Summary
नवजात चूहों के extrahepatic पित्त नलिकाओं से cholangiocytes अलग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन किया है. नलिकाओं सावधानी से विच्छेदित कर रहे हैं, और फिर कोशिकाओं मोटी कोलेजन जैल में परिणाम के द्वारा अलग कर रहे हैं. इस विधि में extrahepatic पित्त नली विकास और विकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
Abstract
जिगर के अंतर और extrahepatic पित्त नलिकाओं developmentally अलग कर रहे हैं, और विभिन्न प्रकार से कुछ बीमारियों से प्रभावित हो सकता है. हालांकि, अंतर और extrahepatic cholangiocytes, और नवजात और वयस्क कोशिकाओं के बीच के बीच मतभेद है, अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं.
Intrahepatic पित्त नलिकाओं से cholangiocytes के अलगाव के लिए तरीकों अच्छी तरह से 1-4 स्थापित कर रहे हैं. इस विशिष्ट cholangiocyte आबादी के बीच अंतर को समझने में और extrahepatic नलिकाओं को लक्षित करने के लिए दिखाई देते हैं कि इस तरह के पित्त अविवरता जैसे रोगों का अध्ययन करने में काफी लाभ होगा, हालांकि विशेष रूप से नवजात शिशु से extrahepatic वाहिनीपरक कोशिकाओं के अलगाव, अभी तक, वर्णित नहीं किया गया है. नवजात और वयस्क माउस दोनों extrahepatic पित्त नली कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक अनुकूलित तकनीक यहाँ है वर्णित है. इस तकनीक fibroblasts तरह mesenchymal कोशिकाओं से कम से कम प्रदूषण के साथ एक शुद्ध सेल आबादी पैदावार.
इस methoडी सूक्ष्म विच्छेदन और वसा और fibroblast परतों को हटाने के लिए scraping द्वारा पीछा extrahepatic नलिकाएं और पित्ताशय की थैली, को हटाने पर आधारित है. संरचनाएं प्रायोगिक इस्तेमाल के लिए तो trypsinized किया जा सकता है और चढ़ाया रहे हैं जो monolayers में cholangiocytes, के परिणाम अनुमति देने के लिए लगभग 3 सप्ताह के लिए कोलेजन और सुसंस्कृत की मोटी परतों में एम्बेडेड रहे हैं.
Introduction
अंतर और extrahepatic cholangiocytes की उत्पत्ति और विकास स्पष्ट रूप से अलग हैं. जिगर उदर अग्रांत्र अन्तर्जनस्तर 5 के एक diverticulum से विकसित करता है. कपाल क्षेत्र intrahepatic पित्त पेड़ 5 उत्पन्न जबकि diverticulum की दुम क्षेत्र, extrahepatic पित्त पेड़ रूपों. Intrahepatic वाहिनी cholangiocytes पेरी पोर्टल क्षेत्रों 6 में ductal थाली के चारों ओर पूर्वज कोशिकाओं से निकाली गई है. इन कोशिकाओं को hepatocytes या cholangiocytes 6 या तो में अंतर करने की क्षमता है. इस cholangiopathies विशेष रूप से cholangiocytes के एक वर्ग को लक्षित कर सकते हैं कि दिए गए महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थ हैं. Alagille सिंड्रोम intrahepatic नलिकाओं को प्रभावित करता है, जबकि उदाहरण के लिए, पित्त अविवरता शुरू में, नवजात शिशु की extrahepatic नलिकाओं को प्रभावित करता है.
चूहों और चूहों से intrahepatic cholangiocytes और पित्त नली इकाइयों के अलगाव के कई वर्णन कर रहे हैं. मेंvestigators वाहिनी अलगाव और बाद के परिणाम के द्वारा एकल कक्षों पृथक, या जिगर पाचन और एंटीबॉडी द्वारा विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों 1-4 व्यक्त cholangiocytes के नीचे खींच लिया है. कार्यात्मक और ध्रुवीकृत पित्त नली इकाइयों जिगर पाचन और आकार निस्पंदन 7 से पृथक किया गया है. पित्त नली इकाइयों पृथक cholangiocytes विट्रो 1,2 में ductular संरचनाओं को विकसित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि उत्तेजनाओं स्रावी और तरल पदार्थ का स्राव 7 प्रदर्शित करने के लिए जवाब देने में सक्षम हैं. इन तरीकों की सीमाओं पाचन एंजाइमों के साथ जिगर छिड़काव के लिए विशेष तकनीकी विशेषज्ञता और विशेष उपकरणों की आवश्यकता शामिल हैं. इसके अलावा, mesenchymal कोशिकाओं 3 के साथ प्रदूषण का खतरा है.
विशेष रूप से नवजात extrahepatic पित्त नलिकाओं से, extrahepatic पित्त नली cholangiocytes अलग करने के लिए एक विधि है, पहले से वर्णित नहीं किया गया है. इस पत्र में नवजात एक अलग करने के लिए एक सरल तकनीक की रूपरेखाअच्छी तरह से शुद्धता के उच्च स्तर पर वयस्क extrahepatic पित्त नली कोशिकाओं के रूप में एस. इस तकनीक अंतर और extrahepatic cholangiocytes और extrahepatic नलिकाओं को नुकसान पित्त अविवरता जैसी बीमारियों के तंत्र में अनुसंधान के बीच मतभेद का अध्ययन की सुविधा होगी.
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Protocol
जब तक अन्यथा निर्दिष्ट पूरी प्रक्रिया में कमरे के तापमान पर किया जाता है. सभी जानवर का काम स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत मानवीय स्थितियों के तहत बाहर किया जाना चाहिए.
1. उपकरण तैयार करना और समाधान
- टिशू कल्चर हुड और इनक्यूबेटर (चित्रा 1 ए) के पास माउस शल्य तालिका सेट. नोट: आवश्यक उपकरण एक विदारक माइक्रोस्कोप, एक प्रकाश स्रोत, 12.5 सेमी लंबे सीधे परितारिका कैंची, ठीक सुझावों के साथ 6 इंच गैर दाँतेदार घुमावदार संदंश, और 4 इंच घुमावदार सुझावों (चित्रा 1 बी) के साथ दाँतेदार संदंश शामिल हैं.
- शल्य चिकित्सा की मेज पर 70% शराब की एक गिलास बीकर में निष्फल उपकरणों रखें.
- बाँझ अलगाव मीडिया (1 टेबल) के साथ तीन बाँझ 60 मिमी पेट्री डिश भरें; शल्य चिकित्सा की मेज पर दो और हुड में एक, बर्फ पर सभी जगह है.
- चूहे की पूंछ कोलेजन, जगहबाँझ 10x फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस), बाँझ पानी, बाँझ 1 एन NaOH और टिशू कल्चर हुड में पित्त उपकला कोशिका (बीईसी) मीडिया (1 टेबल). नोट: कोलेजन बर्फ पर होना चाहिए.
2. पित्त नली अलगाव और संस्कृति
- बेहोश IACUC दिशा निर्देशों (चित्रा 1C) के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, जब तक कार्बन डाइऑक्साइड के लिए जोखिम, जीवन के 0-3 दिनों के बीच नवजात चूहों euthanize.
नोट: बड़े चूहों विशिष्ट प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर किया जा सकता है. - लापरवाह स्थिति में पशु रखें और कमर के क्षेत्र में मध्यम रेखा पार कर एक छोटे क्षैतिज चीरा बनाते हैं. एक यू के आकार का फ्लैप बनाने, laterally और ऊपर पेट के दोनों ओर इस चीरा बढ़ाएँ. पेट अंगों को बेनकाब करने के लिए फ्लैप बढ़ाएं. पेट खुल जाने के बाद, ध्यान से जिगर और आम पित्त नली के बेहतर दृश्य के लिए पशु के सही पक्ष की ओर उदर गुहा के बाहर आंतों के लिए कदम. नोट: यह जिगर की बेहतर पहचान प्राप्त करने के लिए ribcage में पार्श्व चीरों का विस्तार करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग, आम पित्त नली, जिगर, और आंतों की पहचान. संरचनाओं बहुत नाजुक हैं, के रूप में सावधानी का उपयोग कर, पहले आम पित्त नली (चित्रा -1) को पहचानें. दाँतेदार और गैर दाँतेदार संदंश के साथ सावधानी से स्वच्छ और पित्त आसपास वसा सहित संयोजी ऊतक से उठा. वाहिनी और साफ करने के लिए अन्य धारण करने के लिए एक संदंश का प्रयोग करें.
- पित्ताशय की थैली को साफ करने के लिए इसी तरह की तकनीक का उपयोग करें.
- बर्फ पर अलगाव मीडिया के पहले डिश में साफ नलिकाएं और पित्ताशय की थैली में रखें. मीडिया में आगे संयोजी ऊतक को दूर करने और पित्ताशय की थैली से पित्त को दूर करते हुए धीरे गैर दाँतेदार संदंश के साथ संरचनाओं मालिश.
- अलगाव मीडिया के दूसरे डिश के लिए नलिकाएं और पित्ताशय की थैली स्थानांतरण.
- 5 जानवरों से नलिकाएं और gallbladders के अलगाव के बाद हस्तांतरणहुड में तीसरे पेट्री डिश के टुकड़े,. नोट: कोशिकाओं को अधिक से अधिक 5 जानवरों से अलग हो रहे हैं, तो 5 पशुओं के प्रत्येक समूह के लिए नए सिरे से समाधान का उपयोग, बैचों में करते हैं.
- टिशू कल्चर हुड में मोटी कोलेजन जैल तैयार:
नोट: किसी भी आकार पकवान इस्तेमाल किया जा सकता है. 5 नवजात शिशुओं के प्रत्येक समूह के लिए 3 मिलीलीटर कोलेजन के अंतिम मात्रा के साथ एक 60 मिमी संस्कृति डिश में अच्छी तरह से काम करता है. इस हौसले से अलग नलिकाओं एम्बेड करने के समय में नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए.- बर्फ पर चूहे की पूंछ कोलेजन, बाँझ 10x फॉस्फेट buffered खारा (10x पीबीएस), बाँझ DH 2 हे, और बाँझ 1 एन NaOH रखें.
- कोलेजन का 0.023 गुना मात्रा के बराबर 1 एन NaOH की मात्रा का उपयोग करते हुए, dh 2 0, 10x पीबीएस, NaOH, और कोलेजन 1x पीबीएस में 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन के अंतिम एकाग्रता के साथ जैल के लिए आवश्यक की मात्रा की गणना गयी. नोट: कोलेजन के वैकल्पिक स्रोत इस्तेमाल किया जाता है, तो निराकरण और जेल गठन के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
- एक साथ dh 2 0, 1 मिक्स0x पीबीएस, और 1 एन NaOH, फिर भी मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कोलेजन और पिपेट अच्छी तरह से जोड़ें.
- कोलेजन समाधान कमरे के तापमान पर स्थिरता की तरह एक जेल को गाढ़ा हो जाने के बाद, तुरंत कोलेजन में नलिकाओं एम्बेड.
- 5% सीओ 2 के 30 मिनट के लिए जमना को कोलेजन सक्षम करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें.
- जेल (सफेद करने के लिए स्पष्ट से रंग बदलता है), बीईसी मीडिया (1 टेबल) के 3.5 मिलीलीटर के साथ ओवरले जम और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते गया है, 5% सीओ 2.
- बीईसी मीडिया प्रति सप्ताह 3 बार निकालें और 3.5 मिलीलीटर ताजा मीडिया के साथ की जगह.
मोटी कोलेजन जैल से 3. अलग प्राथमिक Cholangiocytes
नोट: 3 सप्ताह के भीतर, cholangiocytes (बड़े नाभिक एम्बेडेड नलिकाओं से सीधे देने के साथ कोशिकाओं) की चादरें मोटी कोलेजन में दिखाई जाएगी. डिश में fibroblasts की बड़ी संख्या है, तो इसे खारिज किया जाना चाहिए. डिश के कुछ क्षेत्रों है, तोfibroblast वृद्धि, ये एक स्केलपेल के साथ बाहर कटौती और पूर्व cholangiocytes बंटवारे को हटाया जा सकता है.
- पतली कोलेजन जैल तैयार:
- बाँझ पीबीएस के साथ 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के लिए कोलेजन पतला. नोट: 100 मिमी प्लेट के लिए 1 मिलीलीटर का उपयोग करें; अन्य आकार व्यंजनों के लिए तदनुसार समायोजित.
- एक सेल स्प्रेडर (बड़े बर्तन) या पिपेट टिप (छोटे व्यंजन) के साथ समान रूप से कोलेजन समाधान बिखरा हुआ है, तो 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें.
- DMEM/F12 साथ प्लेट कवर और 37 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 5% सीओ 2 पर सेते हैं.
- इनक्यूबेटर से थाली निकालें और 1x पीबीएस के साथ धो लो. तुरंत 1x पीबीएस महाप्राण.
- थाली घूर्णन या एक प्रकार के बरतन पर थाली रखकर प्रसार कोलेजन की एक दूसरी पतली परत के साथ कोट. 37 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 5% सीओ 2 सेते हैं.
- कोलेजन जम जाने के बाद, कवर DMEM/F12 साथ प्लेट और 37 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 पर सेते हैं.
- वें से कोशिकाओं को विभाजितick कोलेजन जैल:
- यह चल रहा है कि इतनी सेल संस्कृति के रंग या सेल खुरचनी के साथ, थाली से धीरे कोलेजन जेल परिमार्जन.
- DMEM/F12 साथ 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर प्रकार इलेवन collagenase (सामग्री सूची देखें) गिराए collagenase समाधान तैयार करें. अच्छी तरह से और बाँझ फिल्टर मिलाएं.
- मोटी कोलेजन में कोशिकाओं के 60 मिमी पकवान प्रति collagenase समाधान (ऊपर) के 1 मिलीलीटर जोड़ें. (3 मिलीग्राम होना चाहिए) बीईसी मीडिया को न निकालें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पकवान सेते हैं, 5% सीओ 2.
- कोशिकाओं से युक्त समाधान निकालें, और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह है.
- 5 मिनट के लिए 2200 XG पर स्पिन. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और DMEM/F12 के समान मात्रा में गोली निलंबित कर रहे हैं.
- 5 मिनट के लिए 2200 XG पर फिर से समाधान स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- 3 0.5% trypsin के मिलीलीटर, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 5% सीओ 2 सेते में resuspend गोली. ऊष्मायन के बाद, समाधान पिपेट और नीचे cholangiocytes की चादरों को तोड़ने के लिए. बीईसी मीडिया के 5 एमएल जोड़ें5 मिनट के लिए 1500 XG पर एन डी स्पिन समाधान.
- फिर 5 मिनट के लिए 1500 XG पर समाधान स्पिन, DMEM/F12 में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend गोली निकालें.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और बीईसी मीडिया (1 टेबल) में गोली निलंबित कर रहे हैं. पहले किए गए पतली कोलेजन जैल पर प्लेट कोशिकाओं.
प्रकोष्ठों के 4. बीतने और संग्रहण
नोट: जरूरत के रूप में पतली कोलेजन जैल पर कोशिकाओं को विभाजित किया जा सकता है.
- पिछले 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% trypsin में incubating बाँझ पीबीएस के साथ प्लेट धो लें.
- बीईसी मीडिया के एक बराबर मात्रा के साथ बेअसर, और 5 मिनट के लिए 1500 XG पर गोली. DMEM/F12 के साथ गोली कुल्ला, तो 5 मिनट के लिए 1500 XG पर गोली.
- कोलेजन लेपित सेल संस्कृति व्यंजन को वितरण के लिए बीईसी मीडिया में Resuspend कोशिकाओं.
नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं भंडारण मीडिया में resuspended और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या तरल नाइट्रोजन (1 टेबल) में संग्रहीत किया जा सकता है.
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Representative Results
नवजात माउस extrahepatic उत्कृष्ट पवित्रता के साथ cholangiocytes, K19 immunofluorescence धुंधला द्वारा प्रदर्शन के रूप में (आंकड़े 2A और 2 बी) की आबादी के अलगाव में इस प्रोटोकॉल के परिणाम का उपयोग; हम वयस्क चूहों से कोशिकाओं को अलग इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के. हम यह मोटी कोलेजन जैल पर monolayers फार्म करने के लिए हौसले से अलग पित्त नलिकाओं से कोशिकाओं के लिए 3 सप्ताह का समय लगता है कि देखा है. cholangiocytes पृथक नलिकाओं से कोशिकाओं की चादरें बनाने, मोटी कोलेजन भर में एक रैखिक फैशन में हो जाना. संस्कृतियों 3 सप्ताह पहले विभाजित नहीं कर रहे हैं छेद कोशिकाओं की चादर में दिखाई देते हैं क्योंकि monolayers, ऊंचा हो गया बनने से पहले कोशिकाओं को विभाजित और पतली कोलेजन जैल पर फिर से चढ़ाया जाना चाहिए. इष्टतम सेल के विकास और fibroblast प्रदूषण को कम करने के लिए, यह विच्छेदन और सफाई कदम (2.3, 2.4) के दौरान सावधानी से और कुशलता से नाजुक extrahepatic नलिकाओं आसपास के संयोजी ऊतक को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. Fibro की वृद्धि होती है तोविस्फोटों, एक छुरी या कोमल suctioning साथ मोटी कोलेजन के प्रभावित क्षेत्र से हटाने से पहले बंटवारे कोशिकाओं को fibroblasts के हस्तांतरण को कम कर सकते हैं. इन कोशिकाओं को पहले तीन मार्ग के दौरान तेजी से विभाजित लेकिन उच्च बीतने के अंक में, विकास दर धीमा कर देती है, और कोशिकाओं बड़ा और vacuolated हो जाते हैं. हम सफलतापूर्वक cholangiocytes के नमूने जमे हुए, और उत्कृष्ट व्यवहार्यता के साथ बाद में कई बार फिर से उन्हें चढ़ाया है; thawed cholangiocytes, तथापि, के रूप में तेजी से हौसले से अलग रूप में और विभाजन कोशिकाओं को दोहराने नहीं है.
चित्रा 1. सर्जिकल उपकरण टिशू कल्चर तंत्र से निकटता में स्थापित किया जाना चाहिए. (ए) प्रकाश स्रोत विदारक माइक्रोस्कोप के पीछे रखा गया है. (बी) सर्जिकल उपकरण तेज अनुसूचित जाति में शामिलissors, hemostat, एक घुमावदार दाँतेदार चिमटी, और एक घुमावदार संयुक्त राष्ट्र दाँतेदार चिमटी (सी);.. isolations के लिए इस्तेमाल किया 3 दिन पुरानी माउस के आकार (डी) चिमटी नवजात माउस में आम पित्त नली धारण कर रहे हैं.
चित्रा 2. Extrahepatic cholangiocytes का शुद्ध आबादी mesenchymal कोशिकाओं के साथ कम से कम प्रदूषण के साथ अलग कर रहे हैं. Cholangiocytes DAPI परमाणु इमेजिंग (नीला) के साथ K19 (हरा) के साथ दाग रहे थे. स्केल सलाखों, 25 माइक्रोन.
| मीडिया | घटक | राशि |
| Gentamicin | 0.5 मिलीलीटर | |
| पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन | 0.5 मिलीलीटर | |
| Fungizone | 0.5 मिलीलीटर | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 मिलीलीटर | |
| बिलियरी उपकला सेल (बीईसी) मीडिया | FBS | 25 मिलीलीटर |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 मिलीलीटर | |
| एम ईएम गैर आवश्यक अमीनो एसिड | 5 मिलीलीटर | |
| इंसुलिन transferrin-सेलेनियम | 5 मिलीलीटर | |
| ना पाइरूवेट | 5 मिलीलीटर | |
| रासायनिक परिभाषित लिपिड ध्यान केंद्रित | 5 मिलीलीटर | |
| पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन | 5 मिलीलीटर | |
| Gentamicin | 0.2 मिलीलीटर | |
| Ethanolamine | 0.13 मिलीलीटर | |
| 5 मिलीलीटर | ||
| सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला * | 5 मिलीलीटर | |
| एल glutamine | 5 मिलीलीटर | |
| गोजातीय पिट्यूटरी निकालने | 1.1 मिलीलीटर | |
| Dexamethasone * | 0.5 मिलीलीटर | |
| 3,3 ', 5 triiodo एल thyronine * | 0.5 मिलीलीटर | |
| Epidermal वृद्धि कारक * | 0.5 मिलीलीटर | |
| 5 मिलीलीटर | ||
| Fungizone | 1 मिलीलीटर | |
| भंडारण मीडिया (कोशिकाओं ठंड के लिए) | बिलियरी उपकला सेल (बीईसी) मीडिया | 7 मिलीलीटर |
| DMSO | 1 मिलीलीटर | |
| बाँझ FBS | 2 मिलीलीटर | |
| * सामग्री मीडिया में जोड़ने से पहले उचित सांद्रता के लिए तैयार रहने की जरूरत है. आगे की शिक्षा के लिए सामग्री सूची देखें. | ||
तालिका 1. मीडिया घटकों.
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Discussion
यहाँ वर्णित नवजात शिशुओं सहित सभी उम्र के चूहों के चूहों के extrahepatic पित्त नलिकाओं से शुद्ध cholangiocytes अलग करने के लिए एक तकनीक है. तकनीक extrahepatic cholangiocytes intrahepatic cholangiocytes से अलग से अध्ययन किया जा सकता है कि लाभ प्रदान करता है, और कोशिकाओं की इन आबादियों के बीच मुख्य अंतर की पहचान करने के लिए अध्ययन की सुविधा हो सकती है. हमने हाल ही में एक अध्ययन का प्रदर्शन इस विधि से अलग किया और रीसस रोटावायरस 8 से संक्रमित extrahepatic cholangiocytes में सिलिया कमी आई प्रकाशित. नुकसान तकनीक श्रम गहन है, और सूक्ष्म विच्छेदन fibroblast प्रदूषण को रोकने के लिए आवश्यक है कि शामिल हैं; इसके अतिरिक्त, परिणाम और संस्कृति में कम से कम 3 सप्ताह के सबसे प्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. इस प्रकार, इन कोशिकाओं को दो आयामी संस्कृति के साथ जुड़े हुए बदलाव शामिल हो सकता है. यह अभी तक प्राप्त सेल आबादी स्टेम सेल या कोशिका की बड़ी संख्या शामिल है कि क्या निर्धारित नहीं किया गया हैperibiliary ग्रंथियों 9,10 से है.
हम चूहों से extrahepatic cholangiocytes अलग करने के लिए इस विधि का उपयोग करने का प्रयास किया; हालांकि, कोशिकाओं संस्कृति में विकसित करने के लिए विफल रही है. एक प्रमुख विकास कारक संस्कृति मीडिया में लापता या अन्य स्थितियों बदल जाने की जरूरत है कि क्या जांच के अंतर्गत वर्तमान में है या नहीं.
अंत में, extrahepatic cholangiocytes अलग करने के लिए इस विधि पित्त फाइब्रोसिस का अंतर और extrahepatic रूपों में मतभेद है, साथ ही नवजात और वयस्क कोशिकाओं के बीच अंतर को समझने के लिए योगदान कर सकते हैं.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा हितों है कि घोषणा.
Acknowledgments
लेखकों पाचन में आण्विक अध्ययन के लिए UPenn NIDDK केंद्र के आण्विक रोग विज्ञान और इमेजिंग कोर और इमेजिंग के साथ सहायता के लिए लीवर रोग (P30 DK50306) के लिए आभारी हैं. यह काम (RGW के लिए), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 डी.के. 092,111) से और फ्रेड और सुजान Biesecker बाल यकृत केन्द्र से अनुदान द्वारा और (एस के लिए) बचपन लिवर रोग अनुसंधान और शिक्षा नेटवर्क से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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