriell infeksjon in vivo i sammenheng med en entire organisme, bruker sebrafisk larver. Hvis ikke er kjent med sebrafisk biologi og håndtering, kan man referere til i dybden protokoller for riktig sebrafisk oppdrett 23 og in vivo analyse av sebrafisk infeksjon 19,35.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Arbeidet i SM laboratoriet er støttet av en Wellcome Trust Forskning Karriereutvikling Fellowship [WT097411MA].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4 (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4 (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. , (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. , 4-5.2, (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).

Tags

Infeksjon ATG8 / LC3 autofagi cytoskjelettet HeLa celler P62 septin, Sebrafisk
Ved å bruke<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Å studere autofagi-Cytoskjelettet Interactions
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon,… More

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter