Summary
病原体の普及に対抗するために、宿主細胞には、細菌を区分し、オートファジーを誘導するそれらの細胞骨格を再編成する。組織培養細胞のシゲラ感染を使用して、このプロセスの基礎となるホストおよび病原決定因子が同定され、特徴付けられる。 シゲラ感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、発見された分子およびメカニズムの役割は、in vivoで調べた。
Abstract
赤痢菌赤痢菌は、細胞質ゾルに到達するためにファゴソームから脱出し、その運動性と普及を促進するためのホストアクチン細胞骨格を重合させることができる細胞内の病原体である。新しい仕事は、アクチンベースの運動性に関与するタンパク質はまた、オートファジーは細胞自律的免疫に重要な細胞内分解プロセスにリンクされていることが示されている。驚くべきことに、宿主細胞は、S.のアクチンに基づく運動性を防止することができる細菌の内部の「セプチンケージ」を区画化し、オートファジーにそれらを標的とすることによってフレクスナー 。これらの観察は、セプチンのより完全な理解は、糸状GTP結合タンパク質のファミリーは、オートファジーのプロセスに新たな洞察を提供するであろうことを示している。このレポートは、Sに起因するオートファジー細胞骨格の相互作用を監視するためのプロトコルを記述フレクスナーインビトロ組織培養細胞を用いてin vivoでゼブラフィッシュの幼生を用いた。これらのプロトコルは、細胞内mechanisの調査を可能にする分子の細胞、および生物全体レベルでの細菌の拡散を制御するミリ。
Introduction
赤痢菌赤痢 、グラム陰性浸潤性腸病原性細菌は、細胞質ゾルへのファゴソームから脱出し、細胞質ゾルの免疫応答を回避し、細胞内および細胞間移行1,2を促進するために、ホストアクチン細胞骨格を重合させることができる。 試験管 3,4 におけるアクチンベースの運動性の理解にもかかわらず、 生体内で細菌の普及を制限するメカニズムは完全に定義されていない。これは自然免疫と宿主防御のより完全な理解のために重要である。
セプチン、後生動物の中で、タンパク質の高度に保存されたファミリーは、ヘテロオリゴマー複合体に集合し、細胞膜と細胞骨格5,6関連付ける無極性フィラメントを形成するタンパク質を-結合グアノシン三リン酸（GTP）である。最近の研究は、感染した宿主細胞はautophに標的細菌を区画化することによって、シゲラアクチンベースの運動性を抑制することができることを発見したAGY内部の「セプチンケージ」、アクチンベースの運動性7,8に対抗する最初の細胞メカニズムを明らかに。調査の広いオープンフィールドは現在、「セプチン生物学と感染症」にある。多様な病原体によって誘導されたセプチンアセンブリ（ 例えば 、 リステリア·モノサイトゲネス7,9,10-、マイコバクテリウムマリナム7,8、カンジダ·アルビカンス 11）は 、宿主防御5,12における重要な課題として浮上することがあります。
オートファジー、高度に保存された細胞内分解プロセスは、原因リソソーム13,14にサイトゾル細菌を送達する能力を細胞自律的免疫の重要な構成要素と見なされる。しかし、細菌の複製を制限したり、促進するための生体内での細菌のオートファジーの役割は不十分15,16を理解したままになります。それは、光学的にアクセス可能であるため、ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） は、感染症の研究のための脊椎動物のモデルとして登場しました幼虫の段階で自然免疫系はすでに17,18機能しているとき。最近の研究は、Sにゼブラフィッシュの幼虫の感受性を特徴としている赤痢菌 、細菌、オートファジー15パラダイム、およびin vivo 19 に抗菌治療のためのオートファジーの操作を研究するために赤痢菌 -zebrafish感染モデルを使用してきました。
このレポートでは、新しいツールやSを研究するためのアッセイを提供するオートファジーと細胞骨格との相互作用フレクスナー 。最初のステップでは、オートファジー細胞骨格相互作用をモニターするためのプロトコルは、ヒト上皮細胞株HeLaのシゲラ感染を用いて説明する。 インビトロでのシゲラ感染プロセスに対するオートファジー細胞骨格相互作用の役割を評価するために、自食作用および細胞骨格成分（siRNAまたは薬理学的試薬を使用して）操作する方法が提供される。新しい仕事は、 赤痢菌感染 oを使用することによってそれを示しているゼブラフィッシュの幼生fは、類似のアッセイは、 インビボでの感染の細胞生物学を研究するために適用することができる。ゼブラフィッシュの幼生を準備し、感染させるプロトコルは詳述され、そしてインビボでシゲラ感染に対する宿主応答を評価するために、宿主の生存および感染した幼虫の細菌負荷を決定するためのプロトコルが提供される。モルフォリノ（1-4細胞期の胚に注入）、オリゴヌクレオチドまたは薬理学的試薬を用いて赤痢にセプチンとオートファジーのマーカーの動員をモニターするための方法（固定またはゼブラフィッシュ幼生の生活のどちらかを使用して）およびin vivoでのこれらのプロセスの役割をテストするための方法[（ゼブラフィッシュ風呂の水に直接添加する）]についても説明します。この作業プログラムは、サイトゾル宿主応答による感染の制御に必要なメカニズムへの洞察を提供することが期待される。
Protocol
1組織培養細胞を用いてインビトロでオートファジーと細胞骨格の監視
- Sを準備するフレクスナー
- プレートS.コンゴレッドトリプシンカゼイン大豆（TCS）寒天プレート上へのCグリセロールストック-80℃から赤痢菌 M90T（野生型）。 37℃で一晩インキュベートする。同じプレートは、いくつかの実験のために使用することができる。
- 個別のコロニーを採取し、37℃で一晩シェーカーで8ミリリットルTCS培地中で成長する。
注：コンゴ - レッド結合は、病原性プラスミドが保持されていることを示しています。 - 指数関数的な成長のための細菌を継代培養するために、80分の1希釈で一晩細菌培養新鮮TCSに接種し、= 0.3-0.6 600に OD 37℃でシェーカー内で成長する。
- 5分間千×gで細菌のサブカルチャーをスピン。 5分間千×gで、MEMと遠心でペレットを洗浄。 = 0.3-0.6 600に ODするMEM中でペレットを再構成する。
- HeLa細胞のCeを準備感染のLLS
- 「完全培地」、 すなわち HeLa細胞を成長させ、MEMプラスL-アラニル-L-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸溶液、及び10％ウシ胎児血清を補充した。
- 実験を開始する前に、6ウェルプレートで24〜1.5×10 5個の細胞または48時間プレート。ガラス顕微鏡用6ウェルプレート中のカバースリップ、または35mmのガラスボトムディッシュ上でプレート上のプレートは、ライブイメージングのために作製した。
注：（。 例えば、アクチンテイル、セプチンケージ）、オートファジーに従うために（ 例えば 、ATG8 / LC3 +はオートファゴソームをVE）と細胞骨格のダイナミクスをリアルタイムでライブイメージングを用いた赤痢菌感染の間、組織培養細胞は一過性にGFP-を使用してトランスフェクションすることができる、 RFP-またはCFP-タグ作成物（説明を参照）。
- 感染
- 100で細胞を感染させる： 赤痢菌 （OD 600 = 0.3から0.6）の感染の1多重度（MOI）MEMで希釈した。直接6-WにプレーティングしたHeLa細胞に追加2ミリリットルのMEM（血清飢餓状態）での感染前に48時間（1.2節で説明したように） - エルプレート24。
- 室温で10分間、700×gで細胞を遠心細菌および宿主細胞に細菌付着を最大にする。遠心分離後、37℃、5％CO 2で30分間インキュベートし、感染を進行させる。
- 実験に応じて1〜4時間（50μgの/ mlの、細胞外細菌を除去するために）新鮮なMEMで二度感染した細胞を洗浄し、完全培地を含むゲンタマイシンをインキュベートする。
- 顕微鏡用の感染HeLa細胞を固定およびラベリング
- 1×PBSで2回感染した細胞を洗浄し、室温で1×PBS中の4％パラホルムアルデヒドで15分間固定してください。パラホルムアルデヒドを除去するために、洗浄細胞を1×PBSで2倍。
- 室温で10分間、50mMの塩化アンモニウム中で固定した細胞をインキュベートする。 1×PBSで1回洗浄し、室温tにおける0.1％のオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物で4分間、細胞を透過emperature。
注：そのようなサポニンまたはメタノールなどの透過処理のためのエチレンオキシド縮合物をオクチルフェノールする代替方法は、細胞構造20の別の保存のために適用することができる。 - で（1×PBS中で細胞を洗浄し、30分間（ 例えば 、P62 / SQSTM1）またはセプチン細胞骨格（SEPT2、SEPT6、SEPT7、SEPT9、およびSEPT11はHeLa細胞で発現している）、オートファジーの重要なコンポーネントに対する一次抗体を用いた湿式チャンバー内でインキュベート4ºCで一晩室温）（）。
- （4℃で）一晩（室温で）30分間、ファロイジンで繊維状アクチン（F-アクチン）を1×PBSで2回細胞を洗浄し、二次抗体を用いた湿式チャンバー内でインキュベートし、ラベルを付けます。宿主の染色のために細胞核は4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を加える。
- 1×PBS中で細胞を洗浄し、封入剤を使用してスライドにカバーガラスをマウントします。
- 感染HeLa細胞の顕微鏡イメージング
- 画像へのinfected細胞はDAPIで標識された赤痢菌を特定するために、落射蛍光または共焦点顕微鏡および63Xまたは100X対物レンズを使用しています。
注： 図1Aに示すように- 1C、セプチンケージ様構造リングとして可視化することができる、直径〜0.6μmで、7,8アクチンを重合するとオートファジーのマーカーを募集し（ 例えば 、P62およびLC3）の細胞質ゾルの細菌を囲む。これとは対照的に、アクチンテイルを重合する細菌はセプチンケージによって区分されず、オートファジー7,8をターゲットにされることはありません。 - エピ蛍光または共焦点顕微鏡および63Xまたは100Xの対物レンズを使用して、顕微鏡視野当たりの細胞内細菌の数を定量化する。またセプチンケージに閉じ込められた細菌数を定量化し、オートファジーをターゲットに、またはアクチンテイルを重合し、オートファジーをエスケープ。
- セプチンケージまたは重合するアクチンテイルに捕捉された細菌の割合を決定するために、infeのZスタック画像列を取るCTED細胞、プロセスのイメージと、少なくとも3つの独立した実験から、実験あたり少なくとも500〜1,000細菌を数える。
- 画像へのinfected細胞はDAPIで標識された赤痢菌を特定するために、落射蛍光または共焦点顕微鏡および63Xまたは100X対物レンズを使用しています。
オートファジーとインビトロで細胞骨格の2機能解析
NOTE：遺伝的および薬理学的アプローチの両方は、感染組織培養細胞中にオートファジーを摂動するために使用することができ、かつ、感染の経過におけるこれらの治療の影響を監視することができる。
- siRNA媒介サイレン
- プレートの完全培地中、6ウェルプレート中のカバーガラス上に0.8×10 5 HeLa細胞。
- オートファジーおよび/または細胞骨格マーカーに対するsiRNAで脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して、次の日にトランスフェクト。
- 1.3節で説明したように、インキュベーションの所望の期間が経過した後、 赤痢菌で細胞を感染させる。
- 修正して、1.4節で説明したように細胞を標識する。
- 薬理学的処置
たとえば 、微小管を脱重合すること、アクチン細胞骨格用サイトカラシンDまたはラトランキュリンBを解重合させるアクトミオシンアクティビティ用ブレビスタチンをブロックする、またはセプチン組立用forchlorfeneuronを破壊するために、ノコダゾールを使用します。オートファジーは、ラパマイシンを使用することによって刺激されまたはバフィロ使用することによってブロックすることができる。- 1.3節で説明し、細菌が細胞に入り、細胞質ゾルへのファゴソームから脱出するための十分な時間を許す限り赤痢菌感染時に細胞骨格を操作するには、まず（ 例えば 、> 1.5時間後に感染症） 赤痢菌で細胞を感染させる。
- 5 M（サイトカラシンD、ラトランキュリンB、ノコダゾール）、20 M（forchlorfeneuron）または50 M（ブレビスタチン）の最終濃度までMEMの[ジメチルスルホキシド（DMSO）中に懸濁原液]ストック溶液からの薬物を希釈し、そして細胞を37℃で30分間処理する。薬物の総量のDMSO（容量/ Dラグ混合物）は、細胞のプレート/バイアル当たりに添加培地2ml当たり1-5液（原液に応じて）である。ネガティブコントロールとして、MEM中に希釈し、DMSOの同様の用量で細胞を処理する。
- 修正して、1.4節で説明したように細胞を標識する。
注：（感染または非感染細胞内での）オートファジーフラックスの操作については、12時間に4からラパマイシン（20 nM）を、またはバフィロ（160 nM）を用いて、薬物治療を延長する。
- ウエスタンブロット法
注：オートファジー活性は、p62からとLC3としてオートファジーマーカーのタンパク質レベルを測定することによって定量することができる。- インキュベーションの所望の期間が経過した後、免疫ブロッティングのために細胞を収集し、溶解。 8、10、または14％アクリルアミドゲル上で実行してタンパク質抽出物。
- オートファジーフラックス、 すなわち 。 21,22で説明したように、オートファジーの速度が、分析することができる。
- 顕微鏡イメージングと定量化
- 落射蛍光または共焦点顕微鏡および63Xまたは100Xオブジェクトの使用IVEは、 シゲラ感染に対するsiRNAの作用または薬物治療は、定量的顕微鏡検査によって評価することができる（ すなわち 、オートファゴソーム、セプチンケージおよびアクチンテイルのカウント）のセクション1.5に記載され、図2Aおよび図2Bに示すように、
Sのin vivoイメージング 3。オートファジーと細胞骨格との相互作用フレクスナー
注： 赤痢菌感染症のゼブラフィッシュモデルは、生体内 19 にセプチンのケージやオートファジーを調査するために使用することができます。
- Sを準備するフレクスナー
- 文化S. 1.1節で説明したようにフレクスナー 。
- OD 600 = 0.3〜0.6、10分間、1,000×gでスピン8ミリリットル細菌の継代培養時。 10分1,000×gで1×PBSで遠心分離してペレットを洗浄。
- 〜2000細菌/ NLを得るために、0.1％のフェノールレッド×PBS中の80μlの中でペレットを再懸濁。 BACTキープ成長を遅くする氷上でerial準備。
注：フェノールレッドを追加すると、幼虫に注入する際の接種物を視覚化するのに役立ちます。
- 注射用ゼブラフィッシュ幼生を準備
注：ゼブラフィッシュは、それらが幼虫呼び出されたときに、卵のようにレイアウトされ、72時間後に受精するまでの胚として識別されます。- （つまり、生成された卵を食べてから、成人を防ぐことができます）ビー玉で覆われた底部を有する独立した水槽には、（1比率は、通常2）4人の男性と8人の女性を配置することによってWesterfield 23で説明したように、成人のゼブラフィッシュを飼育。代わりに、前の晩飼育槽の内側に採卵バスケットを置く。
注：卵はライトがゼブラフィッシュ施設23で上に行く、とすぐにカビの成長を抑制することができるように収集する必要があります〜30分後に受精されている。採卵バスケットは、それらが容易に採取することができるように卵を収集し、また大人から卵を保護するのに役立つ。 - 胚を収集sおよび10分間の0.003％の漂白剤で胚のメディア（E2）で洗浄することにより、それらをきれいに。胚E2培地で5倍の洗浄、漂白剤でE2を削除し、28℃で10センチメートルシャーレ（100胚/ 50ミリリットルのE2培地）中の胚を成長させる。
- 胚または幼虫は、24時間後の受精において、顕微鏡研究のために使用される場合はメラニン化を防止するために、E2培地に0.003％N-フェニルチオ尿素を加える。正常な発達のために28ºCで胚を保管してください。
注：ゼブラフィッシュの幼虫は、72時間後に受精における感染の準備ができている。 - 感染や顕微鏡検査の手順については、E2における200グラム/ mlのトリカインでゼブラフィッシュの幼虫を麻酔。
- （つまり、生成された卵を食べてから、成人を防ぐことができます）ビー玉で覆われた底部を有する独立した水槽には、（1比率は、通常2）4人の男性と8人の女性を配置することによってWesterfield 23で説明したように、成人のゼブラフィッシュを飼育。代わりに、前の晩飼育槽の内側に採卵バスケットを置く。
- 静脈内および局所感染のためのゼブラフィッシュ幼生の調製
注：尾静脈注射を行い、 赤痢菌感染中ゼブラフィッシュの生存を評価する。 赤痢菌にセプチンとオートファジーのマーカーの動員を可視化するために、そのような尾の筋肉のような局所的な部位での感染を行う。- 尾静脈内注射のために、針が直面している背側横方向に麻酔した幼虫を置きます。 図3（a）に示すように、尾静脈を目指し、泌尿生殖器の開口部に針先端に近い（後方）を配置し、皮膚を貫通し、目的の細菌の量（注入量1-5 nl）を提供します。
注：静脈内感染は、実行するために挑戦しているし、この手順に慣れるためのトレーニングの数週間かかります。訓練のための（細菌なし）フェノールレッドを注入すると、適切に注射部位を評価するために役立ちます。
NOTE： 赤痢菌の場合には、用量依存性の実験は、低用量の感染症（<千CFU）は、48時間以内にクリアされ、高用量の感染（> 4,000 CFU）は、48時間19以内の死亡をホストにつながることを示している。 - セクション3.3.1で説明したように、尾の筋肉の感染のために、麻酔した幼虫を配置します。 図3Aに示されるように、針気をつけて配置する筋肉の体節（ すなわち 、骨格筋のセグメント）にわたってy及び細菌調製物の少量（ すなわち 、1 nl）を注入する。
- 尾静脈内注射のために、針が直面している背側横方向に麻酔した幼虫を置きます。 図3（a）に示すように、尾静脈を目指し、泌尿生殖器の開口部に針先端に近い（後方）を配置し、皮膚を貫通し、目的の細菌の量（注入量1-5 nl）を提供します。
- 幼虫中の細菌の静脈注射
- 24で説明したようにホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリーを引き出します。
- 三次元粗マニュアルマニピュレータのホルダーに針を接続し、細いピンセットで針の先端を破る。
- 針をロードするには、カバーガラス上に細菌培養の低下を置く。ややドロップに針の先端を浸し、マイクロインジェクター、ガスシリンダーに切り替え、細菌調製物の所望の量の針を埋める。
- 注入量を較正するために、カバースリップ上の鉱物油の滴を置き、細菌調製物を注入する。マイクロメーターを用いて液滴の直径を測定し、注入量を計算[V =（4/3）πR3]。
注：bacteriで注射を40psiの設定と50ミリ秒を使用した3.1節で説明したように他の準備はNL〜2000 CFU /を与える。 - Westerfield 23で説明したように、プラスチック金型を用いて射出プレートを準備します。
- 注入プレートに幼虫を移し、細い絵筆を使用してそれらを並べる。オリエントとセクション3.3.1で説明したように幼虫を注入する。
- ゼブラフィッシュ生存率の評価のために、/ウェルE2 1mlの24ウェルプレートに個別に感染した幼虫を移し、28℃でインキュベートする。時間（ 図3B）にわたって毎日次の2-5日とプロットの生存のために感染した幼虫を監視します。
- 細菌の定量化のためのゼブラフィッシュの幼虫めっき
注：汚染を避けるために無菌フード下で働く。- （時間0時間の感染後に）、必要な時点で細菌の定量化のために、魚に注入細菌数を評価するために、トリカインの過剰摂取（200〜500 mg / Lの）でゼブラフィッシュの幼虫を生け贄に捧げる。 1.5ミリリットルのPOLに個別の幼虫を置きます0.1％のオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物1×PBSを200μlとypropyleneマイクロ遠心チューブと機械的に乳棒を用いて均質化する。
注：、注入量に細菌負荷を確認するの滅菌1×PBS降下に等しい線量をポンプし、それをプレートに。 - 寒天プレート溶原性ブロス（LB）上に滅菌水やプレート内のゼブラフィッシュ幼生ホモジネートの段階希釈を作る。幼虫は、病原性プラスミドを維持したりしないた赤痢菌を区別するためにコンゴレッドTCSプレート上に交互にめっきすることができる。
注：感染のために使用ゼブラフィッシュ幼生の状態をチェックするための制御として、プレート3以上の非感染魚。 - 37℃でプレートを一晩インキュベートした後、細菌コロニーを数える。 図3Cに示されるように、対数スケールを用いて表す。
NOTE：ゼブラフィッシュの幼生の感染中の細菌負荷はまた、蛍光標識された赤痢菌および顕微鏡私を使用して視覚化することができるセクション3.7または3.8（ 図3D）に記載されているようmaging。
- （時間0時間の感染後に）、必要な時点で細菌の定量化のために、魚に注入細菌数を評価するために、トリカインの過剰摂取（200〜500 mg / Lの）でゼブラフィッシュの幼虫を生け贄に捧げる。 1.5ミリリットルのPOLに個別の幼虫を置きます0.1％のオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物1×PBSを200μlとypropyleneマイクロ遠心チューブと機械的に乳棒を用いて均質化する。
- ゼブラフィッシュ幼生免疫染色
- 希望の時点で、トリカインの過剰摂取を使って幼虫を生け贄に捧げる。 1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心チューブ（10〜20幼虫/チューブ）で魚を集める。
- （4℃で）2（室温）時間または一晩（幼虫クラスタリングを回避するために）1×PBS中に0.4％オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、4％パラホルムアルデヒドを使用して、幼虫を修正し、軌道攪拌機中でインキュベートする。
注：電子顕微鏡法は、感染したゼブラフィッシュの幼生の超微細構造の分析のために使用することができる。この場合、麻酔をかけた胚はMostowy ら 19に従って固定され、処理されるべきである。 - 5分間1×PBS、0.4％オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物での洗浄3回、次に室温で1時間（1×PBS中の10％ウシ胎児血清、1％DMSO、0.1％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）をブロッキング溶液でブロックする。
- ディブロッキング溶液中で一次抗体をリュート。希釈した一次抗体に幼虫を追加し、軌道攪拌機中で4℃で一晩インキュベートする。セクション1.4.3に上記のような一次抗体を使用してください。
- 室温でのPBS 1×0.1％のポリオキシエチレンモノラウレートでの15分間の幼虫の4倍を洗ってください。
- ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈する。希釈された二次抗体に幼虫を追加し、軌道攪拌機中で4℃で一晩インキュベートする。セクション1.4.4で説明したのと同じ二次抗体およびファロイジンを使用してください。
- 室温でのPBS 1×、0.1％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウにおいて15分間洗浄する4倍速。宿主細胞の核の染色のために、これらの15分間の洗浄の最初の中にDAPI（150nMの最終濃度）を加える。
- 蛍光標識された幼虫の保全のために、15、30、60のグリセロール勾配中で漸進的にそれらをインキュベートし、80％は室温気性で2時間、1×PBSおよび0.1％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（中に希釈ature）（）4℃で一晩に。
注：染色した幼虫は長期間保存することができる、4℃で80％グリセロール中で（ 例えば 、4ヶ月）。
- 固定ゼブラフィッシュ幼生の顕微鏡イメージング
- 35ミリメートル（実体顕微鏡用）ペトリ皿または（共焦点ミスコピーのために）完全なガラスボトムディッシュに80％グリセロールの小滴に固定されたグリセロール埋め込み幼虫を転送します。
- 感染した幼虫のZスタック画像列を取り、必要に応じて画像を処理。
- 落射蛍光または共焦点顕微鏡および生物全体のイメージングのための10倍または20倍対物レンズを使用してください。その後、個別の細胞や生体内 19 内の個別の細菌にオートファジーと細胞骨格マーカーの募集（図4Aおよび4B）を可視化するために、共焦点顕微鏡および40X、63X、または100X目標を使用しています。
注：尾の筋肉に魚に感染し、EAを可能にするためにガラスボトム皿の底に沿って平らなグリセロールにマウントSY焦点。
- 感染ゼブラフィッシュ幼生の顕微鏡イメージングは、ライブ
注：幼虫は、このように生体内でのオートファゴソームは、GFP-LC3ゼブラフィッシュトランスジェニック系統25を用いて可視化することができ、光学的にアクセス可能です。 3.3節で説明したようにゼブラフィッシュの幼虫に感染し、このセクションで説明するようにマウントします。- E2に低融点1％アガロース（LMA）を準備し、幼虫の損傷/殺害を避けるために、35〜37℃に冷却する。 35ミリメートル（実体顕微鏡用）ペトリ皿または（共焦点顕微鏡用）のフルガラスボトムディッシュにLMAの滴を配布します。
- 転送がLMAに（可能な限り少量の水で）個別にゼブラフィッシュの幼虫を麻酔し廃棄します。絵筆を用いて所望の位置にオリエント幼虫と凝固するアガロースを待つ。
- LMA、およびE2は乾燥から準備を回避するために、水から酸素を交換するために魚を可能にするために200μg/ mlのトリカインを含むとオーバーレイ全体食器表面を覆う。
- 落射蛍光または共焦点顕微鏡全体ゼブラフィッシュの幼虫を画像化するための10倍または20倍対物レンズを使用してください。 生体内で （ すなわち 、GFP-LC3 +は赤痢菌の周囲の液胞をVE）細菌authopagosomesを可視化するために、共焦点顕微鏡および40X、63X、または100X目標を使用してください。
- （ 例えば 、いくつかの時間かけて2分ごと）を時間をかけて、感染した幼虫のZスタックを取るリアルタイムで、オートファゴソーム、及びそのダイナミクスを可視化する。
オートファジーおよびin vivoでの細胞骨格の4機能解析
注：感染の経過におけるオートファジーの薬理学的および遺伝的摂動の影響は、全体の動物のレベルで監視し、単一細胞のレベルですることができます。
- モルホリノ注入によるオートファジー操作
- 10分間65℃に加温して1 mMのストック溶液を滅菌水中モルホリノオリゴヌクレオチドを再構成する。店室温で加えた。
注：モルホリノオリゴヌクレオチドの注射は1-4細胞期の胚で実行する必要があります。 - ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水の滅菌0.1％フェノールレッドとモルフォリノオリゴヌクレオチド作業溶液を調製します。セクション3.4.2で説明したように針をロードします。セクション3.4.3で説明したように、モルホリノ、オリゴヌクレオチド注入量を校正することができる。
注：フェノールレッドは、注入量を視覚化するのに役立ちます。 - 胚ポジショニング室（ すなわち 、部分的に除去針に面したエッジを持つ10センチメートルペトリ皿の蓋の上にシアノアクリレートで接着顕微鏡スライド）を準備します。少量の水でチャンバーに1-4細胞期の胚を移し、細い絵筆でそれらを合わせます。
- 絨毛膜とスムーズに卵黄を貫通している。中に入ると、モルホリノオリゴヌクレオチド溶液の所望の体積を注入するためにペダルを踏む。
注：0.5に注射の量を最小限に抑える - 2 NL;ボリュームは高いTHAnは5ナノリットルの発達障害を引き起こし、卵の死亡率を増加させることができる。 - マイクロインジェクション後、きれいな胚（3.2節で説明したように漂白することによって）と28℃でのE2とペトリ皿でそれらをインキュベートする。
- 72時間後の受精制御に感染する（ すなわち 、コントロールモルホリノオリゴヌクレオチドを注入したゼブラフィッシュの幼虫）またはP62のモルファント（ すなわち 、P62のホリノオリゴヌクレオチドを注入したゼブラフィッシュの幼虫）のセクション3.4に記載されているように赤痢菌と。 3.5節で説明したように、次の2〜5日間、生存及び細菌負荷を評価する。 3.7節で説明し、 図4（c）にハイライト表示、またはセクション3.8で説明したように、画像ゼブラフィッシュの幼虫を生きたような画像は、ゼブラフィッシュの幼虫を修正しました。
注：有効なモルホリノオリゴヌクレオチドの用量は（考察を参照）転写スプライシングまたはタンパク質翻訳を阻害するその効率に基づいて評価することができる。
- 10分間65℃に加温して1 mMのストック溶液を滅菌水中モルホリノオリゴヌクレオチドを再構成する。店室温で加えた。
Representative Results
インビトロでの組織培養細胞の感染の際に、S.ネリはファゴソームから脱出し、細胞質ゾルに侵入することができます。細胞質ゾルにおいて、宿主細胞は、セプチンケージ（ 図1A）の内側に細菌を区画化することにより赤痢菌のアクチンベースの運動性を防ぐことができます。セプチンケージによって捕捉された細菌はまた、オートファジーマーカーP62（ 図1B）およびLC3（ 図1C）で標識することができる。これらの観察は、侵襲性病原体の普及を制限する宿主防御の新規メカニズムを強調し、また、オートファジーと細胞骨格の間に新しいリンクを明らかにした。驚くべきことに、オートファジーマーカーの枯渇が著しく細菌（ 図2A）のセプチンのケージを低減し、作業もセプチンケージの枯渇が著しく、オートファジーマーカー8の動員を減少させることが示されている。したがって、少なくとも赤痢菌の場合には、ケージアセンブリとオートファゴソームをセプチン構成体nは相互に依存するプロセスとみなすことができる。セプチンケージによる赤痢菌の区画化のための他の細胞の要件は、アクチン重合およびアクトミオシン活性（ 図2B）が含まれる。
感染症の新たなモデル動物、ゼブラフィッシュの幼虫19の恩恵を受けることができない自然のマウス細菌性赤痢のモデル、および赤痢菌の病因、セプチン生物学および生体内での細菌のオートファジーの研究はありません。このようなインビボでの顕微鏡検査（ 図3A）のために尾静脈生存実験のための注射、および尾の筋肉注射などのさまざまな解剖学的部位における細菌を注入することにより、ゼブラフィッシュの幼虫を感染させることが可能である。用量に応じて、S.ゼブラフィッシュの幼虫に注入フレクスナーはどちらか48時間の感染後以内にクリアすることができ、または進行し、最終的に致命的な感染症（ 図3B - 3D）になることがあります。 赤痢菌の病原性ファのコンスは28℃、ゼブラフィッシュの最適な成長温度で表され、 赤痢菌によるゼブラフィッシュの感染は、III型分泌系（T3SS）19、ヒト疾患における必須病原性決定因子に応じ厳密に依存している。まとめると、これらの観察結果は、ゼブラフィッシュの幼虫は赤痢菌感染のin vivo分析のための貴重な新しいホストを表していることを示している。
ゼブラフィッシュ幼生の光アクセス性は、in vivoでのセプチンのケージ（ 図4A）、前哺乳類宿主モデルを使用して達成されたことがない成果の可視化を可能にします。セプチンケージが生体内で自食作用を標的とした細菌を捕捉するという証拠を補完するために、人は、GFP-LC3を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫に感染し、 赤痢菌 （ 図4B）にオートファジーマーカー補充を観察することができます。 in vivoでの赤痢菌オートファゴソームのultrastrucutral分析、EL用ectron顕微鏡は、明らかに二重膜小胞19による細菌の細胞質ゾル分画を表示するために使用することができる。オートファジーは、細胞自律的免疫及びintracytosolic細菌に対する重要な防御機構14-16の重要な要素と見られている。 インビボでオートファジー機能を特徴づけるために、P62のモルホリノで処理したゼブラフィッシュの幼生を使用することができる。コアオートファジー機械[ 例えば 。、36、オートファジー関連タンパク質（のATG）26]とは異なり、P62は、脊椎動物の発生27に必須ではないため、ゼブラフィッシュの幼虫は感染前に正常に開発することができます。驚くべきことに、P62-枯渇幼虫S.を接種大幅に増加し、死亡率の増加細菌負荷19におけるフレクスナー結果。セプチンケージアセンブリは、オートファゴソームの形成7,8と相互依存していることを示すin vitroの研究と一致して、 赤痢菌にセプチンの動員は明らかに（P62-枯渇幼虫低減される
インビトロでのセプチンケージ。図。（A）HeLa細胞を感染させたS.赤痢菌は、4時間40分間、固定し、SEPT9およびファロイジンに対する抗体で標識し、共焦点縮小コピーによって撮像された。スケールバーは、1μmである。（B）HeLa細胞を感染させたS.赤痢菌は、4時間40分間、固定し、P62とSEPT2に対する抗体で標識し、蛍光顕微鏡で画像化。スケールバーは、1μmである。（C）HeLa細胞を、GFP-ATG8 / LC3でトランスフェクトされたS.を感染させた4時間40分のためにフレクスナー 、固定、SEPT2に対する抗体で標識し、蛍光灯マイルにより撮像されたcroscopy。スケールバーは1μm。これらの図はMostowy ら 7から変更されている。 
シゲラ -septinケージの形成のための図2セルラー要件。（A）HeLa細胞をP62、ATG5、ATG6またはATG7 siRNAを、コントロール（CTRL）で処理した。 siRNAで処理した細胞の全細胞溶解物は、siRNAの枯渇（上）の効率を示すために、GAPDH、P62、ATG5、ATG6、またはATG7のために免疫ブロットした。 siRNAで処理した細胞は、Sに感染していた4時間40分のためにフレクスナー 、固定し、定量的な顕微鏡検査のために標識。グラフ（下）は処置当たりn個≥3実験からSEPT2ケージ内部の赤痢菌の平均±SEMの％を表す。（B）HeLa細胞は、Sに感染させたFD（CytD）サイトカラシン、DMSOで処理lexneri、ラトランキュリンB（LATB）、ノコダゾール（NOCO）、またはブレビスタチン（ブレブ）と4時間後に40分固定し、定量的な顕微鏡検査のために標識。グラフは、治療ごとに2つの独立した実験からSEPT2ケージの中に赤痢菌の平均％±SEMを表す。これらの数字はMostowy ら 7から変更されている。 
図3 赤痢菌感染のゼブラフィッシュモデル。実体顕微鏡下でゼブラフィッシュの幼虫の向きを説明するために、（A）画像。 （左のパネル）ゼブラフィッシュの幼生72時間後に受精は、その背側は、注射針を向けて射出プレートに横方向に配置した。 （中央パネル）血流感染がINJによって行った尾静脈内細菌（赤色溶液）をパソ、泌尿生殖器の開口部に後方。尾の筋肉内（右のパネル）感染は、体節の上の細菌（赤色溶液）を注入することにより行った。（B）72時間後の受精の幼虫の生存曲線をSのさまざまな投与量を注射フレクスナー及び48時間感染後、28℃でインキュベートした。効果的な接種材料は、低（<10 3 CFU、白丸）、中（〜4×10 3 CFU、白三角）または高（〜10 4 CFU、白四角）に分類された。 nは％±SEM（横棒）≥3種菌クラスごとの実験の平均。個別の幼虫からホモジネート中の生菌（C）列挙さまざまな時期に、感染後、LB上にプレーティングすることにより測定された注、感染を生き残った唯一の幼虫を列挙分析に含まれています。これも図示±SEM（横棒）を意味する。（D）GFP- 赤痢菌の分布によって決定ライブイメージングさまざまなタイミングで蛍光実体顕微鏡を用いて低、中、高用量接種（尾静脈注射）を使用して、感染後。送信画像（灰色）およびGFP蛍光（緑色）のオーバーレイ（B） - （D）これらの図はMostowy ら 19から変更されている。 
in vivoでの赤痢菌感染症の細胞生物学。図。（A）ゼブラフィッシュの幼虫はSEPT7に対する抗体で標識された固定24時間GFP- 赤痢菌 （低用量）と尾の筋肉、、（赤）およびGFPに感染させ、（緑）、共焦点顕微鏡で画像化。スケールバーは5μm。（B）GFP-LC3ゼブラフィッシュの幼虫はmCherry- 赤痢菌 （中用量）のために感染させた4時間、固定、mCherryを（赤）に対しておよびGFP（緑）に対する抗体で標識し、共焦点顕微鏡で画像化。スケールバー、1.5μmのコントロール（CTRL;左画像）のいずれかで処理された（C）ゼブラフィッシュの幼虫。またはP62（右画像）モルフォリノは（、4時間（中用量）のために、GFP 赤痢菌に感染して固定し、SEPT7に対する抗体で標識した赤）およびGFP（緑色）に、共焦点顕微鏡で画像化。矢印は、セプチンケージ（CTRL）かに捕捉された赤痢菌のいくつかの例を強調4時間後に感染（P62は枯渇）。スケールバーは5μm。これらの図はMostowy ら 19から変更されている。
Discussion
組織培養細胞を用いてインビトロで自食作用および細胞骨格を監視する場合、セクション1および2に記載のプロトコルは、組織培養細胞型の多種多様に適用することができる。さらに、オートファジーに従うこと（ 例えば、ATG8 / LC3はオートファゴソームVEの+）と細胞骨格（ 例えば 、アクチンテイル、セプチンケージ）のライブイメージングを用い赤痢菌感染の間にリアルタイムでダイナミクスは、組織培養細胞は一過性にGFP-を使用してトランスフェクションすることができる、 RFP-またはCFP-タグ作成物以前に7,8に記載されているように。 赤痢菌に感染した細胞の割合を増加させるために（ すなわち 、リアルタイム分析のために一般的に望ましい赤痢100でHeLa細胞の5〜30％に侵入できることを考慮すると：1 MOI）、直接赤痢菌 400μlの（OD 600 = 0.3を追加-0.6）2ml中の細胞に、MEM（血清飢餓）と、十分な細菌のエントリの少なくとも1.5時間後に感染を待つファゴソーム、複製、AUからの脱出tophagy認識とセプチンのケージング。あるいは、アドヘシンAfaEを発現する赤痢菌 M90T AFAI株を使用し、M90T株28と比較して上皮細胞においてはるかに高い浸潤能力を有することができる。注目すべきは、M90T AFAI株はまだゼブラフィッシュを用いてインビボで試験されていない。 赤痢菌コロニーのプレートは、2〜3日間4℃に維持し、いくつかの実験のために使用することができる。しかし、時間をかけて、病原性プラスミドを失った赤痢菌のコロニーはまた、コンゴレッドを吸収し、それらの病原性プラスミドを保持しているように見えることがあります。このような理由から、私たちは、可能な場合は、新鮮な細菌株を使用することをお勧めします。
in vivoでの感染の細胞生物学を監視する場合、プロトコルは、セクション3と4の使用野生型ABラインゼブラフィッシュで説明。 赤痢菌 -leukocyte相互作用を監視するには、トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を使用することができ、 たとえば、MPX：GFPまたはLYZ：DsRedを視覚的にマクロファージ19,31を可視化するためにmCherryを：好中球19,29,30またはMPEG1を IZE。セクション3.8で説明したように生体内で自食作用を可視化するために、GFP-LC3ゼブラフィッシュトランスジェニック系統19,24を使用することができる。
インビボでオートファジーを摂動するために、効果的なモルホリノオリゴヌクレオチドの用量は、転写、スプライシングまたはタンパク質翻訳を阻害するその効率に基づいて実験的に評価されなければならない。これは、滴定実験を実行し、（スプライスモルホリノオリゴヌクレオチド用）、RT-PCRによって、あるいは（並進ホリノオリゴヌクレオチド用）、SDS-PAGE 32で枯渇を確認することをお勧めします。ゼブラフィッシュ胚または幼虫からのRNAの単離は、チオシアン酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルム抽出を用いて行うことができる。ゼブラフィッシュの幼生（8〜15幼虫/管）からタンパク質を抽出するために、機械的に200μlの溶解緩衝液（1 Mトリス、5 MのNaCl、0.5 M EDTA、0.01％オクチルフェノールエチレンオキシドコンデンスで乳棒を用いて均質化するeおよびプロテアーゼ阻害剤）。 15分間、4℃で19000×gで遠心分離管と新しいチューブに上清を移す。レムリ緩衝液を添加し、15分間、95℃でサンプルを加熱する。溶解物を、必要になるまで-80℃で保存することができ、セクション2.3で説明したようにウェスタンブロッティングによって評価することができる。
ゼブラフィッシュは、生体内の薬物アプリケーションのための優れたモデルです。モルホリノオリゴヌクレオチドを用いた分析は、自食作用を操作するための確立された薬物（ 例えば 、ラパマイシンおよびバフィロマイシン）で補完することができる。未感染及び/又は感染した幼虫は、ラパマイシン（1.5μM）またはバフィロマイシン（80 nM）のE2で希釈し、25,33に記載されるようにオートファジーフラックスウェスタンブロッティングによって評価することができるで処理することができる。 3.5節で説明したように、感染した幼虫の感染と生存の結果にオートファジー操作の結果を評価することができる。
宿主細胞を研究することに加えin vitroおよびin vivoプロトコルにおける決定因子は、 例えば 、 赤痢菌ΔicsAは （ 赤痢菌タンパク質 ICSAは、N-WASPを動員し、次にARP2 / 3、示差的オートファジーによって認識される細菌の変異株を用いて、オートファジー認識に必要な細菌の決定因子を評価するために適用することができるその非存在下での、その非存在下ではなく、アクチンテイル、ないセプチンケージ）とShigellaΔicsB（赤痢菌は、ICSAのオートファジー機械の動員を防止し、細菌のエフェクタータンパク質ICSB、経由オートファジー応答を回避することはありえない、アクチンテイルとセプチンケージ形成にもっとセプチンケージ、より多くのオートファジー）7,8がある場合もあります。
赤痢菌は、ゼブラフィッシュの自然な病原体ではありませんし、37℃で最適に成長する。しかし、仕事は赤痢菌の侵入に必要な病原性因子は、CY内貪食空胞およびレプリケーションから逃れることが示されているtosolを発現させ、28℃で19でゼブラフィッシュの幼生において機能的であることができます。 28°C、正常なゼブラフィッシュの開発23を確保するためにゼブラフィッシュ飼育し、標準温度で最も一般的に使用される温度である。驚くべきことに、（ すなわち 、マクロファージ細胞死、上皮細胞内に侵入し、乗算、細胞から細胞への拡散、ホスト上皮の炎症性破壊）ヒトで細菌性赤痢を引き起こす主要な病原性のイベントが忠実に赤痢菌感染のゼブラフィッシュモデルで再現されている19。
オートファジーと細胞骨格の遺伝子は、普遍的に発現し、生物学的機能の広い範囲を持っている。マウスの研究は、胚致死性であり、そしてこの問題は、ゼブラフィッシュが複数あるという事実によって低減することができるが、それは（これらの遺伝子のいくつかはまた、ゼブラフィッシュの開発のために不可欠であると思われる本質的なオートファジー26またはセプチン遺伝子のノックアウト5を示しているパラロガス遺伝子33）。もしそうであれば、（i）のオートファジーを調節する薬理学的試薬の使用および細胞骨格、（ii）のモルホリノを滴定することができ、（iii）の遺伝子のノックアウトは、特定のセルのために設計することができるなど、この問題を克服するためのいくつかの選択肢が存在し、タイプ、および/ または（iv）は、動物の発達のために必須ではないオートファジー認識に関与する遺伝子（ 例えば 、P62）を標的とすることができる。
ゼブラフィッシュは、 赤痢菌感染時にオートファジーと細胞骨格を調査するための理想的なモデルシステムであるが、分子ツールは、現在不足している。フィールドは、新しいツールを生成し、目的のタンパク質の細胞特異的発現を駆動する必要がある。オートファジー/細胞骨格遺伝子の発現をノックダウンするために、新しいモルホリノ配列は必要とされ、ゲノム工学のための新規な方法（ 例えば 、ターレン、CRISPR / Cas9）を使用することもできる。一方、いくつかのツールは、以前に、ヒトまたはマウスの研究のために生成された同じようにゼブラフィッシュのために働くことがあります。
細胞内細菌S.赤痢菌は、免疫系1,2によって認識される細菌の能力を含む、生物学における主要な問題に対処する例外的なモデル生物として浮上している。宿主細胞は、S.の運動性を制限するセプチンを採用赤痢菌とオートファジーにそれらをターゲットに、細胞自律的な免疫7,8の重要な要素。これらの観察は、自食作用および細胞質細菌を分解する能力を研究するための新しい分子のフレームワークを提案する。主要な問題は、完全に、基礎となる分子や細胞のイベントを解読するために、関連する動物モデルを用いて、生体内での細菌感染の間、in vitroで分析し、これらのイベントを検証することになりました。この目的のために、ゼブラフィッシュは、S.の分析のための貴重な新しいホストとして確立されている赤痢菌感染19。細菌と宿主細胞間の相互作用は、高解像度で撮像することができる、及びゼブラフィッシュモデルは、 生体内で赤痢菌感染症の細胞生物学を理解するのに有用であることを証明する必要があります。ゼブラフィッシュの幼生は、宿主防御における細菌オートファジーの役割を調査するために使用することができ、かつ作業がオートファジーの摂動に悪影響シゲラ感染19に応答して宿主の生存に影響を及ぼし得ることが示された。
赤痢菌の研究から生成された観測は、組織培養細胞を用いたin vitroでケージやオートファジーをセプチンおよびin vivoでゼブラフィッシュの幼虫を使用すると、宿主防御を理解する上での基本的な進歩を提供することがあります。彼らはまた、感染症と闘うことを目的とし、新しい戦略の開発を示唆している可能性があります。
本報告書の重要な目的は、in vitroで解析し、分子および細胞事象の意味を理解することです（ つまり 、オートファジー、アクチンテイル、ケージングセプチン）ENTとの関連で、生体内での細菌感染の間にゼブラフィッシュの幼虫を使用して怒り生物。ゼブラフィッシュ生物学や取り扱いに慣れていない場合は、1が適切なゼブラフィッシュの飼育23の奥行きプロトコルおよびゼブラフィッシュの感染19,35 のin vivoでの分析に指すことができる。
Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。
Acknowledgments
SMの実験室での作業は、ウェルカム·トラストの研究キャリア開発フェローシップ[WT097411MA]でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B1793 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Borosilicate glass microcapillars | Harvard Apparatus | 30038 | |
| Coarse manual manipulator | Narishige | M-152 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| Dumont #5 fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forchlorfeneuron | Sigma-Aldrich | 32974 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A | |
| Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A | |
| JetPEI transfection reagent | Polyplus transfection | 101-01N | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich | L5288 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Low melting agarose | Promega | V2111 | |
| MatTek glass bottom dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14 | |
| MEM plus L-alanyl-L-glutamine | GIBCO | 41090028 | |
| MEM non-essential amino acids solution | GIBCO | 11140-035 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Micropipette puller device | Sutter Instrument Co., Novato, | P-87 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | P35G-1.0-14 | |
| Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| N-phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phalloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693116001 | |
| p62/SQSTM1 antibody | Cliniscience | PM045 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | R8781 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360039 | |
| Transfection reagent | Life Technologies | 12252-011 | |
| Vectashield hard set mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
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