Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.
Overvågning dynamikken i protonisering og protein backbone kropsbygning ændringer i funktionen af et protein er et vigtigt skridt i retning af at forstå dens mekanisme. Protonering og konformationelle ændringer påvirker vibration mønster af aminosyresidekæder og peptidbindingen, henholdsvis, som begge kan probes ved infrarød (IR) forskel spektroskopi. For proteiner, hvis funktion kan være gentagne og reproducerbart udløst af lys, er det muligt at opnå infrarøde differensspektrene med (sub) mikrosekund opløsning over et bredt spektralområde ved hjælp af trin-scanning Fouriertransformation infrarød teknik. Med ~ 10 2 -10 3 gentagelser af fotoreaktion, at det minimale antal fuldføre en scanning på fornuftig spektral opløsning og båndbredde, kan støjniveauet i absorptionen differensspektrene være så lav som ~ 10 – 4, med tilstrækkeligt at følge kinetik protonering skifter fra en enkelt aminosyre. Laverestøjniveauer kan opnås ved flere data udjævning og / eller matematisk behandling. Mængden af protein, der kræves til optimale resultater er mellem 5-100 ug, afhængigt af den anvendte stikprøveteknik. Med hensyn til yderligere krav, der skal koncentreres først i en buffer med lav ionstyrke og derefter tørret til dannelse af en film proteinet. Proteinet Filmen hydratiseres inden forsøget, enten med små dråber af vand eller under kontrolleret luftfugtighed. Den opnåede hydreringsniveau (g vand / g protein) er målt fra en IR-absorptionsspektrum. At udstille den teknik, vi studerede photocycle af lys-drevne proton-pumpe bakterierhodopsin i sin oprindelige lilla membran miljø, og af lyset ionkanal channelrhodopsin-2 opløst i vaskemiddel.
For fuldt ud at belyse, hvordan proteiner udfører deres funktion, er det nødvendigt at måle dem, mens de arbejder, dvs langs en reaktion sti, der ofte involverer en række mellemprodukter og udvider flere ordrer tid. Vigtige skridt af protein funktion ofte finder sted i mikrosekund at millisekund område 1, navnlig backbone konformationsændringer og proton overfører reaktioner i membranproteiner. Røntgenkrystallografi, nok den søjle i strukturel biologi, giver statisk (tidsgennemsnitlig) elektron tætheder fra godt diffracting protein krystaller, notorisk vanskeligt at vokse med membranproteiner 2. En 3D atommodel kan bygges baseret på elektron tætheder, skønt sjældent, herunder placeringen af brintatomer. Bemærkelsesværdige fremskridt i tidsopløst røntgenkrystallografi, bygger enten på Laue diffraktion 3 eller på femtosekund X-ray pulser 4, tilføjer tidsdimensionen til høj strukturel information iherent til røntgenkrystallografi 5.. Men at afsætte tekniske og analytiske udfordringer, kan krystalgitter forringe backbone konformationsændringer og ændre protein dynamik, en uundgåelig mangel af metoder baseret på protein krystaller 5. Derfor er dynamiske aspekter af proteiner stadig bedst dækket af optiske metoder, som pioner ved flash fotolyse 6,7, dog med den generelle ulempe begrænset strukturel indsigt.
Fourier transformeret infrarød spektroskopi (FT-IR) kombinerer den tidsmæssige opløsning af optiske spectroscopies med en værdifuld følsomhed til protein struktur, sidste funktion udnyttes i utallige statiske strukturelle og funktionelle undersøgelser af membranproteiner 8-11. Især har FT-IR forskel spektroskopi vist sig at være et ideelt redskab til at studere små spektrale ændringer som et protein transitter fra en metastabil tilstand til en anden 12-19.
Studies om protein dynamik, bortset fra enkelt molekyle niveau 20,21, kræver en udløsende proces til synkronisering. En reaktion hensigtsmæssigt indledes hurtigt og ikke invasivt ved hjælp af lys, som udløser, som det gøres i studiet af proteiner med cykliske photoreactions. En stor udfordring er forbundet med tidsopløste studier er opnåelsen af tilstrækkelig tidsopløsning samtidig opretholde en god spektral opløsning og passende signal-til-støj-forhold. Også vigtigt er at dække en tilstrækkelig bred spektrale og temporale rækkevidde. Time-løst trin-scan FT-IR spektroskopi excellerer i alle disse aspekter 22, med offentliggjorte eksempler dækker spektralintervaller så bred som 3,900-850 cm -1 og dynamik udvide ~ 9 ordrer af tid, med op til 3,5 cm -1 spektral og 30 ns tidsopløsning 23-28.
Fourier-transform IR spektrometre udvise reduceret støj og forbedret fotometrisk nøjagtighed over dispersivt dem 29. Howevis, i den normale hurtige scan optagemetode FT-IR-spektrometre lider tid opløsning begrænset til ≥ 5-10 msek som følge af den minimale tid den mobile spejl interferometer kræver at fuldføre en scanning. Med trin-scan teknik, i modsætning, er tidsafhængighed den dynamiske begivenhed afkoblet fra scanningen varighed interferometer. Kort fortalt, de mobile spejl bevæger sig i diskrete trin snarere end kontinuerligt scanning for at fuldføre en scanning. På hvert af disse trin for (mobil) spejl holdes fast og en forbigående registreres. Således er den tid, opløsning begrænset af stigningen tidspunktet for kviksølv-cadmium-Telluride (MCT) detektor, der er typisk i intervallet 10-100 nsek. I praksis stort dynamikområde af interferogram (indeholdende et intenst signal i centerburst og små signaler i vingerne), kræver for korrekt digitalisering af en analog / digital konverter (ADC) med så mange som 16-24 bits, hvilket fører til prøveudtagning satser ikke højere end ~ 200 kHz(5 mikrosekunder) 30. Nanosekund tid opløsning kan opnås ved at måle kun de ændringer i interferogram, for hvilke en 8-12 bit ADC er tilstrækkelig 23,31-33. Tekniske aspekter 30,34,35 og applikationer 36-38 af tidsopløst trin-scan er blevet diskuteret i detaljer andetsteds.
Formålet med nuværende bidrag er at give en protokol, der beskriver de praktiske tidsopløst trin-scan FT-IR-spektroskopi på lysfølsomme membranproteiner. Her er resultaterne af teknikken vist for prøveudtagning to metoder: transmissions-og svækkede total refleksion (ATR). Brugen af ATR er muligt at arbejde i nærvær af overskydende vand, som ikke kun sikrer fuld hydrering betingelser for protein, men også giver mulighed for akut kontrol af prøven pH og ionstyrke 49,50. Trin-scan eksperimenter er illustreret på to udvalgte systemer: bakterierhodopsin og channelrhodopsin-2.
<p class="jove_content"> Lyset drevne protonpumpe bakterierhodopsin (BR) har været genstand for talrige biofysiske studier i over fyrre år 39,40, hvilket gør det til det bedste forstået membranproteinet hidtil. Blandt de mange teknikker, der anvendes til studiet af bR funktionalitet FT-IR-spektroskopi har velsagtens udøvet en af de største påvirkninger. Nemlig, har FT-IR spektroskopi været nøglen til at løse de involverede i proton overførsel over membranen grupper tegnede andetsteds 13,41,51.Channelrhodopsin (CHR) er det første lys ionkanal findes i naturen 42,43. Lys excitation af CHR fører til forbigående åbning af en ion-kanal. Dens opdagelse afgjort vejen for udviklingen af optogenetics, hvor molekylære processer styres af lys 44,45. Chr tilhører, som BR, til familien af mikrobielle rhodopsins men i modsætning til BR, er meget mindre kendt om dets funktionelle mekanisme 52.. ChR2 kombinerer sin funktion som et ion kanal med proton-pumpe aktivitet 46,47. For nylig ansøgte vi tidsopløst trin-scan FT-IR spektroskopi til at løse intra-protein reaktioner proton transferreglerne og dynamikken i protein backbone kropsbygning ændringer i ChR2 48.
En af de første aspekter, der bør tages i betragtning, når der udføres tidsopløste trin-scan FT-IR eksperimenter på et protein er forberedelsen af en prøve i en passende form for IR-spektroskopi. Brug IR absorption fra andre end det interessante protein stoffer, der skal reduceres, specielt det fra vand. Den mest almindelige fremgangsmåde er at fordampe størstedelen vand i prøven til dannelse af en film. Filmen kan rehydratiseres enten ved at tilføje nogle dråber af en vandig opløsning eller ved at udsætte filmen for en atmosfære med kontrolleret fugtighed. Vi har vist, hvordan i begge tilfælde er det muligt at estimere hydreringsniveau opnås ved hjælp af IR-spektroskopi (se figur 3 og 5). Selv om de opnåede hydrering niveauer kan synes lav i forhold til dem i opløsning, er de faktisk tæt på dem, der findes i levende celler 70, hvilket gør studiet af hydratiserede film af proteiner funktionelt relevante. Udover vand,er også vigtigt at vide og til at kontrollere mængden af lipid-eller detergent i prøven. Begge bør holdes lavt nok til at have en reduceret spektroskopisk effekt i IR-absorption, men høj nok til at bevare integriteten og funktionaliteten af proteinet af interesse.
Time-løst trin-scan spektroskopi er kun ligefremt gældende for proteiner viser reversible reaktioner, som kan udløses reproducerbart med lys (men se fremskridt i kobling trin-scanning med hurtig buffer udveksling) 71.. I trin-scan reaktionen skal være reproducerbar mindst ~ 500x, at det mindste antal fuldføre en interferogram dækker 1,800-850 cm -1 region 8 cm -1 opløsning. I praksis er der imidlertid yderligere data gennemsnitsberegning er generelt forpligtet til at skubbe støjniveauet nede. For 200 co-additions/mirror position (10 5 gentagelser af reaktionen) en 6,25 mikrosekunder opløsning absorbans differensspektrum kan vise en støj standard afvigelsen mellem 2 x 10 -5 og 2 x 10 -4 til en ATR og mellem 5 x 10 -6 og 3 x 10 -5 til en transmission eksperiment (figur 15). Takket være dens højere foton gennemløb, transmission giver mulighed for ~ 7 lavere støjniveau end ATR, et centralt aspekt for en vellykket undersøge prøver giver svage absorption ændringer såsom ChR2. På den anden side, ATR kræver 5 til 25 gange mindre prøve end en transmission eksperiment.
Anvendelsen af tidsopløst trin-scan FT-IR spektroskopi er problematisk for proteiner, der udviser langsomme photocycles: optagelse af en interferogram trin-scanning kan blive upraktisk lang. Nogle løsninger er blevet præsenteret for at behandle sådanne sager 72,73 ofte baseret på at bruge flere udskiftelige prøver at fremskynde målinger på bekostning af øget protein forbrug og eksperimentel kompleksitet 27,74. I nogle tilfælde er det muligt at omgå dette problem ved excitere prøven før den photocycle er strengt afsluttet. For ChR2 med en photocycle kræver efter foto-excitation 60 sek for 99% genvinding, nyttiggørelse på 4 sek er allerede på 80% 48. Med en excitation virkningsgrad på 10% pr laserpuls, 98% af ChR2 molekyler er i den mørke tilstand 4 sek efter foto-excitation, hvilket gør det muligt at udføre eksperimenter på en laser gentagelse sats på 0,25 Hz.
Databehandling er en endelig teknisk aspekt kræves for at opnå de bedst mulige resultater. Logaritmisk gennemsnitsberegning reducerer støj og også vigtigt, reducerer størrelsen af dataene uden forvridninger, en funktion afgørende for posteriore dataanalyse ved hjælp ental værdi dekomposition eller global montering. Logaritmisk gennemsnitsberegning er dog ikke meget vellykket i gennemsnit ud udsving i tids-spor forårsaget af svingninger i den mobile spejl og andre 1 / f støjkilder under målingerne (figur 9). Disse udsving i baselinekan overstige støjen i millisekunder og ødelægge kvaliteten af data. Singular værdi dekomposition drager fordel af redundans af data for at reducere støjen, og med visse ændringer 57 det kan reducere såvel udsving i baseline.
Endelig er den hårdere og mest tidskrævende del af en tid-løst trin-scan FT-IR eksperiment svarer til tildelingen af bands og spektrale og kinetiske fortolkning af data. For bakterierhodopsin mange af de bands optræder i IR differensspektrene har fået tildelt eller fortolket takket være det akkumulerede arbejde, som mange forskergrupper gennem årtier. For et langt mindre studeret protein, såsom channelrhodopsin-2, skal ledsages af parallelle eksperimenter på steddirigerede mutanter og kombineret med oplysninger fra komplementære teknikker til at nå en mekanistisk fortolkning 48 ovenstående præsenteret tidsopløste IR eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FT-IR spectrometer | Bruker | Vertex 80v | Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3. |
BaF2 windows | korth Kristalle | ||
diamond ATR accesory | Smiths detection | Nine-reflection DuraDisk | |
thermostatic bath | Julabo | F25 | |
vibration decoupled table | OPTA | ||
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator | Continuum electro-Optics | Minilite | |
Optical parametric oscillator (OPO) | OPTA | BBO-355-VIS/IR S/N 1009 | |
Digital delay/pulse generator | Stanford Research Systems | DG535 | |
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator | Spectra-Physics | Quanta-Ray | |
Various optical mirrors and lenses | ThorLabs | ||
OPUS 7.0 | Bruker | Software to control Vertex 80v spectrometer | |
Matlab run time | Mathworks | Used to run home-made executable programs to preprocess the data |