Summary
电机控制和平衡性能是众所周知的恶化与年龄。本文介绍了一些非侵入性的标准行为测试与另外一个简单的旋转刺激衰老小鼠模型，以挑战在平衡性能前庭系统和显示的变化。
Abstract
在平衡性能与年龄有关的下降与不断恶化的肌肉力量，运动协调和前庭功能相关联。虽然一些研究显示变化的平衡表现型与年龄在啮齿类动物中，只有极少数孤立前庭贡献下正常情况下或在衰老期间的平衡。我们用两个标准行为测试在规定的年龄分以上的寿命来表征小鼠的平衡性能：旋转试验和斜平衡木测试。重要的是，一个定制的旋转体也被用来刺激小鼠的前庭系统（而不诱发运动病明显的迹象）。这两个测试已经被用来表明改变前庭介导的平衡性能是目前在鼠的寿命。初步的结果表明，无论是旋转试验和改性平衡木测试可用于老化作为替代更diffic期间识别变化的平衡性能ULT和侵入性技术，如前庭眼（VOR）的测量。
Introduction
我们的平衡感，也许是连最基本的运动活动，包括散步和车削中最容易被忽视但非常重要的组成部分之一。平衡是由很多因素，包括肌肉力量，运动协调和前庭功能的影响，并且它仅在前庭神经病变的存在或不正常的老化过程中，一个全功能的平衡系统的重要性理解。扰动前庭系统往往以眩晕或头晕及不平衡导致摔倒和受伤以后1的风险增加的经验有关。这是在老年人群跌倒的地方是2伤的主要原因之一尤为关键。
前庭功能检查通常是基于前庭反射，尤其是前庭眼（VOR）或前庭collic反射（录像机）。在VOR和录像机是必不可少的图像上的稳定头部和身体的动作分别在视网膜和头部位置。一般情况下，VOR测量需要的搜索线圈微创植入测量眼球运动或眼球运动3的视频跟踪。这是在小鼠由于老鼠的眼睛和检测瞳孔的视频分析3难度小自然充满挑战。作为替代方案，录像机已被用来测量头的稳定响应于身体的动作小鼠而不需要侵入性手术4。尽管如此，一些研究特别侧重于前庭系统是如何执行作为一个整体，更重要的是它的老化过程中是如何变化的。
评估的综合平衡性能简单，无创，我们修改两个常用的行为测试。该旋转杆，斜平衡木测试评估啮齿动物和在以前的研究中电机性能的不同方面已经用于测试电池获得一个完整的简介电机能力。这种能力可能受疾病或遗传修饰，并且还以与正常发育和老化5-7相关联的处理敏感。使用旋转杆早期的工作表明，在小鼠运动协调3个月8岁后下降。此外，老鼠显示出明显的平衡赤字的平衡木测试9年龄的增加。
本文描述了为了挑战前庭系统和年轻人和年纪较大的老鼠表征上的平衡性能的后续影响使用与前庭刺激相结合的旋转杆和平衡木测试。虽然描述的简单，无创的方法并非设计为外周前庭功能独立的措施，他们也提供了一个有用而简单的行为措施，在前庭处理的多个阶段的小鼠正常老化过程中，比较细胞和亚细胞的变化。
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Protocol
1。动物
- 老鼠1岁，9，和13个月大的（C57/BL6）是从动物资源中心（澳大利亚珀斯）获得。这些小鼠被安置在标准的鼠笼博世啮齿动物设施在悉尼大学的12/12小时亮/暗周期，获得食物和水随意 。下面列出的程序已获悉尼动物伦理委员会的大学。
- 把鼠标笼子进入考场每个测试10分钟前，让小鼠使其恢复到测试环境。
2，转棒
- 设置的旋转杆装置（ 图1A）：
- 在旋转杆的每个车道安装销钉。
注意：在这种情况下大鼠销钉（70毫米直径）被用来代替鼠标的定位销（32毫米直径）从扒着木钉和执行“被动转”10阻止老鼠。 - 断定离子对坐落在确保它们没有倾斜触摸旋转杆的地板和旋转杆的每个车道底部的导线磁登陆平台放在尽可能接近到每个车道的磁右侧壁不接触。
注意：在转棒测试的小鼠都必须走在向前的方向留在旋转和加速的定位销。当鼠标不再能够留在木钉，他们属于和取代的登陆平台，随后激活磁传感器。所花费的时间从旋转榫钉，在落下和行进的距离被自动计算每个小鼠，并在旋转杆的前部记录的显示屏幕上的时间的销钉转速下降。 - 2滑动的透明塑料板到每个转棒线的前方与底部的短板和长板上面。
- 输入利用设在旋转杆的前键盘的测试参数。按照STEPS为2.1.4.1 2.1.4.6的加速旋转试验参数和步骤2.1.4.7至2.1.4.12的定速旋转试验参数。
- 设置测试的最长持续时间为60秒。
- 设置要使用的车道数（或待测试的小鼠的数目）。
- 设置测试，以5 RPM的启动速度。
- 设置测试的最高速度至44转每分钟。
- 设置测试，以60秒的升降温速度。
- 置所选择的定位销的尺寸和旋转的大鼠销钉转动在向前方向的方向。
- 设置测试240秒的最长期限。
- 设置通道以用于1作为将小鼠单独测试的次数。
- 设置测试的起始速度，以每分钟15转。
- 设置测试的最高速度至15转每分钟。
- 设置测试为0秒的升降温速度。
- 选择的销的尺寸和旋转的方向设置成鼠销子转动以forwaRD方向。
注意：上面的设置可以被改变以适应不同的实验的需要。
- 放置一个摄像头在旋转杆的固定速度旋转试验前，让鼠标的审判过程中的行为可以被记录并用于以后的分析视频，以确定持续时间的小鼠能够留在转棒。
- 在旋转杆的每个车道安装销钉。
- 按照步骤2.2.1至2.2.4加速旋转试验：
- 放置在每个固定销5分钟一个鼠标，让鼠标使其恢复到转棒。
- 轻轻轻移小鼠面对旋转杆的背面，并开始旋转试验时，所有受试者都面临着这样的方向（参见图1B）。
- 返回所有小鼠笼子里时，他们已经从旋转木棍倒下，让他们10分钟的休息与获取食物和水。
- 重复步骤2.2.1至2.2.3完成共8项试验，确保清理销钉，车道，以及旋转杆的尿液和粪便的落地平台，移动登陆平台回悫每次试验的起始位置。
注意：第3-5试验是用来作为训练试验，让老鼠与任务熟悉。下跌的时间，行走距离和木钉在秋天以后每次审讯时结束转速被记录供以后分析（ 图2）。
- 按照步骤2.3.1到2.3.8的固定速度旋转试验：
- 放置在销子5分钟1小鼠，以允许它以不变的旋转杆。返回鼠标回到它的笼子。
- 启动视频录制的摄像头，然后按下开始在转棒上。然后将鼠标放在旋转销钉确保它所面临的旋转杆的后面。
- 停止录像摄像机上，当鼠标落在从旋转的销钉，并用获取食物和水返回鼠标其笼10分钟。
- 直到一共有8个试验是后天确保清洁销钉，车道，以及旋转杆的粪便和尿液的着陆平台上重复步骤2.3.2和2.3.3，并移动登陆平台，回到它的每个试验的起始位置。
- 开关上的定制的旋转体在3 Hz，持续20秒，以允许小鼠以熟悉的声音。通过切断钻头20秒后停止旋转，然后将手放在传动轮的任一侧，以持续旋转过去的初始20秒停止。
注意：该旋转体本身由一种啮齿动物传动轮固定到钻头（ 图3A）的。在传动轮的中心是一个小室用网状盖子上鼠标放置（ 图3B）。在转子旋转时在绕垂直轴逆时针的方向。刺激的幅度是在与显示旋转的刺激范围从0.2至3赫兹是足够来产生先前的研究一致吃了VOR和录像机的反应4,11,12。 - 把鼠标在腔室内于所述旋转体的中心，并更换盖子。
- 开关上的转子在3 Hz，持续20秒的最低设置。启动旋转杆，在此期间，准备为即将到来的审判开始在相机上的视频录制。关掉钻头在20秒结束时，然后将手在传动轮的两侧向从纺纱停止。通过将它尽可能快地在转动销后立即重新测试鼠标的旋转杆。
- 停止在相机上的视频录制，当鼠标落在从木钉和返回鼠标笼子里。
- 用温和的清洁剂/水混合物并清洗干净的塑料板的圆柱销钉，小巷和带时，所有小鼠经测试70％乙醇的旋转杆的金属落地平台。
3，平衡木与前庭挑战
- 成立了巴矛杆束装置作为看出，在图4A中 。
注：平衡木设备是改编自卡特等人描述的设备（2001）13。对于本试验中，老鼠从光束，这是52.5厘米高于地面的下端走路，位于60厘米以上的地面变暗目标框（13×22厘米，用5×6cm的出入口）（ 图4A ）。老鼠自然会去寻觅黑暗和保护目标框赞成外露的横梁，并进一步鼓励由稍微倾斜的漏洞来在向上方向14上运行他们的自然逃逸机制来遍历光束。梁本身的长度为1米，具有一个直径为14mm的圆形横截面。可以使用光束直径的量身定做的范围，它允许实验者来调整试验的敏感性或容纳较大的课题。在平衡梁的下端的白线表示起跑线上。另一条线一直绘制从一开始线60厘米处梁的高端指示终点（ 图4A）。- 位置2个摄像头，一个在平衡木的两侧，在平衡木（ 图4B）的下端。
注意：这些摄像机的角度应能捕捉到平衡梁的整个长度上，并确保标平衡木上的起点和终点线都清晰可见。这些相机将被用于视频记录小鼠的行为，因为他们穿越平衡木，具有被用于以后的分析得到的视频。 - 线用纸巾的目标框的楼层，以便能够方便地清洁尿液和粪便检测每只小鼠后，并将其放置在壳体的圆顶从目标箱内的受试者在家笼。
- 将足够的泡沫或其他衬垫材料的凸起梁的下方，以保护掉下来的设备的任何科目。那年秋天的小鼠会立即回升，由实验呃并放置在目标方框内休息。
- 位置2个摄像头，一个在平衡木的两侧，在平衡木（ 图4B）的下端。
- 将一个鼠标在2分钟的目标框，使其成为熟悉这个环境。覆盖开口向球门箱用戴着手套的手，持续5秒，如果鼠标试图在这段时间来阻止这种行为走路到光束。
- 通过将其放置在横梁上刚刚开放的目标框框，允许它走进球门箱培养鼠标。继续通过将其放置在横梁上逐渐远离球门箱培养鼠标直到鼠标能够从起跑线步行到没有援助和最小的犹豫目标框。离开鼠标休息，在目标中为每个运行后1分钟。
- 开始测试鼠标的时候训练结束。
- 开始录像的摄像头。
- 把鼠标在梁的起始行和等待它穿过束在目标框的方向。
- 停止视频录制的CA当鼠标到达箱meras。
- 离开鼠标休息，在目标框中，持续1分钟。去除可能已经在审判过程中，而等待已存入任何尿液或粪便。
- 重复步骤3.4.1至3.4.4，直到一共有5试验已经完成。
- 开关上在3 Hz，持续20秒（如在固定的速度旋转试验），以允许将小鼠以熟悉的声音定制的旋转器。通过切断钻头20秒后停止旋转，然后将手在传动轮的两侧向从纺纱停止。
- 把鼠标在腔室内于所述旋转体的中心，并更换盖子。
- 开关上的转子在3 Hz，持续20秒的最低设置。在这段时间开始录像的摄像头，在准备即将到来的审判。关掉钻头在20秒结束时，然后将手放在传动轮的任一侧，以持续旋转过去的初始20秒停止。 Ŧ转拨鼠标平衡木开始尽可能快地等待，当鼠标穿过束到目标框。
- 停止摄像机的视频录制，当鼠标到达目标方块，并返回鼠标笼子里。
- 用70％乙醇清洗平衡梁装置和改变纸巾在目标框后每只小鼠进行了测试。
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Representative Results
转棒
小鼠的运动性能被描述为记录每只小鼠在8试验的时间要下降（TTF）。使用TTF的这些测量结果，对每个小鼠训练曲线可以绘制。 图2示出的酮1个月大的小鼠和1个9个月大的小鼠在8试验的过程中，电动机的性能的例子。这些训练曲线表明在第一个3-5的试验，随后再高原增加TTF。 TTF的测量结果记录在高原之前被认为是训练（ 图2），同时，形成了高原TTF的测量记录和用于数据分析（ 图5）。
图5显示了在转棒马达性能降低与年龄。当他们9个月岁的同行（N = 8），1月龄小鼠（n = 6）能留在转棒显著延长（18.38±4.66相比 平衡木 图6显示了次遍历（TTT）的平衡木和越过终点线之前和之后的前庭刺激持续1个月大，9个月龄和13月龄小鼠。 1个月大的小鼠（n = 9），前庭刺激对他们前（3.49±0.62秒）和（3.81±0.66秒）的刺激后遍历类似TTT的平衡所需要的时间的影响最小。相比之下，9个月大的小鼠（n = 6）需要更多的时间前庭刺激后遍历平衡木（4.85±1.67 与 8.45±2.59秒，P <0.05，t检验）。 13个月大的小鼠（n = 5）TTT增加以下前庭刺激（6.48±2.19 与 9.24±4.11 sEC），但没有统计学显著。 为了进一步研究年龄和我们用重复测量方差分析与杜克事后检验的TTT前庭刺激政策相关变化之间的相互作用。 图6表明，前庭刺激对平衡木性能的影响显著大于9个月大的（ P <0.01）和13月龄（P <0.001），当小鼠以1月龄小鼠相比。连同这些结果表明，简单平衡木装置可以与定制的旋转器，以在整个鼠寿命测量在平衡性能前庭相关的变化一起使用。 05/51605fig3highres.jpg“/> 
图1中的旋转杆装置。 （一）转棒仪有5个车道，并能在任何一个时间最多5啮齿类动物进行测试。在白茅升销钉（箭头），导致小鼠置于位于上方的金属升降平台（*）的触发压力传感器进行数据采集。（B）照片酮1个月大的鼠标和一个9个月大的鼠标坐在销钉面向旋转杆的后面，准备测试的。 
图2。转棒训练曲线。的酮1月龄和1个9个月大的鼠标和时间他们的测量结果的一个例子落在旋转杆。时间下降为老鼠测量过程中的试验1稳步上升至5，因此被认为是训练试验。一旦试验稳定（性能提高趋于稳定;虚线）的时间落在测量记录进行数据分析。
图3：定制的旋转器（A）的定制旋转器用于激发的小鼠的前庭系统。该转子由一个德雷梅尔（箭头）和啮齿动物跑轮（*）的（B）的转子的上级视图。小鼠被放置在腔室（箭头）内的传动轮的中心。 
图4。平衡束装置（A）倾斜平衡木装置具有80.3厘米长的基地，位于52.5厘米在地面之上，目标框（*）提出60厘米高出地面光束的开始。（B ）小鼠的平衡木上的行为记录由两个照相机放置在梁的下端。该视频记录提供左，右视图小鼠的S作为它们穿过光束，并用于以后的分析。 
。随着年龄的增长图5转棒性能下降 1个月岁的小鼠（n = 6）能留在旋转木棍显著延长超过9个月大的（N = 8）小鼠（* P <0.05）。数据表示为平均值±标准差。 
图6。前庭刺激对平衡木性能的影响较大随着年龄的增长，前庭刺激增加了9个月大的（N = 6）和13个月大的（N = 5）小鼠，但没有1个月来遍历时间岁（N = 9）小鼠。当年龄和TTT前庭刺激政策相关变化之间的相互作用进行评估前庭刺激对BAL的影响当用1月龄小鼠相比ANCE束性能显著更大的9个月大和13个月大的老鼠。数据表示为平均值±标准差。 *; P <0.05 **; P <0.01 ***; P <0.001。
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Discussion
该议定书中的关键步骤
以前的工作已经表明，它很容易训练过度小鼠同时在旋转杆和平衡梁装置和作为结果，获得准确的测量结果可以是具有挑战性15。例如，过度训练对转棒可导致在这两个驯化和试用期的小鼠故意跳下销钉，而过度训练平衡木上可能会导致更频繁的停车（探索行为），并在相反方向行驶（ 即对启动线）15。最终，过度训练可导致电机实际能力的低估。培训曲线来分析前评估因此，至关重要。
在转棒协议中另一个关键步骤是确保小鼠面对正确的方向（相反的方向旋转）之前，要启动每个试验。面对错误的方向小鼠tion当定位销开始转动难以维持平衡上的销钉，从而下降早，可能高估了测试的影响。另外，在平衡梁试验，小鼠尽可能快地从所述旋转体从前庭挑战恢复立即开始转移到平衡梁是很重要的。这可能意味着，所造成的旋转器和随后的还原性能不平衡可以被低估。
修改和故障排除
修饰可以使两者的旋转杆和平衡梁试验，以改变测试的灵敏度。旋转试验可以很容易地修改，以改变所需的马达任务来检测平衡和运动障碍的难度。这可以通过操纵在该测试过程中，定位销旋转，并且也不论这些旋转加速在测试的持续时间的速度来实现。对于平衡梁测试不同的波束宽度，可用于调节测试的灵敏度，具有较小波束宽度编发难度较高的水平。梁的矩形横截面也可以使用，虽然在使用这种方法的一个先前的研究中，它表明，小鼠能够把手上的光束而导致的异常时的测量来遍历15的两侧。在两个旋转杆和平衡木试验，小鼠可与前庭刺激受到挑战和重新测试在装置最多3次。但是，应该指出的是，老鼠往往不愿意接受与前庭刺激一审判决后完成任务。
限制
平衡和运动能力的测量值会受到被测试14个别小鼠的尺寸和重量。这意味着，有一种可能性，即年龄对电动机性能的影响可以通过效应来增强重力和质量的中心。的确，小鼠具有相对较高的身体质量已被证明在旋转试验16表现较差。前庭旋转器的应用却最大限度地减少其平衡的性能是按重量混淆的程度，并有助于平衡性能的归属地老化的前庭系统的影响。
该技术相对于现有的方法和替代方法的意义
已经有一些研究直接调查的任何物种的前庭系统老化。通常这些研究中使用的信标来评估前庭功能和显示，VOR功能最多保留到60周龄时，只有小的变化成年期达到17,18后。此外VOR测试通常需要一定程度的侵袭到记录线圈附着到动物的角膜，并且通常需要一个恢复周期3。应有给小鼠眼的小尺寸最常用的替代方案，视频眼跟踪，也是难以实现的。连同这些困难限制VOR的研究在小鼠模型的数目。
本文运用装置所描述的方法通常用于评估运动协调和平衡。此外，这些方法已经被用于研究发育和老化过程中发生的和那些由于遗传修饰5,7,19,20的变化。由于动作协调和平衡已被证明3个月岁以后下降，另外使用一个简单的前庭刺激在本文利于前庭系统的调查，在一个老龄化小鼠模型，无需使用更多的困难和微创技术上面概述8。这个信息可以被用于关联行为与发生在前庭系统与年龄底层细胞和亚细胞的变化。
TEP“>未来掌握该技术后，应用程序或路线尽管这里描述的方法不量化不平衡经历了由动物后旋转的程度，前庭刺激进一步的应用程序可以被修改以包括根据症状包括排尿，排便和震颤21存在下的记分系统。量化不平衡所经历的小鼠金额的其他方法包括测量糖精和高岭土摄取如前所示11,21。最终，得分在一个单独的鼠标老化的前庭相关效应的能力，允许调查后续使用电，分子和双光子显微镜技术22平衡性能和细胞/亚细胞过程之间的相互关系。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotarod | IITC Life Science Inc. | #755 | "Rat dowels" = 70 mm diameter. Do not allow ethanol to contact perspex. |
| iPhone | Apple | Can use any type of camera. Velcro fixed to the back surface for attachment to the the 3D articulated arm. | |
| 3D articulated arm | Fisso/Baitella | Classic 3300-28 | Any type of stable vertical stand would be adequate. Velcro is fixed to the apical end of the arm for iPhone attachment. |
| Wooden walking beam: 1 m long strip of smooth wood with a circular cross-section of 14 mm diameter | A range of diameters and cross section shapes can be used to suit experimental parameters | ||
| Wooden goal box (130 x 140 x 220 mm) made from 11 mm thick boards | |||
| Support stand made of 41 x 41 mm beams: 2 vertical beams 525 and 590 mm from ground at the start and goal ends respectively; 803 mm horizontal beam that runs along the ground directly under the walking beam; two 20 mm long beams act as "feet", joining the horizontal and vertical beams at each end; a 21 x 21 x 36 mm block hewn at the apical end of the "starting" vertical beam; a 13 x 13 mm aperture cut out of the center of this block, forming a tunnel which runs perpendicular to the walking beam. | Brace all joins with small steel brackets. | ||
| Black paint (water based) | Handycan | Acrylic Matt Black | 2-3 coats for all wooden surfaces of the balance beam apparatus |
| Clear finish | Wattle Estapol | Polyurethane Matt | Single coat for all beams. Double coat for all other surfaces of the balance beam apparatus |
| Foam, packaging material | To cushion any falls from the balance beam | ||
| 70% Ethanol, paper towels | Clean beam and goal box between each animal. | ||
| Gauze pads/paper towels | To line the floor of the goal box | ||
| Mouse house (from home cage) |
References
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