Summary
Una tecnica per isolare colangiociti dai dotti biliari extraepatici di topi neonati è descritto. I condotti sono meticolosamente sezionato, e poi le cellule sono isolate da escrescenza in gel di collagene di spessore. Questo metodo fornisce un utile strumento per lo studio dello sviluppo del dotto biliare extraepatico e patologia.
Abstract
I dotti biliari intra ed extraepatici del fegato sono evolutivamente distinti, e possono essere differenzialmente influenzati da certe malattie. Tuttavia, le differenze tra colangiociti intra ed extra, e tra le cellule neonatali e adulte, non sono ben compresi.
Metodi per l'isolamento di colangiociti da dotti biliari intraepatici sono ben stabiliti 1-4. Isolamento di cellule duttali extraepatici, specialmente dal neonato, non è ancora stato descritto, anche se questo sarebbe di grande beneficio per comprendere le differenze fra le popolazioni colangiociti distinte e nello studio malattie come atresia biliare che sembrano indirizzare i dotti extraepatici. Qui descritto è una tecnica ottimizzata per isolare le cellule dei dotti biliari extraepatici sia neonatali e topo adulto. Questa tecnica produce una popolazione pura di cellule con contaminazioni minimo da cellule mesenchimali come fibroblasti.
Questa metodologiad è basato sulla rimozione dei dotti extraepatici e cistifellea, seguita da dissezione meticolosa e raschiatura per rimuovere strati di grasso e fibroblasti. Le strutture sono incorporati in spessi strati di collagene e coltivate per circa 3 settimane per consentire conseguenza di colangiociti in monostrati, che possono poi essere tripsinizzato e ri placcato per uso sperimentale.
Introduction
L'origine e lo sviluppo dei colangiociti intra ed extra sono nettamente diverse. Il fegato si sviluppa da un diverticolo della ventrale foregut endoderma 5. La regione caudale del diverticolo forma dell'albero biliare extraepatico, mentre la regione craniale genera l'albero biliare intraepatico 5. Colangiociti dei dotti intraepatici sono derivati da cellule progenitrici intorno alla piastra duttale in peri regioni portale 6. Queste cellule hanno la capacità di differenziarsi in epatociti o colangiociti sia 6. Ciò ha importanti implicazioni cliniche dato che cholangiopathies possono rivolgono specificamente una categoria di colangiociti. Ad esempio, l'atresia biliare colpisce inizialmente i dotti extraepatici del neonato, mentre la sindrome di Alagille colpisce dotti intraepatici.
Ci sono diverse descrizioni di isolamento delle colangiociti intraepatici e unità del dotto biliare da topi e ratti. Investigators hanno isolato cellule singole dall'isolamento condotto e la successiva escrescenza, o dalla digestione fegato e anticorpo abbattere di colangiociti esprimono specifici marcatori di superficie delle cellule 1-4. Unità del dotto biliare funzionali e polarizzati sono stati isolati mediante digestione fegato e dimensioni filtrazione 7. Unità dotto biliare sono in grado di rispondere alle secretoria stimoli e dimostrare la secrezione di fluidi 7, mentre colangiociti isolati hanno dimostrato di sviluppare strutture duttulare in vitro 1,2. Limitazioni di questi metodi includono la necessità di competenze tecnico specializzato e attrezzature speciali per la perfusione del fegato con enzimi digestivi. Inoltre, vi è il rischio di contaminazione con cellule mesenchimali 3.
Un metodo per isolare colangiociti dei dotti biliari extraepatiche, in particolare da dotti biliari extraepatici neonatale, non è stato descritto in precedenza. Il documento illustra una tecnica semplificata per isolare neonatale uns così come le cellule adulte dotti biliari extraepatici ad alti livelli di purezza. Questa tecnica faciliterà lo studio delle differenze tra colangiociti e ricerche sui meccanismi di malattie come l'atresia biliare che coinvolgono i dotti extraepatici intra ed extraepatiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L'intera procedura è effettuata a temperatura ambiente a meno che diversamente specificato. Tutti i lavori degli animali deve essere effettuata in condizioni umane nell'ambito di un protocollo approvato dalla Institutional Animal Care ed uso comitato locale (IACUC).
1. Preparazione di apparecchiature e soluzioni
- Impostare la tabella chirurgica del mouse in prossimità della cappa coltura tissutale e incubatore (Figura 1A). Nota: Attrezzatura richiesta include un microscopio da dissezione, una fonte di luce, lungo 12,5 centimetri forbici iris diritte, pinze dentellate non sei pollici curvo con punte sottili, e 4 pollici pinza dentata con punte curve (Figura 1B).
- Posizionare strumenti sterilizzati in un recipiente di vetro di 70% di alcol sul tavolo operatorio.
- Riempire tre sterili 60 millimetri piastre di Petri con i media isolamento sterile (Tabella 1); collocare due sul tavolo operatorio e uno in cappuccio, tutti su ghiaccio.
- Posizionare coda di topo collagene,sterile 10x tampone fosfato salino (PBS), acqua sterile, sterile 1 N NaOH e biliare cellule epiteliali (BEC) media (Tabella 1) nel cofano coltura di tessuti. Nota: Il collagene deve essere sul ghiaccio.
2. Isolamento Bile Duct e cultura
- Euthanize topi neonati tra 0-3 giorni di vita, in caso di esposizione al biossido di carbonio fino inconscia seguita da dislocazione cervicale, per orientamenti IACUC (Figura 1C).
Nota: topi più anziani possono essere utilizzati a seconda delle specifiche esigenze sperimentali. - Posizionare animale in posizione supina e fare una piccola incisione orizzontale che attraversa la linea mediana della regione del bacino. Estendere questa incisione laterale e superiore entrambi i lati del ventre, formando un lembo a forma di U. Girare lembo fino a esporre gli organi addominali. Una volta che l'addome è aperto, spostare con cautela l'intestino dalla cavità addominale verso il lato destro dell'animale per una migliore visualizzazione del dotto epatico e biliare comune. Nota: può essere necessario estendere le incisioni laterali nella gabbia toracica avere una migliore identificazione del fegato.
- Utilizzando il microscopio da dissezione, identificare il dotto biliare comune, fegato e intestino. Identificare il dotto biliare comune prima (Figura 1D), con cautela, in quanto le strutture sono molto delicati. Con le pinze dentellate seghettati e non, meticolosamente puliti e far fuori il tessuto connettivo incluso il grasso che circonda la bile. Utilizzare una pinza per tenere il condotto e l'altro da pulire.
- Utilizzare una tecnica simile per pulire la cistifellea.
- Posizionare i condotti puliti e cistifellea nel primo piatto di terreni di isolamento sul ghiaccio. Massaggiare delicatamente le strutture con le pinze non dentati, mentre nei media per eliminare ulteriormente il tessuto connettivo e togliere la bile dalla cistifellea.
- Trasferire condotti e cistifellea al secondo piatto di terreni di isolamento.
- Dopo l'isolamento dei condotti e colecisti da 5 animali, trasferire ilpezzi al terzo piatto Petri, nella cappa. Nota: Se le cellule devono essere isolato da più di 5 animali, fare in batch, utilizzando soluzioni fresche per ogni gruppo di 5 animali.
- Preparare gel di collagene di spessore nella cappa coltura tissutale:
Nota: ogni piatto formato può essere utilizzato. Un piatto di coltura 60 mm Con un volume finale di 3 ml di collagene per ogni gruppo di 5 neonati funziona bene. Questo deve essere preparato fresco al momento di incorporare condotti appena isolate.- Posizionare ratto collagene coda, sterile 10x tampone fosfato (10x PBS), dH 2 O sterile e sterile 1 N NaOH su ghiaccio.
- Calcolare i volumi di dH 2 0, 10x PBS, NaOH, e collagene necessario per gel con una concentrazione finale di 2 collagene mg / ml in PBS 1x, utilizzando un volume di 1 N NaOH pari a 0.023 volte il volume di collagene memo. Nota: Se si usa fonte alternativa di collagene, seguire le istruzioni del produttore per la neutralizzazione e la formazione di gel.
- Mescolare dH 2 0, 10x PBS e 1 N NaOH, quindi aggiungere collagene e pipetta bene per assicurare una miscelazione uniforme.
- Una soluzione di collagene è addensata ad un gel come consistenza a temperatura ambiente, immediatamente incorporare i condotti del collagene.
- Porre in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 per 30 minuti per consentire al collagene a solidificare.
- Una volta che il gel si è solidificato (cambiamenti di colore dal chiaro al bianco), sovrapposizione con 3,5 ml di mezzi di BEC (Tabella 1) e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Rimuovere i supporti BEC 3 volte a settimana e sostituirlo con 3,5 ml di mezzi freschi.
3. Isolanti primari colangiociti da Thick Collagene Gel
Nota: entro 3 settimane, fogli di colangiociti (cellule con grandi nuclei che si estende direttamente dai condotti incorporati) saranno visibili nel collagene di spessore. Se sono presenti un gran numero di fibroblasti nel piatto, deve essere eliminato. Se alcune regioni del piatto hannocrescita dei fibroblasti, questi può essere tagliato con un bisturi e rimosso prima di dividere i colangiociti.
- Preparare gel di collagene sottili:
- Diluire collagene ad una concentrazione di 1 mg / ml con PBS sterile. Nota: utilizzare 1 ml per piastra mm 100; regolare di conseguenza per gli altri piatti di dimensioni.
- Diffondere la soluzione di collagene uniformemente con una spatola cellulare (piatti di grandi dimensioni) o la punta della pipetta (piccoli piatti), poi lasciare a temperatura ambiente per 10 min.
- Coprire piastra con DMEM/F12 e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 min.
- Rimuovere la piastra da incubatore e lavare con PBS 1x. Aspirare immediatamente la 1x PBS.
- Coat con un secondo strato di collagene, diffondendo ruotando la piastra o immissione piastra su un agitatore. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 min.
- Dopo collagene è solidificato, piastra di copertura con DMEM/F12 e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 30 min.
- Dividere le celle da thick gel di collagene:
- Con la coltura cellulare spatola o un raschietto cellula, raschiare gel di collagene delicatamente la piastra in modo che galleggi.
- Preparare la soluzione collagenasi diluendo tipo XI collagenasi (vedi elenco materiali) a 10 mg / ml con DMEM/F12. Mescolare bene e filtro sterile.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di collagenasi (sopra) ogni 60 mm senza coperchio di cellule in collagene di spessore. Non rimuovere il supporto BEC (che dovrebbe essere di 3 ml). Incubare piatto per 30 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- Rimuovere la soluzione contenente le cellule, e metterli in tubo da 15 ml.
- Spin down a 2.200 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e sospendere nuovamente pellet in volume analogo di DMEM/F12.
- Spin nuovamente la soluzione a 2.200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante.
- Risospendere pellet in 3 ml di 0,5% tripsina, e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 5 min. Dopo l'incubazione, pipetta la soluzione su e giù per rompere i fogli di colangiociti. Aggiungere 5 ml di BEC supporti unsoluzione centrifuga nd a 1.500 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante, risospendere pellet e in DMEM/F12, poi girare soluzione a 1.500 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente pellet nei media BEC (Tabella 1). Cellule piastra su fatte in precedenza gel di collagene sottili.
4. Passage e stoccaggio delle cellule
Nota: celle su gel di collagene sottili possono essere suddivise come necessario.
- Lavare le piastre con PBS sterile prima dell'incubazione a 0,25% tripsina a 37 ° C per 10-15 min.
- Neutralizzare con un volume uguale di mezzi BEC e pellet a 1500 xg per 5 min. Risciacquare pellet con DMEM/F12, poi pellet a 1500 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule in mezzi BEC per la distribuzione di collagene rivestito di coltura cellulare piatti.
Nota: In alternativa, le cellule possono essere risospese in supporti di memorizzazione e conservati in un congelatore -80 ° C o in azoto liquido (Tabella 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'uso di questo protocollo risultati in isolamento di una popolazione di neonatali di topo colangiociti extraepatici con ottima purezza, come dimostrato da K19 immunofluorescenza (Figure 2A e 2B); otteniamo risultati simili isolano cellule di topi adulti. Abbiamo osservato che ci vogliono 3 settimane per cellule da dotti biliari appena isolate per formare monostrati su gel di collagene di spessore. I colangiociti crescono in modo lineare durante il collagene spessa, fogli di formazione di cellule dai canali isolati. Le cellule devono essere divisi e ri-placcato su gel di collagene sottili prima monolayers diventino troppo cresciuto, dal momento che i fori appaiono in fogli di celle se le culture non sono divisi prima di 3 settimane. Per la crescita cellulare ottimale e ridurre al minimo la contaminazione dei fibroblasti, è importante rimuovere il tessuto connettivo circostante i condotti extraepatici delicati attentamente e meticolosamente durante la dissezione e pulizia passaggi (2.3, 2.4). Se vi è una crescita di fibroblasti, rimozione della zona interessata del collagene di spessore con un bisturi o dolce aspirazione possono ridurre il trasferimento di fibroblasti prima divisione delle celle. Queste cellule si dividono rapidamente durante i primi tre passaggi, ma nei punti di passaggio più elevati, il tasso di crescita rallenta, e le cellule diventano più grandi e vacuolizzato. Abbiamo congelato con successo campioni di colangiociti, e li ri-plated in tempi successivi con ottima redditività; colangiociti scongelati, tuttavia, non si replicano più velocemente fresco isolata e dividere le celle.
Figura 1. Apparecchi chirurgici dovrebbe essere istituito in prossimità di apparecchi di coltura tissutale. (A) sorgente luminosa è posta dietro il microscopio da dissezione. (B) apparecchi chirurgici comprende sc taglienteissors, emostatico, una pinzetta curve seghettate, e un curve pinzetta non-seghettati (C);.. dimensioni di un mouse a 3 giorno di vita utilizzata per isolamenti (D) pinzette in mano il dotto biliare comune nel topo neonatale.
Figura 2. Popolazioni pure di colangiociti extraepatiche sono isolati con contaminazione minimo con cellule mesenchimali. Colangiociti sono stati colorati con K19 (verde) con imaging nucleare DAPI (blu). Bar Scala, 25 micron.
| Media | Componente | Importo |
| Gentamicina | 0,5 ml | |
| Penicillina-Streptomicina | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 ml | |
| Biliare cellule epiteliali (BEC) media | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 ml | |
| M EM aminoacidi non essenziali | 5 ml | |
| Insulina-transferrina-selenio | 5 ml | |
| Na piruvato | 5 ml | |
| Concentrato di lipidi chimicamente definita | 5 ml | |
| Penicillina-Streptomicina | 5 ml | |
| Gentamicina | 0,2 ml | |
| Etanolamina | 0.13 ml | |
| 5 ml | ||
| Inibitore della tripsina di soia * | 5 ml | |
| L-glutammina | 5 ml | |
| Estratto di ipofisi bovina | 1,1 ml | |
| Desametasone * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-triiodo-L-thyronine * | 0,5 ml | |
| Fattore di crescita epidermico * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Storage Media (per il congelamento delle cellule) | Biliare cellule epiteliali (BEC) supporti | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Sterile FBS | 2 ml | |
| * Gli ingredienti devono essere preparati a concentrazioni appropriate prima di aggiungere in media. Fare riferimento alla lista del materiale per ulteriori istruzioni. | ||
Tabella 1. Componenti multimediali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui descritto è una tecnica per isolare colangiociti puri dai dotti biliari extraepatici di topi di topi di tutte le età, compresi i neonati. La tecnica offre il vantaggio che colangiociti extraepatici possono essere studiate separatamente da colangiociti intraepatiche, e può facilitare studi per individuare le differenze principali tra queste popolazioni di cellule. Abbiamo recentemente pubblicato una dimostrazione studio diminuito ciglia in colangiociti extraepatiche isolato con questo metodo e con infezione da rotavirus rhesus 8. Gli svantaggi sono che la tecnica è laborioso, e la dissezione meticolosa è necessaria per prevenire la contaminazione dei fibroblasti; Inoltre, escrescenza e almeno 3 settimane in coltura sono necessari per ottenere cellule sufficienti per la maggior parte degli esperimenti. Così, queste cellule possono riflettere cambiamenti associati con due cultura dimensionale. Non è stato ancora stabilito se le popolazioni cellulari ottenute includono un numero significativo di cellule staminali o cellules da ghiandole peribiliari 9,10.
Abbiamo cercato di utilizzare questo metodo per isolare colangiociti extraepatiche da ratti; Tuttavia, le cellule hanno continuato a crescere in cultura. Se un fattore di crescita fondamentale manca nei terreni di coltura o se altre condizioni devono essere modificati è attualmente sotto inchiesta.
In definitiva, questo metodo per isolare colangiociti extraepatici può contribuire alla comprensione differenze nelle forme intra ed extraepatici di fibrosi biliare, nonché le differenze tra le cellule neonatali e adulti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
Acknowledgments
Gli autori sono grati per la Patologia Molecolare e Imaging Core del UPenn NIDDK Centro Studi molecolari in Digestiva e Malattie del Fegato (P30 DK50306) per l'assistenza con l'imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01 DK-092111) e dalla Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW) e da una borsa di studio dalla Liver Disease Research and Education Network infanzia (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
