Summary
Uma técnica para isolar cholangiocytes das vias biliares extra-hepáticos de ratos neonatais é descrito. As condutas são meticulosamente dissecados, e, em seguida, as células são isoladas por crescimento em géis de colagénio espessas. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o desenvolvimento do ducto biliar extra-hepática e patologia.
Abstract
Os ductos biliares intra e extra-hepáticos do fígado são developmentally distinta, e podem ser diferencialmente afectada por certas doenças. No entanto, as diferenças entre intra e extra-hepáticos cholangiocytes, e entre as células recém-nascidos e adultos, não são bem compreendidos.
Os métodos para o isolamento de cholangiocytes de ductos biliares são bem estabelecida 1-4. Isolamento de células ductais extra-hepáticos, particularmente a partir do neonato, ainda não foi descrito, embora este seria de grande benefício para a compreensão das diferenças entre as populações distintas cholangiocyte e no estudo de doenças tais como a atresia biliar que aparecem para atingir os canais extra-hepáticos. Descrito aqui é uma técnica otimizada para isolar as células dos ductos biliares extra-hepáticas, tanto neonatal e adulto do rato. Esta técnica produz uma população de células pura com contaminação mínima entre as células mesenquimais como fibroblastos.
Este metodod é baseado na remoção dos ductos extra-hepáticos e da vesícula biliar, seguida por dissecação meticulosa e raspagem para remover as camadas de gordura e de fibroblastos. As estruturas são incorporados em camadas de espessura de colagénio e cultivadas durante aproximadamente 3 semanas para permitir o crescimento de cholangiocytes em monocamadas, que pode, então, ser tratadas com tripsina e re-plaqueadas para o uso experimental.
Introduction
A origem eo desenvolvimento da intra e extra-hepáticos cholangiocytes são marcadamente diferentes. O fígado se desenvolve a partir de um divertículo do intestino anterior endoderme ventral 5. A região caudal do divertículo forma a árvore biliar extra-hepática, enquanto que a região craniana gera a árvore biliar intra-hepática 5. Cholangiocytes duto intra-hepática são derivadas de células progenitoras em torno da placa ductal nas regiões peri portal 6. Estas células têm a capacidade de se diferenciar em qualquer hepatócitos ou cholangiocytes 6. Isto tem implicações clínicas significativas, dado que cholangiopathies podem objetivar especificamente uma categoria de cholangiocytes. Por exemplo, atresia biliar afeta inicialmente os ductos extra-hepáticos do recém-nascido, enquanto a Síndrome de Alagille afeta ductos intra-hepáticos.
Há várias descrições do isolamento de cholangiocytes intra e unidades biliares de camundongos e ratos. Emvestigators isolaram células individuais pelo isolamento do duto e conseqüência subseqüente, ou por digestão do fígado e do anticorpo puxar para baixo de cholangiocytes expressam marcadores de superfície celular específicos 1-4. Unidades biliares funcionais e polarizadas foram isoladas por digestão do fígado e tamanho filtração 7. Unidades de ductos biliares são capazes de responder a estímulos secretora e demonstram a secreção de fluido 7, ao passo que cholangiocytes isolados têm sido mostrados para desenvolver estruturas ductulares in vitro 1,2. Limitações destes métodos incluem a necessidade de conhecimento técnico especializado e equipamento especial para perfusão de fígado com enzimas digestivas. Além disso, existe o risco de contaminação com células mesenquimais 3.
Um método para isolar extra-hepáticos cholangiocytes do ducto biliar, especificamente a partir das vias biliares extra-hepáticos neonatal, não foi anteriormente descrito. Este artigo descreve uma técnica simplificada para isolar um neonatalé bem como as células dos ductos biliares extra-hepáticos adultos em altos níveis de pureza. Esta técnica irá facilitar o estudo das diferenças entre cholangiocytes e pesquisas sobre mecanismos de doenças como atresia biliar que envolvem os ductos extra-hepáticos e extra-hepáticos intra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todo o procedimento é realizado à temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma. Todo o trabalho animal deve ser realizado em condições humanas no âmbito de um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional locais Animal Care e Use (IACUC).
1. Preparação de equipamentos e soluções
- Configure mesa cirúrgica o mouse em estreita proximidade com a capa de cultura de tecidos e incubadora (Figura 1A). Nota: Equipamento necessário inclui um microscópio de dissecação, uma fonte de luz, 12,5 cm de comprimento tesoura de íris reta, pinça curva de 6 polegadas não serrilhadas com pontas finas e 4 de polegada de fórceps serrilhados, com ponta curva (Figura 1B).
- Coloque instrumentos esterilizados em um copo de vidro de 70% de álcool na mesa cirúrgica.
- Preencha três estéreis 60 milímetros placas de Petri com meios de isolamento estéril (Tabela 1); colocar dois na mesa cirúrgica e um no capô, tudo em gelo.
- Coloque rato colágeno cauda,estéril 10x tampão fosfato salino (PBS), água estéril, estéril NaOH 1 N e biliar de células epiteliais (BEC) mídia (Tabela 1) na capa de cultura de tecidos. Nota: O colagénio deve ser em gelo.
2. Colagoga Isolamento e Cultura
- Eutanásia ratos neonatal entre 0-3 dias de vida, por exposição ao dióxido de carbono até inconsciente, seguido por deslocamento cervical, por diretrizes IACUC (Figura 1C).
Nota: ratos mais velhos podem ser usados, dependendo das necessidades específicas experimental. - Coloque o animal em decúbito dorsal e fazer uma pequena incisão horizontal cruzando a linha média na região da pelve. Estender esta incisão lateral e os dois lados do abdômen, formando uma ponta em forma de U. Vire aba para cima para expor os órgãos abdominais. Uma vez que o abdômen é aberto, mover cuidadosamente os intestinos para fora da cavidade abdominal para o lado direito do animal para melhor visualização do ducto hepático e biliar comum. Nota: pode ser necessário prolongar os cortes laterais para a caixa torácica para obter uma melhor identificação do fígado.
- Utilizando o microscópio de dissecação, identificar o ducto biliar comum, fígado e intestinos. Identificar o ducto biliar comum em primeiro lugar (Figura 1D), utilizando-se cautela, pois as estruturas são muito delicadas. Com a pinça serrilhadas dentadas e não, meticulosamente limpo e apanhar o tecido conjuntivo, incluindo a gordura em torno do bile. Use uma pinça para segurar a conduta e o outro para limpar.
- Use uma técnica similar para limpar a vesícula biliar.
- Coloque os dutos limpos e vesícula biliar para o primeiro prato de meios de isolamento no gelo. Massageie suavemente as estruturas com a pinça não serrilhadas enquanto nos meios de comunicação para remover mais tecido conjuntivo e remover bile da vesícula biliar.
- Transferência de dutos e da vesícula biliar para o segundo prato de meios de isolamento.
- Após o isolamento de dutos e vesículas biliares de 5 animais, transferir opeças para a terceira placa de Petri, no bairro. Nota: Se as células são para ser isolado a partir de mais de 5 animais, fazer em lotes, usando soluções frescas para cada grupo de 5 animais.
- Prepare géis de colágeno grossas na capa de cultura de tecidos:
Nota: todos os tamanhos do prato podem ser utilizados. Uma placa de cultura de 60 milímetros, com um volume final de 3 mL de colagénio para cada grupo de 5 recém-nascidos funciona bem. Isto deve ser preparado fresco, no momento de incorporação de condutas isoladas de fresco.- Coloque colagénio de cauda de rato, estéril de 10x tampão fosfato salino (PBS 10x), dH 2 O estéril e estéril de NaOH 1 N em gelo.
- Calcular as quantidades de dH 2 0, 10x PBS, NaOH, e colagénio necessária para géis com uma concentração final de colagénio de 2 mg / mL em 1x PBS, utilizando um volume de NaOH a 1 N igual a 0,023 vezes o volume de colagénio adicional. Nota: Se é usada fonte alternativa de colágeno, siga as instruções do fabricante para a neutralização e formação de gel.
- Misture dH 2 0, 10x PBS, e NaOH 1 N, em seguida, adicionar o colagénio e pipeta bem para assegurar uma mistura uniforme.
- Depois solução de colagénio engrossou para um gel de consistência semelhante à temperatura ambiente, imediatamente inserir as condutas do colagénio.
- Colocar na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 minutos para permitir que o colagénio para solidificar.
- Depois de gel ter solidificado (a cor muda de transparente para branco), sobreposição com 3,5 ml de meio de BEC (Tabela 1) e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Remova a mídia BEC 3 vezes por semana e substituir com 3,5 ml de mídia fresco.
3. Isolando primárias cholangiocytes de Thick Colágeno Gel
Nota: dentro de 3 semanas, folhas de cholangiocytes (células com núcleos grandes estender diretamente de dutos embutidos) será visível no colágeno de espessura. Se houver um grande número de fibroblastos no prato, ele deve ser descartado. Se algumas regiões do prato temde crescimento de fibroblastos, estes podem ser cortados com um bisturi e removido antes da divisão das cholangiocytes.
- Prepare géis finas de colágeno:
- Dilui-se o colagénio a uma concentração de 1 mg / ml com PBS estéril. Nota: utilizar 1 ml para placa de 100 mm; ajustar em conformidade para outros pratos de tamanho.
- Espalhe a solução de colágeno de forma uniforme com um espalhador de celular (pratos grandes) ou ponta de pipeta (pequenos pratos), deixe em temperatura ambiente por 10 min.
- Espelho com DMEM/F12 e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min.
- Retire a placa da incubadora e lave com 1x PBS. Imediatamente a aspirar 1x PBS.
- Revestimento com uma segunda camada de colagénio finas, espalhando por rotação da placa de colocação ou de placa num agitador. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min.
- Depois de colagénio tenha solidificado, a placa de cobertura com DMEM/F12 e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 min.
- Dividir células a partir de diagéis de colágeno ick:
- Com uma espátula de cultura de células ou um raspador de células, raspar gel de colagénio suavemente a placa a fim de que ele está a flutuar.
- Preparar a solução de colagenase diluindo XI Tipo de colagenase (ver lista de materiais) para 10 mg / ml com meio DMEM/F12. Misturar bem e filtro estéril.
- Adicionar 1 ml de solução de colagenase (acima) por 60 milímetros prato de células no colagénio de espessura. Não remova a mídia BEC (que deve ser de 3 ml). Incubar prato durante 30 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Remover solução contendo as células, e coloque no tubo de 15 ml.
- Gire para baixo a 2.200 xg por 5 min. Desprezar o sobrenadante e re suspender pellet em volume similar de DMEM/F12.
- Rotação solução novamente a 2.200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 3 ml de 0,5% de tripsina e incubação a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 min. Após a incubação, pipetar a solução para cima e para baixo para quebrar as folhas de cholangiocytes. Adicionar 5 ml de BEC mídia umasolução de spin ª a 1.500 xg por 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em DMEM/F12, em seguida girar a solução 1.500 xg durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e re suspender pellet em mídia BEC (Tabela 1). Células placa na feitas anteriormente géis de colágeno finas.
4. Passage e Armazenamento de Células
Nota: as células em géis de colagénio finas pode ser dividido conforme necessário.
- Lavar as placas com PBS estéril, antes da incubação em 0,25% de tripsina, a 37 ° C durante 10-15 min.
- Neutraliza-se com um volume igual de meio de BEC, e sedimentar a 1500 x g durante 5 min. Lavar pelete com DMEM/F12, então sedimentar a 1500 x g durante 5 min.
- Ressuspender as células em meios BEC para a distribuição de colágeno revestido placas de cultura de células.
Observação: Como alternativa, as células podem ser novamente suspensas em meios de armazenamento e armazenado num congelador a -80 ° C ou azoto líquido (Quadro 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A utilização destes resultados do protocolo para o isolamento de uma população de rato cholangiocytes extra-hepáticos neonatais com uma pureza excelente, como demonstrado por coloração de imunofluorescência K19 (Figuras 2A e 2B); se conseguir resultados semelhantes isolamento de células a partir de ratinhos adultos. Temos observado que leva 3 semanas para as células dos ductos biliares recém-isoladas para formar monocamadas em géis de colágeno de espessura. Os cholangiocytes crescer de forma linear ao longo do colagénio de espessura, formando camadas de células a partir das condutas isoladas. As células devem ser divididos e re-semeadas em géis de colágeno finas antes de tornar-se monocamadas coberto, uma vez que buracos aparecem nas folhas de células se as culturas não são divididos antes de 3 semanas. Para o crescimento celular óptimo e para minimizar a contaminação por fibroblastos, é importante remover o tecido conjuntivo que rodeia as condutas extra-hepáticos delicados cuidadosamente e meticulosamente durante o esvaziamento e limpeza etapas (2.3, 2.4). Se não houver crescimento de fibroexplosões, a remoção da área afetada de colágeno grosso com um bisturi ou aspiração suave pode reduzir a transferência de fibroblastos antes da divisão de células. Estas células dividem-se rapidamente durante os primeiros três passagens, mas em pontos de passagem mais elevadas, a taxa de crescimento diminui, e as células tornam-se maiores e vacuoladas. Temos congelados com sucesso amostras de cholangiocytes, e re-banhado-los em momentos posteriores, com excelente viabilidade; cholangiocytes descongeladas, no entanto, não tão rapidamente como replicar isolada de fresco e as células de divisão.
Figura 1. Equipamento cirúrgico deve ser configurado na proximidade de equipamento cultura de tecidos. (A) Fonte de luz é colocado atrás do microscópio de dissecação. (B) Equipamento cirúrgico inclui sc afiadaissors, hemostática, de curvas pinças serrilhadas, e uma curvas pinças un-serrilhados (C);.. tamanho de um mouse de 3 dias de idade usado para isolamentos (D) Pinças está segurando o ducto biliar comum em ratos neonatal.
Figura 2. Populações puras de cholangiocytes extra-hepáticos são isolados com contaminação mínima com células mesenquimais. Cholangiocytes foram coradas com K19 (verde) com DAPI imagem nuclear (azul). As barras de escala, 25 ^ m.
| Mídia | Componente | Quantidade |
| A gentamicina | 0,5 ml | |
| Penicilina-Estreptomicina | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 ml | |
| Biliar epitelial celular (BEC) Mídia | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 ml | |
| M EM aminoácidos não essenciais | 5 ml | |
| Insulin-transferrina-selênio | 5 ml | |
| Na Piruvato | 5 ml | |
| Concentrado lipídico, quimicamente definidos | 5 ml | |
| Penicilina-Estreptomicina | 5 ml | |
| A gentamicina | 0,2 ml | |
| Ethanolamine | 0,13 ml | |
| 5 ml | ||
| Inibidor de tripsina de soja * | 5 ml | |
| L-glutamina | 5 ml | |
| Extrato de hipófise bovina | 1,1 ml | |
| Dexametasona * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-triiodo-L-tironina * | 0,5 ml | |
| Fator de crescimento epidérmico * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Mídias de armazenamento (congelamento das células) | Biliar celular epitelial mídia (BEC) | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Estéril FBS | 2 ml | |
| * Ingredientes precisa estar preparado para as concentrações adequadas antes de adicionar em mídia. Consulte a lista de material para outras instruções. | ||
Tabela 1. Componentes Media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descrito aqui é uma técnica para isolar cholangiocytes puros das vias biliares extra-hepáticas de ratos de ratos de todas as idades, incluindo recém-nascidos. A técnica oferece a vantagem de que cholangiocytes extra-hepáticas podem ser estudadas separadamente cholangiocytes intra-hepática, e pode facilitar a estudos para identificar as principais diferenças entre estas populações de células. Publicamos recentemente um estudo demonstrando diminuição cílios em cholangiocytes extra-hepáticos isolados por este método e infectados com rotavírus rhesus 8. As desvantagens incluem que a técnica é trabalhosa e minuciosa dissecção é necessária para evitar a contaminação por fibroblastos; adicionalmente, pterígio e pelo menos 3 semanas em cultura são necessários para obter células suficientes para a maioria das experiências. Assim, essas células podem refletir mudanças associadas com dois cultura dimensional. Ainda não foi determinado se as populações de células obtidas a incluir um número significativo de células estaminais ou célulass a partir de glândulas peribiliary 9,10.
Tentamos usar esse método para isolar cholangiocytes extra-hepáticos de ratos; No entanto, as células não cresceram em cultura. Se um fator-chave de crescimento está em falta nos meios de cultura ou se outras condições precisam ser alterados está atualmente sob investigação.
Em última análise, este método para isolar cholangiocytes extra-hepáticas podem contribuir para a compreensão das diferenças em formas intra e extra-hepáticos de fibrose biliar, assim como diferenças entre as células neonatais e adultos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Patologia Molecular e Imagem Núcleo do Centro de NIDDK UPenn para estudos moleculares em Doenças Digestivas e do Fígado (P30 DK50306) para assistência com imagens. Este trabalho foi financiado por concessões do National Institutes of Health (R01 DK-092111) e do Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (para RGW) e por uma bolsa da Liver Disease Research e Rede de Educação Infantil (a SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
