Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.
एक प्रोटीन के समारोह के दौरान protonation और प्रोटीन रीढ़ रचना में परिवर्तन की गतिशीलता मॉनिटरिंग अपने तंत्र को समझने की दिशा में एक आवश्यक कदम है. Protonation और गठनात्मक परिवर्तन अवरक्त (आईआर) अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जांच की जा सकती है, जो दोनों के क्रमशः अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला की और पेप्टाइड बांड की कंपन पैटर्न, प्रभावित करते हैं. जिसका समारोह प्रोटीन प्रकाश द्वारा repetitively और reproducibly चालू किया जा सकता है के लिए, यह फूरियर कदम स्कैन अवरक्त तकनीक का उपयोग करते हुए एक व्यापक वर्णक्रमीय सीमा पर (उप) microsecond संकल्प के साथ इन्फ्रारेड अंतर स्पेक्ट्रा प्राप्त करना संभव है. कैनेटीक्स का पालन करने के लिए पर्याप्त, 4 – photoreaction की ~ 10 2 -10 3 repetitions के साथ, न्यूनतम संख्या उचित वर्णक्रमीय संकल्प और बैंडविड्थ पर एक स्कैन पूरा करने के लिए, अवशोषण अंतर स्पेक्ट्रा में शोर स्तर ~ 10 जितनी कम किया जा सकता है एक एमिनो एसिड से protonation परिवर्तन. कमशोर का स्तर अधिक डेटा औसत और / या गणितीय प्रसंस्करण द्वारा पूरा किया जा सकता है. इष्टतम परिणामों के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा का इस्तेमाल किया नमूना तकनीक के आधार पर, 5-100 ग्राम के बीच है. अतिरिक्त आवश्यकताओं के बारे में, प्रोटीन पहले एक कम ईओण ताकत बफर में केंद्रित है और फिर एक फिल्म के लिए फार्म का सूख जाना चाहिए. प्रोटीन फिल्म पानी की छोटी बूंदों के साथ या नियंत्रित वायुमंडलीय नमी के तहत या तो प्रयोग करने से पहले हाइड्रेटेड है. प्राप्त कर ली जलयोजन स्तर (प्रोटीन का पानी / जी के छ) एक आईआर अवशोषण स्पेक्ट्रम से लगाया जाता है. तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, हम अपने देशी बैंगनी झिल्ली वातावरण में प्रकाश संचालित प्रोटॉन पंप bacteriorhodopsin का photocycle का अध्ययन किया, और प्रकाश gated आयन चैनल channelrhodopsin-2 के डिटर्जेंट में solubilized.
पूरी तरह से प्रोटीन उनके कार्य प्रदर्शन कैसे स्पष्ट करने के लिए, यह वे यानी अक्सर मध्यवर्ती की एक श्रृंखला शामिल है और समय के कई आदेशों फैली कि एक प्रतिक्रिया मार्ग के किनारे, काम के रूप में उन्हें मापने के लिए आवश्यक है. प्रोटीन समारोह का महत्वपूर्ण कदम अक्सर समय सीमा 1 millisecond के लिए microsecond में जगह ले, रीढ़ गठनात्मक परिवर्तन और झिल्ली प्रोटीन में प्रोटॉन स्थानान्तरण प्रतिक्रियाओं विशेष रूप से. एक्स – रे क्रिस्टलोग्राफी, संरचनात्मक जीव विज्ञान की यकीनन स्तंभ, झिल्ली प्रोटीन 2 के साथ विकसित करने के लिए बेहद मुश्किल है, अच्छी तरह diffracting प्रोटीन क्रिस्टल से स्थिर (समय औसतन) इलेक्ट्रॉन घनत्व प्रदान करता है. शायद ही कभी हाइड्रोजन परमाणुओं के स्थान सहित हालांकि एक 3 डी परमाणु मॉडल, इलेक्ट्रॉन घनत्व के आधार पर बनाया जा सकता है. Laue विवर्तन 3 पर या femtosecond एक्स – रे दालों 4 पर या तो भरोसा समय हल एक्स – रे क्रिस्टलोग्राफी, में उल्लेखनीय प्रगति, उच्च संरचनात्मक जानकारी में करने के लिए समय आयाम कहते हैंएक्स – रे क्रिस्टलोग्राफी से 5 Herent. लेकिन तकनीकी और विश्लेषणात्मक चुनौतियों निवारक, क्रिस्टल जाली रीढ़ गठनात्मक परिवर्तन ख़राब और प्रोटीन गतिशीलता, प्रोटीन क्रिस्टल 5 पर आधारित विधियों में से एक अपरिहार्य कमी को बदल सकते हैं. नतीजतन, प्रोटीन के dynamical पहलुओं अभी भी सबसे अच्छा फ़्लैश photolysis 6,7 ने बीड़ा उठाया है, के रूप में ऑप्टिकल तरीके से कवर किया, सीमित संरचनात्मक अंतर्दृष्टि के सामान्य दोष के साथ यद्यपि. कर रहे हैं
फूरियर तब्दील अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (फुट आईआर) प्रोटीन संरचना, झिल्ली प्रोटीन 8-11 पर असंख्य स्थिर संरचनात्मक और कार्यात्मक जांच में शोषण पिछले सुविधा के लिए एक मूल्यवान संवेदनशीलता के साथ ऑप्टिकल spectroscopies का अस्थायी समाधान को जोड़ती है. विशेष रूप से, फुट आईआर अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक और 12-19 के लिए एक metastable राज्य से एक प्रोटीन पारगमन के रूप में छोटे वर्णक्रमीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण साबित हो गया है.
पढ़ाईएक अणु स्तर 20,21 में अन्य की तुलना में प्रोटीन की गतिशीलता,, पर तुल्यकालन के लिए एक ट्रिगर प्रक्रिया की आवश्यकता होती है. चक्रीय photoreactions साथ प्रोटीन के अध्ययन में किया के रूप में एक प्रतिक्रिया सुविधापूर्वक ट्रिगर के रूप में प्रकाश के उपयोग invasively तेजी से और नहीं शुरू की है. अच्छा वर्णक्रमीय संकल्प और उचित संकेत करने वाली शोर अनुपात को बनाए रखते हुए समय हल पढ़ाई के साथ जुड़े एक बड़ी चुनौती के लिए पर्याप्त समय संकल्प की प्राप्ति है. इसके अलावा आवश्यक एक पर्याप्त व्यापक वर्णक्रमीय और अस्थायी रेंज को कवर करने के लिए है. समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रकाशित उदाहरण 3,900-850 मुख्यमंत्री के रूप में के रूप में व्यापक वर्णक्रमीय सीमाओं को कवर -1 और गतिशीलता अप करने के लिए 3.5 सेमी के साथ, ~ समय की 9 आदेशों का विस्तार -1 वर्णक्रम के साथ, इन पहलुओं 22 के सभी में excels और 30 nsec अस्थायी समाधान 23-28.
फूरियर बदलने आईआर स्पेक्ट्रोमीटर फैलानेवाला वाले 29 से अधिक कम शोर और बेहतर भामिति सटीकता दिखा. Howevएर, सामान्य तेजी से स्कैन रिकॉर्डिंग मोड में फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर व्यकिकरणमीटर के मोबाइल दर्पण एक स्कैन पूरा करने की आवश्यकता है कम से कम समय का एक परिणाम के रूप में ≥ 5-10 मिसे तक सीमित एक समय संकल्प से ग्रस्त हैं. कदम स्कैन तकनीक के साथ, इसके विपरीत, गतिशील घटना के समय निर्भरता व्यकिकरणमीटर का स्कैन अवधि से decoupled है. संक्षेप में, असतत चरणों के बजाय में मोबाइल दर्पण चाल लगातार एक स्कैन पूरा करने के लिए स्कैनिंग. इनमें से प्रत्येक चरण में (मोबाइल) दर्पण तय आयोजित किया जाता है और एक क्षणिक दर्ज की गई है. इस प्रकार, समय संकल्प पारा, कैडमियम Telluride 10-100 nsec की रेंज में आम तौर पर है जो (एमसीटी) डिटेक्टर, के उदय के समय से सीमित है. अभ्यास में, (पंख में centerburst और छोटे संकेतों में एक तीव्र संकेत युक्त) interferogram की बड़ी गतिशील रेंज, नमूने के लिए अग्रणी के रूप में कई 16-24 के रूप में बिट्स के साथ उचित डिजिटिकरण एक एनालॉग / डिजिटल कनवर्टर (एडीसी) के लिए की आवश्यकता ~ 200 kHz से अधिक नहीं दरें(5 μsec) 30. Nanosecond समय संकल्प एक 8-12 बिट एडीसी पर्याप्त 23,31-33 है जिसके लिए interferogram में ही परिवर्तन को मापने के द्वारा पूरा किया जा सकता है. तकनीकी पहलुओं 30,34,35 और अनुप्रयोगों समय हल कदम स्कैन की 36-38 अन्यत्र विस्तार से चर्चा की गई है.
वर्तमान योगदान के उद्देश्य सहज झिल्ली प्रोटीन पर समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के चलन का वर्णन एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है. पारेषण और तनु कुल प्रतिबिंब (एटीआर): यहाँ, तकनीक का प्रदर्शन दो नमूने तरीकों के लिए दिखाया गया है. एटीआर का उपयोग प्रोटीन के लिए पूर्ण जलयोजन स्थितियां सुनिश्चित करता है लेकिन यह भी नमूना पीएच और ईओण ताकत 49,50 की तीव्र नियंत्रण की अनुमति देता है, जो न केवल अतिरिक्त पानी की उपस्थिति में काम करने की अनुमति देता है. Bacteriorhodopsin और channelrhodopsin-2: कदम स्कैन प्रयोगों दो चयनित सिस्टम पर सचित्र हैं.
<p class="jove_content"> प्रकाश संचालित प्रोटॉन पंप bacteriorhodopsin (बीआर) यह अब तक का सबसे अच्छा समझा झिल्ली प्रोटीन बनाने, चालीस साल से अधिक 39,40 के लिए कई biophysical पढ़ाई का विषय रहा है. BR कार्यक्षमता फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का अध्ययन करने के लिए आवेदन कई तकनीकों के बीच यकीनन सबसे बड़ी प्रभावों में से एक exerted है. अर्थात्, फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी कहीं 13,41,51 हिसाब रूप में झिल्ली भर प्रोटॉन हस्तांतरण में शामिल समूहों को हल करने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है.Channelrhodopsin (CHR) प्रकृति 42,43 में पाया पहला प्रकाश gated आयन चैनल है. Chr की हल्की उत्तेजना एक आयन चैनल का क्षणिक खोलने के लिए जाता है. इसकी खोज आणविक प्रक्रियाओं प्रकाश 44,45 द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं, जहां optogenetics, के विकास के लिए जिस तरह से बसे. Chr माइक्रोबियल rhodopsins के परिवार के लिए, br के रूप में, के अंतर्गत आता है लेकिन BR के विपरीत, बहुत कम अपनी कार्य प्रणाली 52 के बारे में जाना जाता है. ChR2 एक आईओ के रूप में अपने कार्य को जोड़ती हैप्रोटॉन पंप गतिविधि 46,47 के साथ n चैनल. हाल ही में, हम इंट्रा प्रोटीन प्रोटॉन हस्तांतरण प्रतिक्रियाओं और ChR2 48 में प्रोटीन रीढ़ रचना में परिवर्तन की गतिशीलता को हल करने के लिए समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी आवेदन किया.
एक प्रोटीन पर समय हल कदम स्कैन फुट आईआर प्रयोगों प्रदर्शन जब विचार की जरूरत है कि पहली पहलुओं में से एक आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एक उपयुक्त प्रपत्र में एक नमूना की तैयारी है. ब्याज की प्रोटीन के अलावा अन्य पदार्थों से आईआर अवशोषण कम किया जाना चाहिए, विशेष रूप से पानी से है. सबसे आम तरीका एक फिल्म के लिए फार्म का नमूना के थोक पानी लुप्त हो जाना है. फिल्म एक जलीय घोल की कुछ बूंदों जोड़कर या नियंत्रित नमी का वातावरण करने के लिए इस फिल्म को उजागर करके या तो rehydrated किया जा सकता है. हम दोनों ही मामलों में यह आईआर अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त जलयोजन स्तर (चित्रा 3 और 5 चित्र देखें) का अनुमान कैसे संभव है पता चला है. प्राप्त जलयोजन स्तर समाधान में उन लोगों की तुलना में कम दिखाई दे सकता है, वे कार्यात्मक प्रासंगिक प्रोटीन की हाइड्रेटेड फिल्मों का अध्ययन कर रही है, वास्तव में जीवित कोशिकाओं के 70 में पाए जाने वाले के करीब हैं. पानी के अलावा, यहपता करने के लिए और नमूने में लिपिड या डिटर्जेंट की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. दोनों आईआर अवशोषण में एक कम स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रभाव पड़ता है काफी कम रखा है, लेकिन ब्याज की प्रोटीन की अखंडता और कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त उच्च किया जाना चाहिए.
समय हल कदम स्कैन स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रकाश द्वारा reproducibly शुरू हो सकता है कि प्रतिवर्ती प्रतिक्रियाओं दिखा प्रोटीन के लिए केवल straightforwardly लागू है (लेकिन तेजी से बफर मुद्रा के साथ कदम स्कैन युग्मन में प्रगति देखें) 71. में प्रतिक्रिया में कम से कम ~ 500x के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की आवश्यकता है कदम स्कैन, न्यूनतम संख्या 8 सेमी -1 संकल्प पर 1,800-850 सेमी -1 क्षेत्र को कवर एक interferogram पूरा करने के लिए. व्यवहार में, हालांकि, अतिरिक्त डेटा औसत आम तौर पर नीचे शोर स्तर पुश करने के लिए आवश्यक है. 200 co-additions/mirror स्थिति (प्रतिक्रिया की 10 5 repetitions) के लिए एक 6.25 μsec संकल्प absorbance के अंतर स्पेक्ट्रम एक शोर स्टेशन प्रदर्शित कर सकते हैंndard विचलन एक एटीआर के लिए और -5 10 एक्स -6 10 एक्स 5 और 3 के बीच एक संचरण प्रयोग (चित्रा 15) के लिए -4 10 एक्स -5 10 एक्स 2 के बीच और 2. इसकी उच्च फोटॉन throughput, संचरण के लिए धन्यवाद एटीआर, सफलतापूर्वक ऐसी ChR2 के रूप में कमजोर अवशोषण परिवर्तन देने के नमूनों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू से ~ 7 कम शोर के स्तर के लिए अनुमति देता है. दूसरी ओर, एटीआर एक प्रसारण प्रयोग से 5 बार से 25 कम नमूना की आवश्यकता है.
समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन धीमी photocycles प्रदर्शित प्रोटीन के लिए समस्याग्रस्त है: चरण स्कैन करके एक interferogram रिकॉर्डिंग लंबे अव्यावहारिक बन सकता है. कुछ समाधान अक्सर वृद्धि की प्रोटीन की खपत और प्रयोगात्मक जटिलता 27,74 की कीमत पर माप तेजी लाने के लिए कई विनिमेय नमूनों के प्रयोग पर आधारित ऐसे मामलों 72,73, से निपटने के लिए प्रस्तुत किया गया है. कुछ उदाहरणों में यह पूर्व से इस समस्या को नाकाम करने के लिए संभव हैphotocycle सख्ती से पूर्ण होने से पहले नमूना हवाला देते हुए. ChR2 के लिए, 99% वसूली के लिए फोटो उत्तेजना 60 सेकंड के बाद की आवश्यकता होती है एक photocycle साथ, 4 सेकंड में वसूली पहले ही 80% 48 की है. लेजर पल्स दर 10% के एक उत्तेजना दक्षता के साथ, ChR2 अणुओं का 98% 0.25 हर्ट्ज के लिए एक लेजर पुनरावृत्ति दर पर प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए संभव बनाने, फोटो उत्तेजना के बाद अंधेरा राज्य 4 सेकंड में कर रहे हैं.
डाटा प्रोसेसिंग के लिए सर्वोत्तम संभव परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक एक अंतिम तकनीकी पहलू है. लघुगणक औसत शोर कम कर देता है और, यह भी महत्वपूर्ण है, विलक्षण मान अपघटन या वैश्विक फिटिंग का उपयोग, विकृतियों के बिना पीछे डेटा विश्लेषण के लिए एक सुविधा आवश्यक डेटा का आकार कम कर देता है. लघुगणक औसतन, तथापि, माप के दौरान मोबाइल दर्पण और अन्य 1 / च शोर स्रोतों (9 चित्रा) में दोलनों के कारण समय निशान में उतार चढ़ाव बाहर के औसत में बहुत सफल नहीं है. आधारभूत में ये उतार चढ़ावmillisecond रेंज और डेटा की भ्रष्ट गुणवत्ता में शोर अधिक हो सकती है. एकवचन मान अपघटन शोर को कम करने के लिए डेटा के अतिरेक का लाभ लेता है, और कुछ संशोधनों के 57 के साथ यह रूप में अच्छी तरह से आधारभूत में उतार चढ़ाव को कम कर सकते हैं.
अंत में, एक समय हल कदम स्कैन फुट आईआर प्रयोग के लिए कठिन है और सबसे अधिक समय लेने हिस्सा बैंड के काम करने के लिए और डेटा का वर्णक्रम और गतिज व्याख्या से मेल खाती है. Bacteriorhodopsin लिए आईआर अंतर स्पेक्ट्रा में प्रदर्शित होने के बैंड के कई दशकों में कई शोधकर्ता समूहों की संचित काम करने के लिए धन्यवाद सौंपा या व्याख्या की गई है. ऐसे channelrhodopsin-2 के रूप में एक बहुत कम अध्ययन प्रोटीन, के लिए, ऊपर प्रस्तुत समय हल आईआर प्रयोगों साइट निर्देशित म्यूटेंट पर समानांतर प्रयोगों के साथ और एक यंत्रवत व्याख्या 48 तक पहुँचने के लिए पूरक तकनीकों से जानकारी के साथ संयुक्त किया जाना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FT-IR spectrometer | Bruker | Vertex 80v | Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3. |
BaF2 windows | korth Kristalle | ||
diamond ATR accesory | Smiths detection | Nine-reflection DuraDisk | |
thermostatic bath | Julabo | F25 | |
vibration decoupled table | OPTA | ||
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator | Continuum electro-Optics | Minilite | |
Optical parametric oscillator (OPO) | OPTA | BBO-355-VIS/IR S/N 1009 | |
Digital delay/pulse generator | Stanford Research Systems | DG535 | |
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator | Spectra-Physics | Quanta-Ray | |
Various optical mirrors and lenses | ThorLabs | ||
OPUS 7.0 | Bruker | Software to control Vertex 80v spectrometer | |
Matlab run time | Mathworks | Used to run home-made executable programs to preprocess the data |