Summary
I denne artikel beskriver vi en protokol for at fabrikere en amelogenin-chitosan hydrogel for overfladisk emalje genopbygning. Organiseret i situ vækst i apatitkrystaller i hydrogel dannede en tæt emalje-restaurering interface, hvilket vil forbedre effektiviteten og holdbarheden af restaureringer.
Protocol
De menneskelige kindtænder blev udtrukket efter standardprocedurer for udvinding på Ostrow Tandlægeskolen ved University of Southern California og håndteres med godkendelse af Institutional Review Board.
1.. Udarbejdelse af Syre-ætset Tooth Slice
- Vælg en menneskelig tredje kindtand uden restaurerede caries.
- Fjern roddelen af den molære og skæres kronen af det molære længderetningen i skiver 2 mm tyk ved anvendelse af en vandkølet lav hastighed diamantsav. Rengøres med ultralyd disse skiver i 2 min, og skyl dem med deioniseret vand 3 gange.
- At simulere eroderende læsioner, ætse tand skiver med 30% fosforsyre i 30 sek derefter straks skylle dem med demineraliseret vand.
- Ultralyd rense ætset skiver i 2 min, og skyl dem med deioniseret vand 3 gange.
2. Fremstilling af Amelogenin-chitosan Hydrogel
- FORBEREDELSEn af chitosan stamopløsning
- Opløs 1% (w / v) chitosan (middel molekylvægt, 75-85% deacetyleret) i en 1% (v / v) eddikesyre efterfulgt af omrøring ved 80 ° CO / N.
- Efter afkøling af opløsningen til stuetemperatur, foretage chitosan-opløsningen ved anvendelse af et 0,45 um filter. Juster pH-værdien til 5,0 ved tilsætning af 1 M NaOH-opløsning.
- Fremstilling af calcium og fosfat stamopløsning (0,1 M)
- Afvej calciumchlorid (CaCl2) og forberede en 0,1 M opløsning, bland derefter ved hjælp af en hvirvel, indtil opløsningen er klar. Juster pH-værdien til 11 ved tilsætning af 1 M NaOH-opløsning.
- Afvejes dinatriumphosphat (Na 2 HPO 4) og forberede en 0,1 M opløsning, bland derefter ved hjælp af en hvirvel, indtil opløsningen er klar.
- Ekspression og oprensning af rekombinant amelogenin 17-18
Den rekombinante fuld længde porcin amelogenin (rP172) anvendt her har 172 aminosyrer og er en analog af fuldLængde nativ porcin p173, men mangler den N-terminale methionin samt en phosphatgruppe på Ser16 18.- Der tilsættes 20 g lysogeni bouillon (LB) agar pulver i 500 ml deioniseret vand, autoklavere opløsningen ved 121 ° C (flydende indstilling) i 20 min. Lad agar afkøles til ~ 55 ° C, tilsættes ampicillin (100 ug / ml) i agaropløsning.
- Overfør agar løsning på petriskåle, så lad hver plade køle indtil det er fast, derefter vende for at undgå kondens på agaren. Store plader i plastposer ved 4 ° C.
- Streak LB agarplade med rekombinante celler (E. coli-BC21) fra glycerol stock (-80 ° C). Pladerne inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Forbered 50 ml NZCYM medier og autoklaveres mediet ved 121 ° C i 30 minutter. Tillad medierne til at afkøle, der tilsættes 50 pi 100 ug / ml ampicillin til 50 ml medier.
- Inokulering af en enkelt koloni fra LB-agarplade i 50 ml NZCYM medium suppleret med ampicilli. inkuberes cellerne O / N i en rysteinkubator ved 37 ° C.
- Klargør 1 L NZCYM medier og autoklaveres mediet ved 121 ° C i 30 minutter. Tilsæt 1 ml af 100 mg / ml ampicillin til 1.000 ml medier. Tag en optisk densitet (OD) læsning som en blank ved hjælp af et UV-Vis spektrofotometer. BEMÆRK: Smid ikke dette efter førstebehandlingen.
- Inokulere 10 ml af cellekultur fra trin 2.3.5 i 1.000 ml medium fra trin 2.3.6. Aflæs den optiske densitet ved 595 nm straks efter podning. Tag absorbansaflæsning jævne mellemrum for at holde styr på væksten. BEMÆRK: Læse emnet hver gang OD tages.
- Fremkalde med 700 pi isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG, 1 M), når bakterievæksten når til omkring 0,75 ~ 0,8 OD ved 595 nm.
- Cellerne høstes, når OD når 1.1. Hæld indholdet af kolben i 6 plastflasker. Balance og vejer flaskerne, før du bruger centrifugen. Centrifuger i 20 minutter ved 8554 xg ved 4 ° C.Hold cellepelleten i -20 ° CO / N.
- Tag cellepellets og kombinere dem i et 50 ml rør. Tilføj 3,5 ml 4M guanidin HCl pr L fermentering. Soniker 2-3 gange på is, 30 sek hver gang, med 1 min intervaller.
- Gør 6x fortyndinger af cellevolumen med 0,5% myresyre og lade den omrøre i koldt rum i 2 timer. Centrifuger i 30 minutter, 8554 x g ved 4 ° C. Opbevar supernatanten. Tilsæt 20% mættet ammoniumsulfat ved hjælp af mættet stamopløsning og røre i det kolde rum, O / N.
- Centrifuger i 30 minutter, 8554 x g ved 4 ° C og holde pellet. Rekonstituer pellets i 0,1% trifluoreddikesyre (TFA), belastning på en C4-søjle (10 x 250 mm, 5 um), og fraktionere ved hjælp af en lineær gradient af A = 0,1% TFA og B = 60% acetonitril i TFA ved en strømningshastighed på 1,5 ml · min-1.
- Frys proteinopløsningen på tøris og lyofiliseres den frosne prøve O / N.
- Udarbejdelse af amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel (figur 1A)
- Tilsæt 200 ug rp172 i et rør indeholdende 960 pi af 1% chitosan opløsning, bland derefter ved hjælp af en hvirvel, indtil opløsningen er klar.
- Tilsæt 25 gl 0,1 M CaCl2-opløsning efterfulgt af 15 pi 0,1 M Na 2 HPO 4 løsning amelogenin indeholder chitosanopløsning, derefter blandes ved hjælp af en vortex i 5 minutter.
- PH indstilles CS-AMEL løsning på 6,5 ved forsigtig tilsætning af 1 M NaOH-opløsning. CS-AMEL hydrogel vil dannes, når pH-værdien når 6,5.
3.. Emalje genvækst i Amelogenin-chitosan Hydrogel
- Udarbejdelse af kunstigt spyt løsning
- Opløs en vis mængde magnesiumchlorid (MgCl2, 0,2 mM), calciumchlorid (CaCl2, 1 mM), kaliumdihydrogenphosphat (KH 2PO 4, 4 mM), kaliumchlorid (KCI, 16 mM) og ammoniumchlorid ( NH4CI, 4,5 mM) i 20 mM HEPES(4 - (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre) buffer 12.
- PH justeres til 7,0 med 1 M NaOH, og gemme kunstigt spyt opløsning ved 4 ° C.
- Før du bruger opløsningen, tilsættes natriumfluorid (NaF, 300 ppm).
- Anvendelse af CS-AMEL hydrogel
- Ansøg om 20 ul CS-AMEL hydrogel til den ætsede tand skive med en sprøjte (Figur 1B).
- Tør hydrogel-dækket tand skive i en ekssikkator ved stuetemperatur i 2 timer.
- Overfør tand skive til en beholder, som indeholder 30 ml kunstigt spyt løsning. Bægerglasset dækkes med aluminiumsfolie, og derefter holde bægeret i en ovn ved 37 ° C i 7 dage.
- Fjern tand skive og tør det i en ekssikkator til stuetemperatur.
4.. Karakterisering af Interface mellem Nyligt Grown Layer og emalje
Mikrostrukturen af grænsefladen mellem den nyligt dyrket lag og emalje var observationaba ved scanning elektronmikroskopi (SEM) og høj revolution transmissionselektronmikroskopi (HR-TEM). TEM prøve blev fremstillet ved anvendelse af en fokuseret ion beam (FIB) teknik, trin for der er som følger.
- Load prøven i et FIB-SEM instrument og afslutte alle de tilpasninger i henhold til brugsanvisningen. BEMÆRK: Fin Z justering skal udføres mindst 2 gange.
- Deponere et kulstof lag (15 × 3 um) på prøven for at beskytte den underliggende struktur (figur 2A).
- Mill prøven nøje på de øverste, nederste og højre side af kulstof lag at forberede et tyndt stykke prøve, og skære den nederste side af denne tynde stykke derefter. BEMÆRK: Kontroller Ion lyshøjden før hver formaling trin (figur 2B).
- Weld en Pt tip på tyndt stykke og skæres venstre side for at separere stykke (figur 3C). BEMÆRK: Kontroller ionstrålen tilpasningen før svejsning trin.
- Løft than pt tip med prøven langsomt, og monter lamelagtige prøve på en lift-out TEM gitter.
- Frigør tip fra prøven, og tynd prøven, indtil dens tykkelse er mindre end 100 nm (figur 3D). Prøven fjernes fra instrumentet til at udføre TEM observation. BEMÆRK: Kontroller Ion lyshøjden før hver udtynding proces.
5.. Vurdering af Bogbinding og mekaniske egenskaber af Newly Grown Layer
- Bindingsstyrken vurderes ved ultralydsbehandling. Hold repareret tand skive i en ultralydsrenser (42 kHz, 100 W) i 10 min, og derefter observere grænsefladen mellem det reparerede lag og naturlig emalje med en tilbagekastet-elektron SEM analyse.
- Mål hårdhed og elasticitetsmodul på 20 test punkter på hver repareret emalje overflade (n = 3) med en nano-indrykning med en Berkovich spids.
6.. Immunfluorescensfarvning
- Vask tand skive med Tris buffer saltvand (TBS) i 15 min.
- Blok med 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBS i 15 min.
- Fjern væsken og inkuberes prøven O / N med 1 ° Ab (1:500 Chicken Anti-Amelogenin) fortyndet i TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Vask prøven med TBS i 30 minutter og inkuberes O / N med 2 ° Ab (1:100 anti-kylling FITC) fortyndet i TBS.
- Vask prøven med TBS i 30 min og lad det tørre for en anden 30 min.
- Observere ved fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten af protokollen beskrevet her er påvist ved scanning elektronmikroskopi (SEM), valgte område elektrondiffraktion (Sæd) og røntgendiffraktion (XRD) analyser. Efter reparation af amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel i 7 dage blev en emalje-lignende lag med en tykkelse på 15 pm dannet på den ætsede emalje overflade. Den nyligt dyrket lag fremstillet af meget ordnede opstillinger af krystaller med en diameter på ~ 50 nm, vokser fortrinsvis langs c-aksen vinkelret på overfladen (pile i figur 3A). Det er bemærkelsesværdigt, at disse nålelignende krystaller blev organiseret i bundter, der svarer til de grundlæggende enheder af naturlig emalje (figur 3B). Den Saed følge af repareret lag udviste en bueformet mønster afslører en hierarkisk tilpasning af de nyligt dyrkede krystaller langs [002]-retning (figur 3C). XRD-analyse bekræftede, at den nyligt dyrket lag blev sammensat af apatitkrystaller, der blev linie langs den krystallografiske c-akse i overensstemmelse med SEM og SEAD observationer (figur 3D).
Figur 4 viser mikrostrukturen af grænsefladen mellem den nyligt dyrket lag og naturlig emalje. Bemærk, at krystallerne ikke vokse i de samme retninger som originale emalje crystallites. Det kan ses, at protein-medieret apatit vækst resulterede i en vinkelret orientering af nyligt dyrkede krystaller i forhold til de naturlige emalje krystaller (figur 4A). De foreslåede reparation mekanismer, herunder stabilisering af Ca-P-klynger og deres efterfølgende organiseret krystallisation ved amelogenin er blevet præsenteret i vores tidligere undersøgelse 16. Sondringen mellem nydannede og originale krystaller er blevet afsløret af den hurtige Fourier transformation (FFT) analyse, som viste forskellige mønstre, der angiver, at de krystaller i emalje og i smeltet repareret lag voksede medforskellig orientering 16. Desuden er der tilsyneladende ingen mellemrum ved grænsefladen mellem det reparerede lag og emalje substrat. På nanoskala, emalje og regrown krystaller fusioneret sammen til dannelse af en sømløs grænseflade (Sorte pile i figur 4B).
Limningsstyrken mellem det reparerede lag og naturlig emalje blev vurderet ved ultralyd behandling 16. Efter sonikering i 10 minutter blev den nyligt dyrket dannet i CS-AMEL hydrogel stadig tæt bundet til emaljeoverfladen (figur 5A), og den organiserede struktur blev bevaret (figur 5B). For prøven behandlet med chitosan hydrogel uden amelogenin dog en stor kløft mellem emalje og en repareret lag blev observeret efter ultralyds behandling (figur 5C).
At skelne klart mellem den nyligt vokset lag og den naturlige emalje, amelogenin i den nyely-dyrket lag blev Immunofluorescence mærkes. Tilstedeværelsen af amelogenin blev påvist ved den grønne immunofluorescens i den nyligt dyrket lag (figur 6).
Mekaniske egenskaber, såsom hårdhed og elasticitetsmodul af den nyligt dyrket lag blev analyseret ved nanoindentation test 16. Som vist i figur 7, efter syreætsning hårdhed og modulus af emaljeoverfladen faldt næsten 98% og 88%, hhv. Kontrolgruppen behandles ved chitosan hydrogel uden amelogenin viste kun begrænset forbedring i både hårdhed og modulus. I modsætning hertil efter mineralisering i CS-AMEL hydrogel, observerede vi en stigning på næsten 4 gange i modulus og 9 gange i hårdhed.
Figur 1.. Fotografier af amelogenin-chitosan (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Billede af en typisk CS-AMEL hydrogel. (B) Anvendelse af CS-AMEL hydrogel på en syre-ætset tand skive.
Figur 2.. Typisk fokuseret-ion-beam proces til TEM prøveforberedelse. (A) Deponering af en carbon-lag på repareret emaljeoverfladen. (B) formaling af prøven omhyggeligt omkring en carbon-lag til fremstilling af et tyndt stykke af prøven. (C) Svejsning Pt tip på tyndt stykke. (D) Fortynding af prøven indtil dens tykkelse er mindre end 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3.. Karakterisering af nyligt vokset lag efter mineralisering i amelogenin-chitosan hydrogel i 7 dage. (A) Efter 7 dages mineralisering med amelogenin-chitosan hydrogel, en emalje-lignende dannet på overfladen af den ætsede emalje. Indsat viser tykkelsen af nyligt vokset lag; rektangel viser det område, der svarer til A. Hvide pile angiver apatit retningslinjerne i den nyligt vokset lag. (B) Bundter af organiserede krystaller blev fundet inde i reparerede lag. Pilene peger på et typisk bundt af parallelle krystaller inde i nyligt dyrket lag. Indsat viser den homogene overflade repareret lag. (C) Valgt område elektron diffraktion (Saed) billede af den nyligt vokset lag. Indsat viser TEM billede af den reparerede lag udarbejdet af fokuserede ion beam (FIB) fræsning. (D) XRD spektre af nyligt vokset lag eftermineralisering i et amelogenin-chitosan hydrogel i 7 dage. Gengivet med tilladelse fra henvisning 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Mikrostruktur af grænsefladen mellem den nyligt vokset lag og naturlig emalje. (A) Tværsnit SEM billede af repareret lag efter remineralisering i amelogenin-chitosan-gel i 3 dage, viser nyligt dyrket lag fusioneret til overfladen af den naturlige emalje. De hvide og sorte pile angiver de krystallografiske orienteringer af krystallerne i den nyligt vokset lag og naturlig emalje, hhv. Den stiplede linje viser grænsen af den naturlige emalje og den nyligt dyrket lag. (B) HRTEM image interstår mellem emalje og regrown krystal, viser sømløs vækst repareret krystal på emaljen. De sorte pile angiver grænsefladen mellem regrown og emalje krystaller. Gengivet med tilladelse fra henvisning 16.
Figur 5.. Bindende styrkeprøve mellem nyligt vokset lag og emalje overflade. (A) tilbagekastet elektron billede af tværsnit, og (B) anden elektron billede af overfladen af en ultralyd-behandlede nyligt dyrket lag opnået med chitosan-amelogenin hydrogel. Indsat viser den typiske morfologi på overfladen ved en større forstørrelse. (C) tilbagekastet elektron billede af tværsnit af en ultralyd-behandlede nyligt dyrket lag opnået med chitosan hydrogel uden amelogenin. Gengivet med tilladelse fra henvisning 16.. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Fluorescensbilleder af tværsnittet af den nyligt dyrket lag. Rektangel i A repræsenterer det valgte område, der svarer til B. Pilene i B angiver den nyligt vokset lag på emaljen overfladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Hårdhed og elastisktic modul sund emalje, ætset emalje og rekonstruerede emalje repareres af chitosan hydrogel med og uden amelogenin. Den led området var magen til hvad der tidligere er rapporteret 19. Gengivet med tilladelse fra henvisning 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens mineral indholdet af emalje høj gør det hårdest mineraliseret væv i det menneskelige legeme, dette biokeramiske er modtagelig for Demineraliseringsanlæg processer, der ofte forekommer som karies eller erosion. Genmutationer kan også forårsage tynde eller bløde emalje, der fører til en række af arvelige sygdomme emalje misdannelse kaldet amelogenesis imperfecta 20. Oral sundheds-produkter, der indeholder fluorid eller CPP-ACP har været på markedet i flere år (dvs., lakker, tandpasta og mundskyllevand) til at fremme remineralisering af indledende emalje læsioner. Men ingen af disse kommercielt tilgængelige produkter har potentialet til at fremme dannelsen af organiserede apatitkrystaller. De konventionelle behandlinger for dyb emalje hulrum involverer mekanisk boring og efterfølgende påfyldning med kunstige materialer såsom amalgam, keramik eller komposit harpiks. En sådan fremgangsmåde er ikke ideel for tidlige læsioner og tilfælde, hvor stort areas erosion forekommer på emalje. Dette skyldes, at en uforholdsmæssig stor del af sund emalje skal fjernes bringe mere skade på tanden. Amalgam og komposit harpiks kun midlertidig »reparation« tanden, og sådanne fyldninger typisk ikke stoppe tandens forfald. Robust vedhæftning mellem original tand overflade og at af de fyldningsmaterialer er en udfordring på grund af materiale svind og forskelle i kemisk sammensætning og mikrostruktur.
Fordele ved CS-AMEL Hydrogel
En alternativ strategi til at overvinde de ovennævnte udfordringer er at regrow en emalje-lignende lag direkte på den oprindelige emalje overflade, når der kan dannes stramt kemisk kontakt til det naturlige substrat. I denne video artikel præsenterer vi en ny emalje rekonstruktion strategi, der bruger en amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel til at vokse organiserede krystaller in vitro på en emalje overflade. Sammenlignet med andre biomimetisk treatmeNTS, CS-AMEL hydrogel er lettere at forberede til klinisk brug. Udover biokompatibilitet og bionedbrydelighed, det har unikke antimikrobielle og vedhæftning egenskaber, der er vigtige for dental applikationer 16. En anden fordel er, at den robuste grænseflade mellem syntetiske og naturlige emalje krystaller fremmer en stærk binding mellem den nyligt dyrket lag og tandoverfladen. I klinisk tandpleje svage limning er en væsentligste årsag til svigt af de aktuelt tilgængelige materialer restaurering. Dårlig vedhæftning normalt resulterer i huller i emaljen-restaurering interface, hvilket øger risikoen for bakteriel lækage og sekundær karies. Derfor er den robust fastgørelse af den nyligt vokset lag dannet i CS-AMEL hydrogel har potentiale til at undgå dannelsen af nye caries på marginen af restaureringen og forbedre holdbarheden af restaureringer.
Udfordringer og fremtidige planer
Efter reparation af AMelogenin-chitosan hydrogel blev de mekaniske egenskaber af den ætsede emaljeoverflade bemærkelsesværdigt forbedret. CS-AMEL hydrogel-repareret emalje viste signifikant større hårdhed og elasticitetsmodul end kontrolprøver på grund af de organiserede bundter af apatitkrystallerne ligner emalje struktur 21. Den teknik har imidlertid følgende begrænsninger: (i) hårdhed og modulus stadig ikke opfylder niveauet af naturlig sund emalje på grund af tilstedeværelsen af organisk materiale og manglende heirarchial prismatisk-interprismatic struktur; (Ii) forlænget tid (3-7 dage) nødvendig for tørring af hydrogelen og mineralisering at fuldføre.
Yderligere undersøgelser er nødvendige for at overvinde de ovennævnte begrænsninger. En mulig strategi for at forbedre de mekaniske egenskaber vil være den hyppige anvendelse af CS-AMEL hydrogel som en effektiv måde at få en tykkere repareret lag. Spaltning af det organiske materiale under mineraliseringen er et andet strategi for at forbedre mekaniske egenskaber. Eksperimenter er i gang for at forkorte tørretiden af hydrogel samt mineralisering fremskridt 22.. Desuden er det nødvendigt at udvikle en caries modelsystem, der tegner sig for virkningen af spytproteiner på krystalvækst.
Kritiske stadier og faktorer
Ved udarbejdelsen af CS-AMEL hydrogel for emalje genopbygning, en af de mest kritiske trin for at opnå en emalje-lignende lag med en tæt interface er justering af pH værdien af hydrogel på grund af pH-afhængig interaktion mellem chitosan og amelogenin 16. Chitosan er en lineær kæde polysaccharid omfatter glucosamin og N-acetyl-glucosamin-rester sammen af β-1 ,4-glycosidiske bindinger. På grund af dens aminogrupper, kan de kemiske og fysiske egenskaber af chitosan indstilles ved at variere pH-værdierne af medierne. For eksempel i en CS-AMEL system ved lavere pH-værdier, chitosan interageret med amelogenin gennem elektrostatisk interaktion, men ved pH højere end 5,5, chitosan interaktion var svag på grund af sin lave opløselighed og deprotonation 16. Denne pH-reaktionsevne funktion gør chitosan hydrogel ikke blot en ideel amelogenin bærer, men også en effektiv lag beskytter emalje mod erosion. I et surt orale miljø, kunne aminogruppen af chitosan fange hydrogenioner, der danner en positiv barriere for at forhindre diffusion af hydrogenioner til emaljeoverfladen, samt interaktion med amelogenin at undgå tabet i spyt. Når den normale pH genoprettes ved spyt amelogenin frigives fra CS-AMEL hydrogel at kontrollere genvækst af emalje.
Under emalje genvækst amelogenin tilstedeværelse er en kritisk faktor for at kontrollere orienterede og aflange vækst apatitkrystaller. I en CS-AMEL hydrogel, at de præ-kernedannelsespunkterne Ca-P-klynger, stabiliseret af amelogenin, aggregat danne linøre kæder, som yderligere sikring med emalje krystaller og i sidste ende forvandler ind til emalje-lignende apatitkrystaller 16,23-24. Den fortsatte vækst af krystaller danner en tæt grænseflade, som fremmer en fremragende binding mellem den nyligt vokset lag og emalje.
Sammenfattende vi indføre en lovende amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel for overfladisk emalje genopbygning. Den organiserede emalje-lignende mikrostruktur dannet i hydrogelen kan forbedre de mekaniske egenskaber af ætset emalje; i mellemtiden, kan den robuste fastgørelse af det reparerede lag undgå dannelsen af nye caries på marginen af restaureringen og potentielt forbedre holdbarheden af restaureringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
