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Bioengineering

के लिए Amelogenin-chitosan hydrogel के विकास Published: July 10, 2014 doi: 10.3791/51606
Automatic Translation
1, 1
1Center for Craniofacial Molecular Biology, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

Summary

इस अनुच्छेद में, हम सतही तामचीनी पुनर्निर्माण के लिए एक amelogenin-chitosan हाइड्रोजेल fabricating के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हाइड्रोजेल में एपेटाइट क्रिस्टल के सीटू विकास में संगठित पुनर्स्थापनों की प्रभावशीलता और स्थायित्व में सुधार होगा, जो एक घने तामचीनी बहाली इंटरफ़ेस का गठन किया.

Protocol

मानव दाढ़ दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के दंत चिकित्सा के Ostrow स्कूल में निकासी के लिए मानक प्रक्रियाओं का पालन निकाला और संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन के साथ संभाल रहे थे.

1. एसिड etched दांत की तैयारी स्लाइस

  1. किसी भी बहाल क्षय बिना एक मानव तीसरी दाढ़ का चयन करें.
  2. दाढ़ की जड़ भाग निकालें, और अनुलंबीय मोटी एक पानी ठंडा कम गति हीरा देखा उपयोग कर स्लाइस 2 मिमी में दाढ़ के ताज में कटौती. Ultrasonically 2 मिनट के लिए इन स्लाइस को साफ, और फिर विआयनीकृत पानी के साथ 3 बार उन्हें कुल्ला.
  3. , कटाव का घावों अनुकरण 30 सेकंड के लिए 30% फॉस्फोरिक एसिड के साथ दांत स्लाइस खोदना तो तुरंत विआयनीकृत पानी के साथ उन्हें कुल्ला.
  4. Ultrasonically 2 मिनट के लिए etched स्लाइस साफ है, और फिर विआयनीकृत पानी के साथ 3 बार उन्हें कुल्ला.

Amelogenin-chitosan hydrogel के 2. तैयारी

  1. Preparatiochitosan शेयर समाधान के एन
    1. 1% भंग 80 ° सीओ / एन में सरगर्मी के बाद 1% (v / v) एसिटिक एसिड के घोल में (w / v) chitosan (मध्यम आणविक वजन, 75-85% deacetylated)
    2. आर टी का हल ठंडा करने के बाद, एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग chitosan समाधान फ़िल्टर. 1 एम NaOH समाधान जोड़कर 5.0 पीएच मान समायोजित करें.
  2. कैल्शियम और फॉस्फेट शेयर समाधान की तैयारी (0.1 एम)
    1. कैल्शियम क्लोराइड (2 CaCl) वजन और एक 0.1 एम समाधान तैयार है, तो समाधान स्पष्ट है जब तक एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण. 1 एम NaOH समाधान जोड़कर 11 तक पीएच मान को समायोजित करें.
    2. द्विक्षारकीय सोडियम फास्फेट (ना 2 4 HPO) वजन और एक 0.1 एम समाधान तैयार है, तो समाधान स्पष्ट है जब तक एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण.
  3. अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक amelogenin 17-18 की शुद्धि
    यहां इस्तेमाल पुनः संयोजक पूर्ण लंबाई सुअर का amelogenin (rP172) 172 अमीनो एसिड होता है और पूर्ण के एक अनुरूप हैलंबाई देशी सुअर का P173, लेकिन एन टर्मिनल methionine के साथ ही Ser16 18 पर एक फॉस्फेट समूह कमी.
    1. , विआयनीकृत जल के 500 मिलीलीटर में Lysogeny शोरबा (पौंड) अगर पाउडर के 20 ग्राम जोड़ें 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस (तरल सेटिंग) में समाधान आटोक्लेव. ~ 55 डिग्री सेल्सियस, अगर समाधान में एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए अगर शांत करते हैं.
    2. यह ठोस है जब तक प्रत्येक थाली शांत करते हैं, पेट्री डिश को अगर समाधान स्थानांतरण, तो अगर पर संक्षेपण से बचने के लिए फ्लिप. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक की थैलियों में स्टोर प्लेटें
    3. ग्लिसरॉल स्टॉक से पुनः संयोजक कोशिकाओं (ई. कोलाई-BC21) के साथ लकीर लेग अगर प्लेट (-80 डिग्री सेल्सियस). 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों हे / एन सेते
    4. NZCYM मीडिया की 50 मिलीलीटर की तैयारी और 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया आटोक्लेव. मीडिया शांत करने की अनुमति दें, 50 मिलीलीटर मीडिया के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के 50 μl जोड़ें.
    5. Ampicill के साथ पूरक 50ml NZCYM मीडिया में लेग अगर थाली से एक ही कॉलोनी टीका लगानाअंदर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में कोशिकाओं हे / एन सेते
    6. NZCYM मीडिया का 1 एल तैयार है और 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया आटोक्लेव. 1000 मिलीलीटर मीडिया के लिए 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के 1 मिलीलीटर जोड़ें. एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एक रिक्त के रूप में एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) पढ़ ले. नोट: पहले पढ़ने के बाद इस त्यागने न करें.
    7. कदम 2.3.6 से 1000 मिलीलीटर मीडिया में कदम 2.3.5 से सेल संस्कृति के 10 एमएल टीका लगाना. तुरंत टीका के बाद 595 एनएम ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें. विकास का ट्रैक रखने के लिए समय - समय ऑप्टिकल घनत्व माप लें. नोट: आयुध डिपो लिया जाता है हर बार खाली पढ़ें.
    8. बैक्टीरियल वृद्धि 595 एनएम के बारे में 0.75 ~ 0.8 आयुध डिपो तक पहुंच गई जब इसोप्रोपाइल β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 एम) के 700 μl के साथ प्रेरित.
    9. आयुध डिपो 1.1 तक पहुँच जाता है जब कोशिकाओं फसल. 6 प्लास्टिक की बोतलों में कुप्पी की सामग्री डाल. संतुलन और अपकेंद्रित्र उपयोग करने से पहले बोतलें तौलना. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8554 XG पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र-20 डिग्री सीओ / एन में सेल गोली रखें
    10. सेल छर्रों बाहर ले जाओ और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें गठबंधन. किण्वन के एल प्रति 4M Guanidine एचसीएल की 3.5 मिलीलीटर जोड़ें. 1 मिनट के अंतराल के साथ बर्फ, 30 सेकंड पर Sonicate 2-3 बार हर बार,.
    11. 0.5% चींटी एसिड के साथ सेल की मात्रा की 6x dilutions बनाओ और यह 2 घंटे के लिए ठंडे कमरे में हलचल करते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट, 8554 XG के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला रखें. ठंडे कमरे में संतृप्त शेयर समाधान और हलचल का उपयोग कर 20% संतृप्त अमोनियम सल्फेट जोड़ें, ओ / एन
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट, 8554 XG के लिए अपकेंद्रित्र और गोली रखने के लिए. एक C4 स्तंभ (10 x 250 मिमी, 5 माइक्रोन) पर 0.1% trifluoroacetic एसिड (TFA), भार में छर्रों Reconstitute, और एक पर, TFA में एक = 0.1% TFA और बी = 60% acetonitrile की एक रैखिक ढाल का उपयोग कर fractionate 1.5 मिलीलीटर · मिनट -1 की दर प्रवाह.
    13. सूखी बर्फ पर प्रोटीन समाधान रुक और जमे हुए नमूना हे / एन lyophilize
  4. Amelogenin-chitosan की तैयारी (सीएस AMEL) hydrogएल (चित्रा 1 ए)
    1. 200 rp172 के ग्राम 1% chitosan समाधान के 960 μl युक्त ट्यूब में जोड़ें, तो समाधान स्पष्ट है जब तक एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण.
    2. Amelogenin युक्त chitosan समाधान करने के लिए 0.1 एम ना 2 4 HPO समाधान के 15 μl को 0.1 एम 2 CaCl समाधान के 25 μl जोड़ें, तो 5 मिनट के लिए एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण.
    3. ध्यान से 1 एम NaOH समाधान जोड़कर 6.5 सीएस AMEL समाधान के पीएच को समायोजित करें. पीएच मान 6.5 तक पहुँच जाता है जब सीएस AMEL हाइड्रोजेल बनेगी.

Amelogenin-chitosan hydrogel में 3. तामचीनी Regrowth

  1. कृत्रिम लार समाधान की तैयारी
    1. एक निश्चित मैग्नीशियम क्लोराइड की मात्रा (2 MgCl, 0.2 मिमी), कैल्शियम क्लोराइड (2 CaCl, 1 मिमी), पोटेशियम dihydrogen फॉस्फेट (के.एच. 2 पीओ 4, 4 मिमी), पोटेशियम क्लोराइड (KCl, 16 मिमी) और अमोनियम क्लोराइड (भंग 20 मिमी HEPES में एनएच 4 सीएल, 4.5 मिमी)(4 - (2 Hydroxyethyl) piperazine-1-एटैन-सल्फोनिक एसिड) 12 बफर.
    2. 1 एम NaOH के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर कृत्रिम लार समाधान की दुकान
    3. समाधान का उपयोग करने से पहले, सोडियम फ्लोराइड (NAF, 300 पीपीएम) जोड़ें.
  2. सीएस AMEL हाइड्रोजेल का आवेदन
    1. एक सिरिंज (चित्रा 1 बी) का उपयोग etched दांत टुकड़ा करने के बारे में 20 μl CS-AMEL हाइड्रोजेल लागू करें.
    2. 2 घंटे के लिए आरटी पर एक desiccator में हाइड्रोजेल से ढके दांत टुकड़ा सूखी.
    3. कृत्रिम लार समाधान के 30 मिलीलीटर युक्त एक बीकर को दांत टुकड़ा हस्तांतरण. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर को कवर, और उसके बाद 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में बीकर रखना.
    4. दांत टुकड़ा निकालें और आरटी पर एक desiccator में सूखा.

नव विकसित लेयर और मीना के बीच इंटरफेस की 4. विशेषता

नव विकसित परत और तामचीनी के बीच इंटरफेस के microstructure obser थाइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और उच्च क्रांति ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (HR-मंदिर) स्कैनिंग द्वारा वेद. मंदिर नमूना एक केंद्रित आयन बीम (FIB) तकनीक, जो इस प्रकार हैं के लिए कदम का उपयोग कर तैयार किया गया था.

  1. एक मिथ्या-SEM साधन नमूना में लोड और ऑपरेटिंग निर्देश के अनुसार सभी संरेखण खत्म. नोट: ललित जेड समायोजन में कम से कम 2 बार प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  2. आधारभूत संरचना (2A चित्रा) की रक्षा के लिए नमूना पर एक कार्बन परत (15 × 3 मीटर) जमा.
  3. मिल कार्बन परत के ऊपरी कम और सही पक्षों पर सावधानी से नमूना नमूना की एक पतली टुकड़ा तैयार करते हैं, और फिर इस पतले टुकड़े के नीचे की ओर कटौती करने के लिए. नोट: प्रत्येक मिलिंग कदम (चित्रा 2B) से पहले आयन बीम संरेखण की जाँच करें.
  4. वेल्ड एक पंडित पतले टुकड़े पर टिप और नमूना टुकड़ा (चित्रा -3 सी) अलग करने के लिए बाईं ओर काटा. नोट: वेल्डिंग कदम से पहले आयन बीम संरेखण की जाँच करें.
  5. टी लिफ्ट से बाहरवह धीरे धीरे नमूना के साथ टिप, और एक लिफ्ट से बाहर मंदिर ग्रिड पर परतदार नमूना माउंट पीटी.
  6. इसकी मोटाई कम से कम 100 एनएम (चित्रा 3 डी) है जब तक नमूना से टिप, और पतली नमूना अलग करें. मंदिर अवलोकन प्रदर्शन करने के साधन से नमूना निकालें. नोट: प्रत्येक thinning प्रक्रिया से पहले आयन बीम संरेखण की जाँच करें.

नव विकसित लेयर के बंधन और यांत्रिक गुणों के 5. आकलन

  1. बाध्यकारी शक्ति अल्ट्रासोनिक उपचार द्वारा मूल्यांकन किया है. 10 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर (42 kHz, 100 डब्ल्यू) में मरम्मत दांत टुकड़ा रखें, और फिर एक backscattered इलेक्ट्रॉन SEM विश्लेषण के साथ की मरम्मत परत और प्राकृतिक तामचीनी के बीच इंटरफेस का पालन.
  2. प्रत्येक मरम्मत तामचीनी सतह पर 20 परीक्षण अंक (n = 3) एक Berkovich टिप के साथ एक नैनो indenter द्वारा पर कठोरता और लोचदार मापांक उपाय.

6. Immunofluorescence धुंधला

  1. Tris buffe साथ दांत टुकड़ा धो लें15 मिनट के लिए आर खारा (टीबीएस).
  2. 15 मिनट के लिए टीबीएस में 1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ ब्लॉक.
  3. तरल निकालने और टीबीएस (0.1% बीएसए, 0.3% ट्राइटन X-100) में पतला 1 ° एबी (1:500 चिकन विरोधी Amelogenin) के साथ नमूना ओ / एन सेते हैं.
  4. 30 मिनट के लिए टीबीएस के साथ नमूना धो लें और टीबीएस में पतला 2 ° एबी (1:100 विरोधी चिकन FITC) के साथ हे / एन सेते हैं.
  5. 30 मिनट के लिए टीबीएस के साथ नमूना धो लें और एक और 30 मिनट के लिए सूखी छोड़.
  6. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से निरीक्षण करें.

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Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), चयनित क्षेत्र इलेक्ट्रॉन विवर्तन (SAED) और एक्स - रे विवर्तन (XRD) का विश्लेषण करती है स्कैनिंग द्वारा प्रदर्शन किया है. 7 दिनों के लिए amelogenin-chitosan (सीएस AMEL) हाइड्रोजेल द्वारा मरम्मत के बाद, 15 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक तामचीनी की तरह परत etched तामचीनी सतह पर बनाई गई थी. नव विकसित परत (चित्रा 3 ए में तीर) सतह को सीधा, C-अक्ष के साथ रियायत के तौर पर बढ़ रही है, 50 एनएम ~ की एक व्यास के साथ क्रिस्टल के अत्यधिक आदेश दिया सरणियों का बनाया गया था. यह इन सुई की तरह क्रिस्टल प्राकृतिक तामचीनी (3B चित्रा) की मौलिक इकाइयों के समान हैं जो बंडलों में आयोजित किए गए उल्लेखनीय है कि. मरम्मत की परत के SAED परिणाम [002] दिशा (चित्रा -3 सी) के साथ नव विकसित क्रिस्टल की एक श्रेणीबद्ध संरेखण खुलासा एक चाप के आकार का पैटर्न का प्रदर्शन किया. एक्सआरडी विश्लेषण नव विकसित परत एपेटाइट से बना था कि पुष्टि कीSEM और SEAD टिप्पणियों (चित्रा 3 डी) के अनुसार, crystallographic C-अक्ष के साथ गठबंधन किया गया है जो क्रिस्टल,.

चित्रा 4 नव विकसित परत और प्राकृतिक तामचीनी के बीच इंटरफेस के microstructure पता चलता है. क्रिस्टल मूल तामचीनी crystallites रूप में एक ही दिशाओं में विकसित नहीं किया है कि ध्यान दें. यह प्रोटीन की मध्यस्थता एपेटाइट विकास प्राकृतिक तामचीनी कण (चित्रा -4 ए) के सापेक्ष नव विकसित क्रिस्टल का एक सीधा अभिविन्यास में हुई कि देखा जा सकता है. सीए पी समूहों के स्थिरीकरण और amelogenin द्वारा उनके बाद आयोजन क्रिस्टलीकरण सहित प्रस्तावित मरम्मत तंत्र हमारे पिछले अध्ययन 16 में प्रस्तुत किया गया है. नवगठित और मूल क्रिस्टल के बीच भेद तामचीनी में और इनकार की मरम्मत की परत में क्रिस्टल के साथ हुई यह दर्शाता है कि अलग पैटर्न से पता चला है जो (FFT) विश्लेषण बदलना तेजी से फूरियर द्वारा उजागर किया गया हैअलग ओरिएंटेशन 16. इसके अलावा, मरम्मत की परत और तामचीनी सब्सट्रेट के बीच इंटरफेस में कोई स्पष्ट अंतर है. नैनो पैमाने पर, तामचीनी और regrown कण (चित्रा 4 बी में काला तीर) एक सहज इंटरफ़ेस के लिए फार्म का आपस में जुड़े हुए.

मरम्मत की परत और प्राकृतिक तामचीनी के बीच संबंध ताकत अल्ट्रासोनिक उपचार 16 से मूल्यांकन किया गया था. 10 मिनट के लिए sonication के बाद, सीएस AMEL हाइड्रोजेल में गठित नव विकसित परत अभी भी कसकर तामचीनी सतह (चित्रा 5A) के लिए बाध्य किया गया था, और संगठित संरचना (चित्रा 5 ब) संरक्षित किया गया था. Amelogenin बिना chitosan हाइड्रोजेल के साथ इलाज के नमूने के लिए, हालांकि, मीना और एक की मरम्मत की परत के बीच एक बड़ा अंतर अल्ट्रासोनिक उपचार (चित्रा 5C) निम्नलिखित मनाया गया.

स्पष्ट रूप से नव विकसित परत और प्राकृतिक तामचीनी, नई में amelogenin के बीच भेद करने के लिएly देसी परत Immunofluorescence चिह्नित किया गया. amelogenin की उपस्थिति नव विकसित परत में हरी immunofluorescence (चित्रा 6) द्वारा प्रदर्शन किया गया.

ऐसी कठोरता और नव विकसित परत की लोचदार मापांक के रूप में यांत्रिक गुणों nanoindentation परीक्षण 16 से विश्लेषण किया गया. एसिड तामचीनी सतह की कठोरता और मापांक क्रमश: लगभग 98% और 88% गिरावट आई नक़्क़ाशी निम्नलिखित, 7 चित्र में दिखाया गया है. amelogenin बिना chitosan हाइड्रोजेल द्वारा इलाज नियंत्रण समूह केवल कठोरता और मापांक दोनों में सीमित सुधार दिखाया. इसके विपरीत, सीएस AMEL हाइड्रोजेल में खनिज के बाद, हम एक मापांक में करीब 4 गुना की वृद्धि हुई है और कठोरता में 9 बार मनाया.

चित्रा 1
चित्रा 1. Amelogenin-chitosan (सीएस AMEL) एच के फोटो ydrogel एक ठेठ सीएस AMEL हाइड्रोजेल की. (ए) छवि. (बी) एक एसिड etched दांत टुकड़ा पर सीएस AMEL हाइड्रोजेल का अनुप्रयोग.

चित्रा 2
चित्रा 2. मंदिर नमूना तैयार करने के लिए ठेठ केंद्रित आयन बीम प्रक्रिया. मरम्मत तामचीनी सतह पर एक कार्बन परत की (ए) के बयान. (बी) नमूने की एक पतली टुकड़ा तैयार करने के लिए एक कार्बन की परत के आसपास सावधानी से नमूना मिलिंग. (सी) पतले टुकड़े पर पं. टिप वेल्डिंग. (डी) नमूना Thinning इसकी मोटाई कम से कम 100 एनएम है जब तक. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
7 दिनों के लिए amelogenin-chitosan हाइड्रोजेल में खनिज के बाद नव विकसित परत के चित्रा 3. विशेषता. (ए) amelogenin-chitosan हाइड्रोजेल, etched तामचीनी की सतह पर गठित एक तामचीनी की तरह परत के साथ खनिज के 7 दिनों के बाद. इनसेट नव विकसित परत की मोटाई से पता चलता है; आयत एक के लिए इसी क्षेत्र से पता चलता है. सफेद तीर नव विकसित परत में एपेटाइट झुकाव का संकेत मिलता है. संगठित क्रिस्टल का (बी) बंडल मरम्मत की परत के अंदर पाया गया. तीर नव विकसित परत के अंदर समानांतर क्रिस्टल की एक ठेठ बंडल को इंगित करें. इनसेट मरम्मत की परत के सजातीय सतह से पता चलता है. नव विकसित परत (सी) चयनित क्षेत्र इलेक्ट्रॉन विवर्तन (SAED) छवि. इनसेट केंद्रित आयन बीम (FIB) मिलिंग द्वारा तैयार की मरम्मत की परत का मंदिर छवि को दर्शाता है. नव विकसित परत (डी) एक्सआरडी स्पेक्ट्रा के बाद7 दिनों के लिए एक amelogenin-chitosan हाइड्रोजेल में खनिज. संदर्भ 16 से अनुमति के साथ Reproduced. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
नव विकसित परत और प्राकृतिक तामचीनी के बीच इंटरफेस की चित्रा 4. Microstructure की. प्राकृतिक तामचीनी की सतह के लिए जुड़े हुए नव विकसित परत दिखा 3 दिनों के लिए amelogenin-chitosan जेल में पुनर्खनिजीकरण के बाद मरम्मत की परत के (ए) क्रॉस अनुभाग SEM छवि. सफेद और काला तीर नव विकसित परत और प्राकृतिक तामचीनी में क्रिस्टल के crystallographic झुकाव का संकेत मिलता है, क्रमशः. इंटर की बिंदीदार रेखा प्राकृतिक तामचीनी और नव विकसित परत की सीमा से पता चलता है. (बी) HRTEM छवितामचीनी पर मरम्मत क्रिस्टल का सहज विकास दिखा, मीना और regrown क्रिस्टल के बीच का सामना. काला तीर regrown और तामचीनी क्रिस्टल के बीच इंटरफेस का संकेत मिलता है. संदर्भ 16 से अनुमति के साथ Reproduced.

चित्रा 5
चित्रा 5. नव विकसित परत और तामचीनी सतह के बीच शक्ति बाइंडिंग. पार अनुभाग, और (बी) chitosan-amelogenin हाइड्रोजेल प्राप्त के साथ एक ultrasonically इलाज नव विकसित परत की सतह के दूसरे इलेक्ट्रॉन छवि के (ए) backscattered इलेक्ट्रॉन छवि. इनसेट एक उच्च बढ़ाई सतह के ठेठ आकारिकी से पता चलता है. (सी) amelogenin बिना chitosan हाइड्रोजेल प्राप्त के साथ एक ultrasonically इलाज नव विकसित परत के पार अनुभाग के backscattered इलेक्ट्रॉन छवि. संदर्भ 16 से अनुमति के साथ Reproduced. <एक href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
नव विकसित परत के पार अनुभाग चित्रा 6. प्रतिदीप्ति छवियों. एक में आयत बी को इसी चयनित क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. बी में तीर तामचीनी सतह पर नव विकसित परत से संकेत मिलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
चित्रा 7. कठोरता और Elasस्वस्थ तामचीनी, etched तामचीनी, और साथ और amelogenin बिना chitosan हाइड्रोजेल द्वारा मरम्मत खंगाला तामचीनी की टिक मापांक. मांगपत्र क्षेत्र में पहले 19. संदर्भ 16 से अनुमति के साथ Reproduced सूचित किया गया है क्या करने के लिए इसी तरह की थी.

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Discussion

तामचीनी के खनिज सामग्री उच्च यह मानव शरीर में सबसे कठिन mineralized ऊतक बना रही है, वहीं इस bioceramic अक्सर दंत क्षय या कटाव के रूप में हो जो विखनिजीकरण प्रक्रियाओं, के लिए अतिसंवेदनशील है. जीन म्यूटेशन भी इनैमल का बनना imperfecta 20 बुलाया तामचीनी कुरूपता की विरासत में मिला रोगों की एक श्रृंखला के लिए अग्रणी पतली या मुलायम तामचीनी पैदा कर सकता है. फ्लोराइड या सीपीपी एसीपी युक्त मौखिक स्वास्थ्य देखभाल उत्पादों कई वर्षों प्रारंभिक तामचीनी घावों का पुनर्खनिजीकरण बढ़ावा देने के लिए (यानी, वार्निश, दांत pastes और mouthwashes) के लिए बाजार पर किया गया है. हालांकि, इन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों में से कोई भी संगठित एपेटाइट क्रिस्टल के गठन को बढ़ावा देने की क्षमता है. गहरे तामचीनी cavities के लिए परंपरागत उपचार यांत्रिक ड्रिलिंग और इस तरह के मिश्रण, चीनी मिट्टी या मिश्रित रेजिन के रूप में कृत्रिम सामग्री के साथ बाद में भरने शामिल है. इस तरह के दृष्टिकोण जल्दी घावों और मामलों के लिए आदर्श नहीं है जब बड़े गिरफ्तारीकटाव के ईएएस तामचीनी पर होते हैं. स्वस्थ तामचीनी की आय से अधिक राशि दांत को और अधिक नुकसान लाने हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि यह है. मिश्रण और समग्र रेजिन केवल अस्थायी 'मरम्मत' दांत और ऐसे भराई आम तौर पर दांत के क्षय को रोक नहीं है. मूल दांत की सतह और भरने सामग्री की है कि बीच में मजबूत आसंजन क्योंकि सामग्री संकोचन और रासायनिक संरचना और microstructure में मतभेद की एक चुनौती है.

सीएस AMEL hydrogel के लाभ

ऊपर चुनौतियों पर काबू पाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति सीधे प्राकृतिक सब्सट्रेट करने के लिए तंग रासायनिक संपर्क का गठन किया जा सकता है जब मूल तामचीनी सतह पर एक तामचीनी की तरह परत regrow करने के लिए है. इस वीडियो लेख में, हम एक तामचीनी सतह पर इन विट्रो में संगठित क्रिस्टल विकसित करने के लिए एक amelogenin-chitosan (सीएस AMEL) हाइड्रोजेल का उपयोग करता है कि एक उपन्यास तामचीनी पुनर्निर्माण रणनीति प्रस्तुत करते हैं. अन्य biomimetic treatme के साथ तुलना मेंएनटीएस, सीएस AMEL हाइड्रोजेल नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए तैयार करने के लिए आसान है. Biocompatibility और biodegradability इसके अलावा, यह दंत चिकित्सा अनुप्रयोगों 16 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि अद्वितीय रोगाणुरोधी और आसंजन गुण है. एक और लाभ यह कृत्रिम और प्राकृतिक तामचीनी क्रिस्टल के बीच मजबूत इंटरफ़ेस नव विकसित परत और दांत की सतह के बीच मजबूत संबंधों को बढ़ावा देता है. नैदानिक ​​दंत चिकित्सा में कमजोर संबंध वर्तमान में उपलब्ध सामग्री की बहाली में नाकामी के लिए एक मुख्य कारण है. गरीब आसंजन आमतौर पर बैक्टीरियल रिसाव और माध्यमिक क्षय के लिए खतरे को बढ़ा है, जो तामचीनी बहाली इंटरफेस में अंतराल में यह परिणाम है. इसलिए, सीएस AMEL हाइड्रोजेल में गठित नव विकसित परत की मजबूत लगाव बहाली के मार्जिन पर नए क्षय के गठन से बचने और पुनर्स्थापनों के स्थायित्व में सुधार करने की क्षमता है.

चुनौतियां और भविष्य की योजनाएं

AM द्वारा मरम्मत के बादelogenin-chitosan हाइड्रोजेल, etched तामचीनी सतह के यांत्रिक गुणों उल्लेखनीय सुधार किया गया. सीएस AMEL हाइड्रोजेल मरम्मत तामचीनी क्योंकि तामचीनी संरचना 21 के लिए इसी तरह एपेटाइट क्रिस्टल का आयोजन बंडलों की काफी अधिक कठोरता और नियंत्रण के नमूने से लोचदार मापांक से पता चला है. तकनीक हालांकि निम्नलिखित सीमाएँ हैं: (i) कठोरता और मापांक अभी भी कारण जैविक सामग्री और heirarchial प्रिज्मीय-interprismatic संरचना के अभाव की उपस्थिति के लिए प्राकृतिक स्वस्थ तामचीनी के स्तर को पूरा नहीं करते; (Ii) समय की विस्तारित राशि (3-7 दिन) को पूरा करने के हाइड्रोजेल और खनिज सुखाने के लिए की जरूरत है.

आगे के अध्ययन के ऊपर सीमाओं को पार करने की जरूरत है. यांत्रिक गुणों में सुधार करने के लिए एक संभावित रणनीति एक मोटा मरम्मत परत प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी तरीके के रूप में सीएस AMEL हाइड्रोजेल के दोहराया आवेदन किया जाएगा. खनिज प्रक्रिया के दौरान जैविक सामग्री का पाचन एक और रणनीति हैयांत्रिक गुणों में सुधार के लिए tegy. प्रयोगों हाइड्रोजेल के सूखने समय के साथ ही खनिज प्रगति 22 को छोटा करने का कार्य प्रगति पर हैं. इसके अलावा, यह क्रिस्टल विकास पर लार प्रोटीन के प्रभाव के लिए खाते में है कि एक क्षय मॉडल प्रणाली विकसित करने के लिए आवश्यक है.

गंभीर कदम और कारकों

तामचीनी पुनर्निर्माण, एक घने इंटरफेस के साथ एक तामचीनी की तरह परत को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक के लिए CS-AMEL हाइड्रोजेल की तैयारी में कारण chitosan और amelogenin 16 के बीच पीएच निर्भर बातचीत करने हाइड्रोजेल का पीएच मान समायोजन है. Chitosan β-1 ,4-glycosidic बांड द्वारा एक साथ शामिल हो गए glucosamine और N-acetyl glucosamine अवशेषों शामिल एक रेखीय श्रृंखला polysaccharide है. क्योंकि इसके एमिनो समूहों की, chitosan के रासायनिक और भौतिक गुण मीडिया का पीएच मान अलग से देखते जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक सीएस AMEL प्रणाली में, कम पीएच मान पर, गhitosan हालांकि 5.5 से अधिक पीएच, electrostatic बातचीत के माध्यम से amelogenin के साथ बातचीत की, chitosan बातचीत कारण इसकी कम घुलनशीलता और deprotonation 16 से कमजोर था. यह पीएच जवाबदेही सुविधा chitosan हाइड्रोजेल न केवल एक आदर्श amelogenin वाहक है, बल्कि कटाव से तामचीनी की रक्षा के लिए एक प्रभावी परत बना देता है. एक अम्लीय मौखिक वातावरण में, chitosan के अमीनो समूह एक सकारात्मक तामचीनी सतह को हाइड्रोजन आयनों के प्रसार को रोकने के लिए बाधा है, साथ ही लार में अपने नुकसान से बचने के लिए amelogenin के साथ बातचीत के गठन, हाइड्रोजन आयनों पर कब्जा कर सकता. सामान्य पीएच लार से पुनर्स्थापित किया जाता है amelogenin तामचीनी के regrowth को नियंत्रित करने के लिए सीएस AMEL हाइड्रोजेल से जारी है.

तामचीनी regrowth के दौरान, amelogenin उपस्थिति एपेटाइट क्रिस्टल के उन्मुख और लम्बी वृद्धि को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है. एक सीएस AMEL hydrogel में, amelogenin, कुल द्वारा स्थिर पूर्व न्यूक्लिएशन सीए पी समूहों, लिन के लिए फार्मअंततः आगे तामचीनी क्रिस्टल के साथ फ्यूज और तामचीनी की तरह एपेटाइट क्रिस्टल 16,23-24 में बदल देती है जो कान जंजीरों. क्रिस्टल के निरंतर विकास के नव विकसित परत और तामचीनी के बीच एक उत्कृष्ट बंधन को बढ़ावा देता है जो एक घने इंटरफ़ेस, रूपों.

संक्षेप में, हम सतही तामचीनी पुनर्निर्माण के लिए एक आशाजनक amelogenin-chitosan (सीएस AMEL) हाइड्रोजेल परिचय. हाइड्रोजेल में गठित आयोजन तामचीनी की तरह microstructure काफी etched तामचीनी के यांत्रिक गुणों में सुधार कर सकते हैं; इस बीच, मरम्मत परत की मजबूत लगाव बहाली के मार्जिन पर नए क्षय के गठन से बचने और संभावित बहाली के स्थायित्व में सुधार कर सकते हैं.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human third molar  Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California  N/A The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board.
Recombinant pocine amelogenin Expression and purification  in lab N/A rP172, full-length 
Chitosan  Sigma-Aldrich 448877 Medium molecular weight, 75-85% deacetylated
Phosphoric acid  VWR AA033266
Acetic acid glacial VWR A036289
Sodium hydroxide VWR BDH9292
Calcium chloride  Sigma-Aldrich 223506
Dibasic sodium phosphate anhydrous VWR BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP  Agilent Technologies Inc. 230255
Ammonium sulfate VWR BDH8001
Trifluoroacetic acid VWR AAAL06374
Acetonitrile VWR BDH1103
Magnesium chloride  VWR BDH0244
Potassium dihydrogen phosphate  VWR BDH9268
Potassium chloride  VWR BDH0258
Ammonium chloride  VWR AAAA15000
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) VWR AAA14777
Sodium fluoride  VWR AA11561
Tris-buffered saline Bio-Rad 170-6435 10× TBS
Bovine serum albumin EMD Millipore  12659 CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals 
Triton X-100 EMD Millipore  TX1568-1
Chicken Anti-Amelogenin N/A N/A A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California
Bovine Anti-Chicken IgY-FITC Santa Cruz Biotechnology Sc-2700
High Performance Liquid Chromatography System Agilent Technologies Inc. Varian Prostar 210
C4 column Phenomenx  Jupiter 5μ 300A
Scanning Electron Microscopy  JEOL  JSM-7001
FIB-SEM  JEOL  JIB-4500
Transmission Electron Microscopy  JEOL JEM-2100F
Digital low speed diamond saw MTI Corporation SYJ-150
Fluorescence microscopy Leica DMI3000 B
Ultrasonic cleaner  Branson  2510 42 kHz, 100 W
Nano-indenter  Agilent Technologies Inc. MTS XP

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जैव अभियांत्रिकी अंक 89 मीना Amelogenin Chitosan हाइड्रोजेल एपेटाइट Biomimetic कटाव सतही तामचीनी पुनर्निर्माण घने इंटरफ़ेस
के लिए Amelogenin-chitosan hydrogel के विकास<em&gt; इन विट्रो</emएक घने इंटरफेस के साथ&gt; तामचीनी Regrowth
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Ruan, Q., Moradian-Oldak, J.… More

Ruan, Q., Moradian-Oldak, J. Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface. J. Vis. Exp. (89), e51606, doi:10.3791/51606 (2014).

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