Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.
단백질의 기능 중에 양성자 및 단백질 골격 형태의 변화의 역학 모니터링 메커니즘의 승낙 향한 필수적인 단계이다. 양성자 및 형태 적 변화는 적외선 (IR)의 차이 스펙트럼에 의해 탐색 할 수있는 둘 다 각각의 아미노산 측쇄와 펩티드 결합의 진동 패턴을, 영향을 미친다. 그 기능 단백질이 빛으로 반복 재현성 트리거 될 수 들어, 푸리에 변환 스텝 스캔 적외선 기술을 이용하여 넓은 스펙트럼 범위 (서브) 마이크로 초 해상도 적외선 차이 스펙트럼을 얻는 것이 가능하다. 의 반응 속도를 수행하기에 충분한, 4 – 광 반응의 ~ 10 2 -10 3 반복으로, 최소한의 합리적 스펙트럼 해상도와 대역폭에서 검사를 완료하기 위해, 흡수 차이 스펙트럼의 잡음 레벨 ~ 10의 낮은 될 수 있습니다 하나의 아미노산에서 양성자 변경됩니다. 보다 낮은소음 수준은 더 많은 데이터를 평균화 및 / 또는 수학적 처리에 의해 달성 될 수있다. 최적의 결과를 위해 필요한 단백질의 양은 사용되는 샘플링 기법에 따라, 5-100 μg 사이이다. 추가 요구에 대하여, 단백질은 우선 낮은 이온 세기 완충액에서 농축 한 후 필름을 형성, 건조 될 필요가있다. 단백질 막은 물의 작은 물방울 또는 제어 된 대기 습도 하에서도, 종래의 실험에 수화된다. 달성 수화 레벨 (단백질의 물 / g의 g)은 IR 흡수 스펙트럼으로부터 계측된다. 기술을 소개하기 위해, 우리는 네이티브 보라색 막 환경에서 빛을 주도 프로톤 펌프 박테리오로돕신의 photocycle을 공부하고, 빛 게이트 이온 채널 channelrhodopsin-2의 세제를 용해.
완전 단백질은 그들의 기능을 수행하는 방법을 설명하기 위하여, 그것은 그들이 즉 종종 중간체의 시리즈를 포함하고시의 여러 명령을 연장 반응 경로를 따라, 작업으로 그들을 측정하도록 요구된다. 단백질 기능의 주요 단계는 종종 시간 범위 1 밀리 초 마이크로 초에서 개최, 백본 구조적 변화와 막 단백질의 양성자 이동 반응, 특히. X-선 결정학, 구조 생물학의 거의 틀림없이 기둥, 막 단백질이 함께 성장하기 어렵기로 악명이 잘 회절 단백질 결정에서 정적 (시간 평균)의 전자 밀도를 제공합니다. 거의 수소 원자의 위치를 포함한 없지만 원자 3D 모델은, 전자 밀도에 기초하여 구축 될 수있다. 라우에 회절 3 또는 펨토초 X-선 펄스 4 중 하나를 의존하는 시간 분해 X-선 결정학에서 괄목할만한 진전이 높은 구조 정보에에 시간 차원을 추가X-선 결정학 5 herent. 그러나 기술 및 분석 과제를 별도로 설정, 결정 격자 백본 구조적인 변경을 손상과 단백질 역학, 단백질 결정 (5)에 기반 방법의 피할 수없는 단점을 변경할 수 있습니다. 따라서, 단백질의 동적 인 측면은 여전히 최고의 플래시 광분해 6,7에 의해 개척으로, 광학 방법으로 적용, 제한 구조 통찰력의 일반적인 단점과 함께하지만.된다
퓨리에 변환 적외선 분광기 (FT-IR)는 단백질 구조, 막 단백질 8-11에 무수한 정적 구조 및 기능 연구에 악용 마지막 기능에 가치 감도 광학 분광기의 시간 해상도를 결합합니다. 특히, FT-IR의 차이 분광기는 다른 12-19 하나의 준 안정 상태에서 단백질의 이동로와 같은 작은 스펙트럼의 변화를 연구 할 수있는 이상적인 도구로 입증되었습니다.
Studie단일 분자 수준 (20, 21)에서보다 다른 단백질 역학에의 동기화를위한 트리거 과정을 필요로한다. 순환 광 반응과 단백질의 연구에서 수행으로 반응은, 트리거로 빛을 사용하여 침습적 빠르고하지 시작됩니다. 좋은 스펙트럼 해상도와 원하는 신호 – 대 – 잡음 비를 유지하면서 시간 분해 연구와 관련된 주요 문제는 충분한 시간 해상도의 달성이다. 또한 필수는 충분히 넓은 스펙트럼 및 시간 범위를 커버하는 것입니다. 시간이 해결 단계 스캔 FT-IR 분광법 출판 예 3,900-850 cm로 넓은 스펙트럼 범위를 커버 -1 역학 최대 3.5 cm로, ~ 시간의 9 주문을 연장 -1 스펙트럼을,이 측면 (22) 모두 우수 30 나노초 시간 해상도 23-28.
푸리에 변환 적외선 분광기는 분산 사람 29 이상 감소 된 소음과 향상된 광도 정확성을 보여줍니다. Howev어, 보통 빠른 스캔 촬영 모드에서 FT-IR 분광계는 간섭계의 모바일 미러 스캔을 완료하는 데 필요한 최소 시간의 결과로 ≥ 5 ~ 10 밀리 초 제한 시간 해상도의 고통. 스텝 주사 기법과 대조적으로, 동적 이벤트의 시간 의존성은 간섭계의 스캔 구간에서 분리된다. 요약하면, 별도의 단계가 아니라에서 모바일 미러 움직임은 지속적으로 검사를 완료하기 위해 스캔. 각 단계에서 (모바일) 미러가 고정 개최되는 과도가 기록됩니다. 따라서, 시간 해상도는 수은 – 카드뮴 – 텔루 라이드 10 내지 100 나노초의 범위에 일반적으로 (MCT) 검출기의 상승 시간에 의해 제한된다. 실제로, (날개 centerburst 작은 신호에 강렬한 신호를 포함) 간섭 무늬의 넓은 동적 범위, 샘플링에 이르는 많은 16-24로 비트 적절한 디지털화 아날로그 / 디지털 변환기 (ADC)를위한 필요 ~ 200 kHz의 이상하지 환율(5 마이크로 초) 30. 나노초의 시간 분해능은 8 ~ 12 비트 ADC가 충분 23,31-33되는 간섭 무늬 만 변화를 측정함으로써 달성 될 수있다. 기술적 인 측면 30,34,35 및 응용 프로그램 시간이 해결 단계 스캔의 36 ~ 38는 다른 곳에서 자세히 설명하고 있습니다.
현재 포스팅의 목적은 감광성 막 단백질에 대한 시간 분해 스텝 스캔 FT-IR 분광법의 실용성을 기술하는 프로토콜을 제공하는 것이다. 전송 및 감쇠 전반사 (ATR) : 여기에, 기술의 성능은 두 가지 샘플링 방법에 대해 표시됩니다. ATR의 사용은 단백질 전체 수분 조건을 보장뿐만 아니라 샘플의 pH와 이온 강도 49,50 급성 제어 할 수 있습니다뿐만 아니라 여분의 수분의 존재에서 작업 할 수 있습니다. 박테리오로돕신 및 channelrhodopsin-2 단계 – 스캔 실험은 두 가지 선택 시스템에서 설명된다.
<p class="jove_content"> 빛 구동 프로톤 펌프 박테리오로돕신 (BR)은 그것을 지금까지 가장 잘 이해 막 단백질 결정, 40 년 39,40 수많은 생물 물리학 연구의 대상이되고있다. BR 기능 FT-IR 분광법의 연구에 적용된 다양한 기술 중 거의 틀림없이 가장 큰 영향을 발휘하고있다. 즉, FT-IR 분광기는 다른 13,41,51 차지로 막에서 양성자 전달에 포함 된 그룹을 해결하는 열쇠이다.Channelrhodopsin (CHR)는 자연 42,43에서 발견되는 첫 번째 빛 – 게이트 이온 채널이다. CHR의 광 여진은 이온 채널의 과도 개구로 이끈다. 그 발견은 분자 프로세스 등 44, 45에 의해 제어되는 optogenetics의 개발을위한 방법을 정착했다. CHR 미생물 rhodopsins의 가족에, BR로, 속하지만 BR 대조적으로, 훨씬 덜은 그 기능기구 (52)에 대해 잘 알려져 있습니다. ChR2는 IO로서의 기능을 겸비한양성자 펌프 활동 (46, 47)와 N 채널. 최근에, 우리는 내 단백질 양성자 전달 반응과 ChR2 48 단백질의 백본 형태 변화의 역 동성을 해결하기 위해 시간이 해결 단계 스캔 FT-IR 분광법을 적용했다.
단백질에 대한 시간 분해 스텝 스캔 FT-IR 실험을 수행 할 때 고려할 필요 첫번째 측면 중 하나는 IR 분광법에 적합한 형태로 시료의 준비이다. 또한 단백질 이외의 물질에서 IR 흡수를 감소시킬 필요가있다, 특히 물이. 가장 일반적인 방법은 필름을 형성하기 위해 샘플의 벌크 물이 증발한다. 필름은 수용액 중 일부 방울을 추가하여 또는 제어 다습 분위기에 막을 노출시킴으로써 하나 재수 화 될 수있다. 우리는 두 경우 모두는 IR 흡광 법에 의해 얻어진 수화 레벨 (도 3 및도 5 참조)를 추정 할 수있다 방법을 보여 주었다. 얻어진 수화 수준이 솔루션에 비해 낮은 나타날 수 있지만, 그들은 기능적으로 관련 단백질의 수화 필름의 연구를하고, 실제로 살아있는 세포 (70)에서 발견 된 것과 가까이에 있습니다. 물 게다가,알고 및 샘플 지질 또는 세제의 양을 제어하는 것도 중요하다. 모두 IR 흡수가 감소 분광 영향을 충분히 낮게 유지하지만, 그 단백질의 무결성과 기능성을 유지하기 위해 충분히 높아야한다.
시간이 해결 단계 스캔 분광법은 빛에 의해 재현성 트리거 할 수있는 가역 반응을 나타내는 단백질 만 똑 바르게 적용 할 수있다 (단, 빠른 버퍼 교환 단계 스캔 결합에서 진행 상황을 참조) 71. 에서의 반응은 적어도 ~ 500X에 재현 할 필요가 스텝 검사, 최소 8 ㎝ -1 해상도 1,800-850 cm -1 영역을 커버하는 간섭 무늬를 완료합니다. 그러나 실제로는, 추가 데이터 평균화 일반적 다운 잡음 레벨을 누르는 것이 요구된다. 200 co-additions/mirror 위치 (반응의 열 다섯 번 반복)의 경우 6.25 마이크로 초 해상도 흡광도 차이 스펙트럼 잡음 STA를 표시 할 수있다ndard 편차 ATR과 -5 10 × -6 10 × 5 ~ 3 전송 실험 (그림 15)에 대한 -4 10 × 10-5 × 2 사이 2. 더 높은 광자 처리, 전송 덕분에 ATR, 성공적으로 ChR2 약한 흡수 변화를주는 샘플을 연구하기위한 핵심 요소보다 ~ 7 낮은 소음 레벨을 허용한다. 한편, ATR은 전송 실험을 5 회 이상 25 이하의 샘플을 필요로한다.
시간이 해결 단계 스캔 FT-IR 분광법의 응용 프로그램이 느린 photocycles를 표시하는 단백질에 대한 문제가있다 : 단계 스캔에 의해 간섭 무늬를 기록하는 것은 긴 비실 될 수 있습니다. 일부 솔루션들은 종종 증가 된 단백질 소비 및 실험 27,74 복잡성의 비용으로 측정 속도를 체류 교환 샘플 사용에 기초하여 그러한 경우 72, 73, 취급을 위해 제시되었다. 어떤 경우에는 EX하여이 문제를 회피 할 수있다photocycle 엄격히 완료되기 전에 샘플을 인용. ChR2를 들어, 99 %의 복구를위한 광 여기 60 초 후 필요로하는 photocycle으로, 4 초에 복구가 이미 80 % 48입니다. 레이저 펄스 당 10 %의 여기 효율과, ChR2 분자의 98 %는 0.25 Hz에서 레이저 반복율에서 실험을 수행하는 것이 가능하게, 광 여진 후 어두운 상태에서 4 초이다.
데이터 처리는 최상의 결과를 얻기 위해 요구되는 최종 기술적 측면이다. 대수 평균화는 노이즈를 감소시키고, 또한 중요, 특이 값 분해 또는 해외 피트를 사용하여, 왜곡없이 후방 데이터 분석 기능을 필수 데이터의 크기를 감소시킨다. 대수 평균, 그러나, 측정하는 동안 이동 거울와 다른 1 / f 노이즈 소스 (도 9)에서의 진동으로 인한 시간 트레이스의 변동을 평균화 매우 성공적이지. 베이스 라인에서의 이러한 변동밀리 초 단위의 범위와 데이터의 손상 품질의 노이즈를 초과 할 수 있습니다. 특이 값 분해는 소음을 줄이기 위해 데이터의 중복을 활용하고, 일부 수정 (57)와 그것뿐만 아니라 기저선 변동을 감소시킬 수있다.
마지막으로, 시간 분해 스텝 스캔 FT-IR 실험 어려워 가장 시간이 많이 걸리는 부분 대역들의 할당 및 상기 데이터의 스펙트럼 및 역학적 해석에 대응한다. 박테리오로돕신에 대한 IR 차이 스펙트럼에 나타나는 밴드의 많은 수십 년 동안 많은 연구자 그룹의 축적 된 작업 덕분에 할당하거나 해석되었다. 이러한 channelrhodopsin-2와 같은 훨씬 덜 연구 된 단백질의 경우, 위의 발표 시간이 해결 IR 실험은 사이트 감독 돌연변이에 병렬 실험을 동반하고 기계적인 해석 (48)에 도달하는 보완 기술의 정보와 결합 될 필요가있다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FT-IR spectrometer | Bruker | Vertex 80v | Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3. |
BaF2 windows | korth Kristalle | ||
diamond ATR accesory | Smiths detection | Nine-reflection DuraDisk | |
thermostatic bath | Julabo | F25 | |
vibration decoupled table | OPTA | ||
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator | Continuum electro-Optics | Minilite | |
Optical parametric oscillator (OPO) | OPTA | BBO-355-VIS/IR S/N 1009 | |
Digital delay/pulse generator | Stanford Research Systems | DG535 | |
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator | Spectra-Physics | Quanta-Ray | |
Various optical mirrors and lenses | ThorLabs | ||
OPUS 7.0 | Bruker | Software to control Vertex 80v spectrometer | |
Matlab run time | Mathworks | Used to run home-made executable programs to preprocess the data |