Summary
En teknikk for å isolere cholangiocytes fra de ekstrahepatiske gallegangene av neonatal mus er beskrevet. Kanalene er omhyggelig dissekert, og cellene blir isolert ved utvekst i tykke kollagen geler. Denne metoden gir et nyttig verktøy for å studere ekstrahepatiske gallegang utvikling og patologi.
Abstract
De intra-og ekstrahepatiske galleganger i leveren er utviklingsmessig forskjellige, og kan være forskjellig påvirket av visse sykdommer. Men forskjellene mellom intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes, og mellom nyfødte og voksne celler, er ikke godt forstått.
Metoder for isolering av cholangiocytes fra intrahepatiske galleganger er godt etablert 1-4. Isolering av ekstrahepatiske duktale celler, spesielt fra den nyfødte, har ennå ikke blitt beskrevet, selv om dette ville være til stor nytte i å forstå forskjellene mellom forskjellige cholangiocyte populasjoner og i å studere sykdommer som galle atresi som synes å målrette de ekstrahepatiske kanaler. Beskrevet her er en optimalisert teknikk for å isolere både nyfødte og voksen mus ekstrahepatiske gallegang celler. Denne teknikken gir en ren cellepopulasjon med minimal forurensning fra mesenchymalceller som fibroblaster.
Dette method er basert på fjerning av ekstrahepatiske kanaler og galleblæren, etterfulgt av grundig disseksjon og skraping for å fjerne fett og fibroblast lag. Strukturer er forankret i tykke lag av kollagen og dyrket i omtrent 3 uker for å tillate utvekst av cholangiocytes i monolag, som deretter kan trypsinisert og på nytt belagt for eksperimentell bruk.
Introduction
Opprinnelsen og utviklingen av intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes er markant annerledes. Leveren utvikler seg fra en divertikkel i ventral forutgående endoderm fem. Hale regionen av divertikkel danner ekstrahepatiske galletreet, mens skallen genererer intrahepatisk galletreet fem. Intrahepatiske kanal cholangiocytes er avledet fra stamceller rundt ductal plate i peri portal regioner seks. Disse celler har evnen til å differensiere til enten hepatocytter eller cholangiocytes 6. Dette har betydelige kliniske implikasjoner gitt at cholangiopathies kan spesifikt mot en kategori av cholangiocytes. For eksempel, biliær atresi utgangspunktet påvirker ekstrahepatiske kanaler av den nyfødte, mens Alagille syndrom påvirker intrahepatiske kanaler.
Det finnes flere beskrivelser av isolering av intrahepatiske cholangiocytes og gallegang enheter fra mus og rotter. Isøkere har isolert enkeltceller ved kanal isolering og påfølgende utvekst, eller ved lever fordøyelse og antistoff trekk ned for cholangiocytes uttrykke markører spesifikke celleoverflate 1-4. Funksjonelle og polarisert gallegang enheter har blitt isolert av leveren fordøyelse og størrelse filtrering 7. Gallegang-enheter er i stand til å reagere på sekretorisk stimuli og demonstrere fluidsekresjon 7, mens isolerte cholangiocytes har vist seg å utvikle ductular strukturer in vitro 1,2. Begrensninger av disse metodene inkluderer behovet for spesialisert teknisk kompetanse og spesialutstyr for leverperfusjon med fordøyelsesenzymer. I tillegg er det en fare for forurensning med mesenchymale celler 3.
En fremgangsmåte for å isolere ekstrahepatiske gallekanal cholangiocytes, spesielt fra neonatale ekstrahepatiske galleganger, ikke tidligere er blitt beskrevet. Dette notatet skisserer en forenklet metode for å isolere neonatal ens vel som voksne ekstrahepatiske gallekanalceller ved høye nivåer av renhet. Denne teknikken vil gjøre det lettere å studere forskjeller mellom intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes og forskning på mekanismer for sykdommer som galle atresi som involverer de ekstrahepatiske kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hele fremgangsmåten blir utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Alle dyr arbeid skal utføres under humane forhold i henhold til en protokoll som er godkjent av den lokale Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
En. Utarbeidelse av utstyr og løsninger
- Sett opp muse kirurgisk tabellen i umiddelbar nærhet til vevskultur-hetten og inkubator (figur 1A). Merk: Nødvendig utstyr inkluderer en dissekere mikroskop, en lyskilde, 12,5 cm lange rette iris saks, 6 tommers non taggete buet tang med gode tips, og 4 tommers taggete tang med buede tips (Figur 1b).
- Plasser steriliserte instrumenter i et begerglass med 70% alkohol i den kirurgiske tabell.
- Fyll tre sterile 60 mm petriskåler med steril isolasjonsmedier (Tabell 1); plassere to på kirurgisk bord og en i panseret, alt på is.
- Plasser rotte hale kollagen,sterilt 10 x fosfatbufret saltvann (PBS), sterilt vann, sterilt 1 N NaOH og biliær epithelial cell (BEC) media (tabell 1) i hetten vevskultur. Merk: kollagen bør være på is.
2. Bile Duct Isolering og kultur
- Avlive neonatal mus mellom 0-3 dager i livet, ved eksponering for karbondioksid til bevisstløs fulgt ved halshugging, per IACUC retningslinjer (figur 1C).
Merk: eldre mus kan brukes, avhengig av spesifikke eksperimentelle behov. - Plasser dyret i liggende stilling og gjøre en liten horisontal snitt krysser midtlinjen i regionen i bekkenet. Forleng dette innsnitt i sideretning og opp på begge sider av buk, som danner en U-formet klaff. Snu klaffen opp å eksponere abdominal organer. Når bukhulen er åpnet, forsiktig beveger tarmen ut av bukhulen mot høyre side av dyret for bedre visualisering av leveren og galleveiene. Merk: Det kan være nødvendig å utvide den laterale snittene i brystkasse for å oppnå bedre identifisering av leveren.
- Bruke dissekere mikroskop, identifisere felles gallegang, lever og tarm. Identifisere felles gallegang første (figur 1D), ved hjelp av forsiktighet, da strukturene er svært delikat. Med de taggete og ikke taggete tang, omhyggelig ren og plukke av bindevev inkludert fett rundt galle. Bruk en pinsett til å holde kanalen og den andre til å rengjøre.
- Bruk en lignende teknikk for å rense galleblæren.
- Plasser de rensede kanaler og galleblæren i den første rett av isolasjonsmedier på is. Masser strukturene med ikke taggete tang mens i media for å fjerne ytterligere bindevev og fjerne galle fra galleblæren.
- Overfør kanaler og galleblæren til den andre rett av isolasjonsmedier.
- Etter isolering av kanaler og gallbladders fra fem dyr, overførebrikker til tredje petriskål, i panseret. Merk: Hvis celler skal isoleres fra mer enn 5 dyr, do i grupper, ved hjelp av fersk løsninger for hver gruppe på 5 dyr.
- Forbered tykke kollagen gels i panseret vev kultur:
Merk: alle størrelser fatet kan brukes. En 60 mm dyrkningsskål med et sluttvolum på 3 ml kollagen for hver gruppe av fem nyfødte fungerer godt. Dette bør være forberedt frisk på tidspunktet for innebygging nylig isolerte kanaler.- Plasser rottehale kollagen, sterile 10 x fosfatbufret saltløsning (10x PBS), sterile dH 2 O, og sterilt 1 N NaOH på is.
- Beregn volum av dH 2 0, 10 x PBS, NaOH, og kollagen som kreves for geler med en sluttkonsentrasjon på 2 mg / ml kollagen i 1 x PBS, ved hjelp av et volum av 1 N NaOH lik 0,023 ganger volumet av kollagen tilsatt. Merk: Hvis alternativ kilde til kollagen brukes, følg produsentens instruksjoner for nøytralisering og gel formasjon.
- Bland sammen dH 2 0, 10x PBS, og en N NaOH, deretter legge kollagen og pipette godt for å sikre enda miksing.
- Når kollagen-løsning er fortykket til en gel-lignende konsistens ved romtemperatur, umiddelbart legge kanalene i kollagen.
- Sett i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 min for å muliggjøre kollagen til å størkne.
- Når geleen er stivnet (fargen fra klar til hvit), overlay med 3,5 ml av BEC media (Tabell 1) og inkuberes ved 37 ° C, CO 5% to.
- Fjern BEC media 3 ganger per uke og erstatte med 3,5 ml frisk medier.
Tre. Isolering av primær Cholangiocytes fra Thick Collagen Gel
Merk: innen 3 uker, vil ark med cholangiocytes (celler med store kjerner som strekker direkte fra innebygde kanaler) være synlig i den tykke kollagen. Hvis det er et stort antall fibroblaster i formen, bør den kastes. Hvis noen regioner av fatet harfibroblast vekst, kan disse bli kuttet ut med en skalpell og fjernet før splitte cholangiocytes.
- Forbered tynne kollagen gels:
- Fortynn kollagen i en konsentrasjon på 1 mg / ml med sterilt PBS. Merk: Bruk en ml til 100 mm plate; justere tilsvarende for andre størrelses retter.
- Spre kollagenløsningen jevnt med en celle spreder (store retter) eller pipettespissen (småretter), deretter la ved romtemperatur i 10 min.
- Dekkplate med DMEM/F12 og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 minutter.
- Fjern platen fra inkubatoren og vask med 1x PBS. Umiddelbart aspirer 1x PBS.
- Coat med et andre tynt lag av kollagen, spredning ved dreiing av platen, eller å plassere platen på en rister. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 minutter.
- Etter kollagen har stivnet, dekkplate med DMEM/F12 og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 i 30 min.
- Dele celler fra thick kollagen gels:
- Med cellekultur spatel eller celleskraper, skrape kollagen gel forsiktig av platen slik at den er flytende.
- Forbered kollagenaseoppløsning ved å fortynne Type XI collagenase (se liste materialer) til 10 mg / ml med DMEM/F12. Bland godt og sterilt filter.
- Tilsett 1 ml av kollagenase-løsning (ovenfor) pr 60 mm skål av celler i tykk kollagen. Ikke fjern BEC medier (som bør være 3 ml). Inkuber parabolen for 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Fjern løsning som inneholder celler, og plasser i 15 ml konisk tube.
- Spinn ned ved 2200 xg i 5 min. Kast supernatanten og gjensuspendere pelleten i tilsvarende volum av DMEM/F12.
- Spin-løsning igjen ved 2200 xg i 5 min. Fjern supernatanten.
- Resuspender pellet i 3 ml av 0,5% trypsin, og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 min. Etter inkubasjon, pipetter løsningen opp og ned for å bryte opp ark cholangiocytes. Tilsett 5 ml av BEC media ennd spin-løsning ved 1500 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og resuspender pelleten i DMEM/F12, da spinne-oppløsning ved 1500 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og re suspendere pellet i BEC media (Tabell 1). Plate celler på tidligere gjort tynne kollagen gels.
4. Passage og lagring av celler
Merk: celler på tynne kollagen gels kan deles etter behov.
- Vask platene med sterilt PBS før inkubering i 0,25% trypsin ved 37 ° C i 10-15 min.
- Nøytraliser med et likt volum av BEC materialet, og pelletere ved 1500 xg i 5 min. Vask pelleten med DMEM/F12, deretter pellet ved 1500 xg i 5 min.
- Suspender cellene i BEC medier for distribusjon til kollagen belagt celle kultur retter.
Merk: Alternativt kan cellene resuspenderes i lagringsmedier og lagret i en -80 ° C fryseboks eller i flytende nitrogen (tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruken av denne protokollen resultater i isoleringen av en befolkning på neonatale mus ekstrahepatiske cholangiocytes med utmerket renhet, som demonstrert av K19 immunfluorescens farging (figurene 2A og 2B); vi oppnå lignende resultater isolere celler fra voksne mus. Vi har observert at det tar tre uker for celler fra nylig isolerte gallegangene for å danne monolayers på tykke kollagen gels. De cholangiocytes vokse på en lineær måte over hele den tykke kollagen og danner ark av celler fra de isolerte rør. Celler bør deles opp og re-belagt på tynne kollagen gel før monolayers gror igjen, siden hullene vises i ark med celler dersom kulturer ikke er splittet før tre uker. For optimal cellevekst, og for å minimalisere fibroblast forurensning, er det viktig å fjerne bindevevet som omgir den skjøre ekstrahepatiske kanalene nøye og omhyggelig under disseksjon og rengjøringstrinn (2.3, 2.4). Hvis det er vekst av fibroEksplosjonene, fjerning av det berørte området av tykk kollagen med en skalpell eller skånsom utsuging kan redusere overføring av fibroblaster før splitte celler. Disse cellene deler seg raskt i løpet av de tre første passasjer, men ved høyere passeringspunkter, bremser veksten, og cellene blir større og vacuolated. Vi har nå frosset prøver av cholangiocytes, og re-belagt dem på senere tidspunkt med utmerket levedyktighet; tinte cholangiocytes, men ikke replikere så fort som ferskt isolert og splitte cellene.
Figur 1. Kirurgisk utstyr bør settes opp i nærhet til vev kultur apparat. (A) Lyskilde er plassert bak dissekere mikroskop. (B) Kirurgisk utstyr inkluderer skarp scissors, hemostat, en buet taggete pinsett, og en buet un-taggete pinsett (C),.. Størrelse på en tre dagers gammel mus brukes for isoleringer (D) Pinsett holder felles gallegang i nyfødt mus.
Figur 2. Pure bestander av ekstrahepatiske cholangiocytes er isolert med minimal forurensning med mesenchymalceller. Cholangiocytes var farget med K19 (grønn) med DAPI kjernefysiske imaging (blå). Scale barer, 25 mikrometer.
| Media | Komponent | Beløp |
| Gentamicin | 0,5 ml | |
| Penicillin-Streptomycin | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (01:01) | 5 ml | |
| Galle epitelcelle (BEC) Media | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (01:01) | 500 ml | |
| M EM ikke-essensielle aminosyrer | 5 ml | |
| Insulin-transferrin-selen | 5 ml | |
| Na Pyruvat | 5 ml | |
| Kjemisk definerte lipid konsentrat | 5 ml | |
| Penicillin-Streptomycin | 5 ml | |
| Gentamicin | 0,2 ml | |
| Etanol | 0,13 ml | |
| 5 ml | ||
| Soyabønnetrypsininhibitor * | 5 ml | |
| L-glutamin | 5 ml | |
| Bovine hypofyseekstrakt | 1,1 ml | |
| Deksametason * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-trijod-L-tyronin * | 0,5 ml | |
| Epidermal vekstfaktor * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Lagringsmedia (for frysing celler) | Galle epitelcelle (BEC) media | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Steril FBS | 2 ml | |
| * Ingredienser må være forberedt på å passende konsentrasjoner før du legger inn media. Referer til materialliste for videre opplæring. | ||
Tabell 1. Media-komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en teknikk for å isolere rene cholangiocytes fra de ekstrahepatiske gallegangene av mus til mus i alle aldre, inkludert nyfødte. Teknikken har den fordelen at ekstrahepatiske cholangiocytes kan studeres separat fra intrahepatic cholangiocytes, og kan legge til rette for studier for å identifisere viktige forskjeller mellom disse populasjonene av cellene. Vi har nylig publisert en studie som viser redusert flimmerhårene i ekstrahepatiske cholangiocytes isolert ved denne metoden, og smittet med rhesus rotavirus åtte. Ulemper er at teknikken er arbeidskrevende og være nøyaktig disseksjon er nødvendig for å hindre forurensning fibroblast; I tillegg er utvekst og minst 3 uker i kultur for å oppnå tilstrekkelig celler for de fleste eksperimenter. Således kan disse celler gjenspeiler endringer i forbindelse med to-dimensjonal kultur. Det er foreløpig ikke fastslått om cellepopulasjoner innhentet omfatter betydelige antall stamceller eller celles fra peribiliary kjertler 9,10.
Vi forsøkte å bruke denne metoden for å isolere ekstrahepatiske cholangiocytes fra rotter; Imidlertid, celler kunne ikke vokse i kultur. Enten en viktig vekstfaktor mangler i kultur media eller om andre forhold må endres er for tiden under etterforskning.
Til syvende og sist, kan denne metoden å isolere ekstrahepatiske cholangiocytes bidra til å forstå forskjeller i intra-og ekstrahepatiske former for galle fibrose, samt forskjeller mellom nyfødte og voksne celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Molecular Pathology og Imaging Core av UPenn NIDDK Center for Molecular Studies i fordøyelse og leversykdommer (P30 DK50306) for å få hjelp med bildebehandling. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (R01 DK-092111) og fra Fred og Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (til RGW) og av et fellesskap fra barndommen Liver Disease Research and Education Network (til SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
