Summary
細胞および分子新組織形成の我々の知識を向上させるために、TEVGのマウスモデルは、最近開発されました。グラフトは、C57BL / 6マウスにおける大動脈大静脈介在移植片として移植した。このモデルは、私たちの臨床研究で達成されるものと同様の結果を達成するが、はるかに短縮され、時間経過とともに。
Abstract
骨髄単核細胞（のBMC）を播種した生分解性の足場は、しばしば、先天性心臓異常を治療するための再建手術のために使用される。長期臨床結果は、狭窄の有意な発生率が、優れた開存率を示した。血管新組織形成の細胞および分子機構を調査し、組織工学血管移植片（TEVGs）に狭窄発症を予防するために、我々は、約1mmの内径を有する移植片のマウスモデルを開発した。まず、ポリグリコール酸不織布から製造生分解性の管状の足場から組み立てたTEVGs、ε-カプロラクトンとL-ラクチド共重合体でコーティングされたメッシュと感じました。足場は、次いで、凍結乾燥機に入れ、24時間真空にし、細胞播種するまでデシケーター中に保存した。次に、骨髄を、ドナーマウスから採取し、単核細胞を、密度勾配遠心分離によって単離した。第三に、約100万個の細胞であった足場に播種し、O / Nインキュベート最後に、播種された足場は、その後、C57BL / 6マウスにおける大動脈大静脈介在移植片として移植した。注入された移植片は、血栓塞栓合併症や動脈瘤の形成の証拠がなく、優れた開存性（> 90％）を示した。このマウスモデルは、理解で私たちを助け、TEVGに新組織形成の細胞および分子メカニズムを定量化します。
Introduction
先天性心疾患は、米国の出生の約8％に影響を与える深刻な状況である。先天性心疾患または2.4千あたりの出生とのそれらの乳児の約25％が、自分の人生1の最初の年に侵襲的な治療を必要とする。先天性心疾患のための最も有効な治療は、再建手術である。残念ながら、現在利用可能な血管導管の使用に起因する合併症は術後の罹患率と死亡率の最も重要な原因である。
この問題に対処するために、我々は、臨床使用のために第2組織工学血管移植片（TEVGs）を開発した。 TEVGsは、自家骨髄由来の、単核細胞（BM-MNCを）を播種し、先天性心臓手術のための静脈の導管として移植生分解性ポリエステルチューブから構築した。結果は、フォローアップの1〜3年で優れた開存率を示したが、狭窄の重要な発生率
マウスのIVC介在モデルを忠実に大型動物やヒトで発生する新生血管形成の過程をで要約するが、はるかに短い時間経過6-9以上。ここで、生分解性の足場を用いた小規模な移植片の製造のための詳細なプロトコルは、BM-MNCの回収と単離、足場上のBM-MNCの播種、およびマウスモデルにおける移植片植え込みについて説明した。
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Protocol
注：すべての動物の手続きは、全国の小児病院施設内動物管理使用委員会によって承認された。
1。グラフトづくり
- ヒュームフードの下に2ミリリットルのジオキサンに100mgのPは（LA / CL）を追加することにより、ε-カプロラクトンとL-ラクチド共重合体P（LA / CL）の溶液を作製。渦上に溶液を置き、完全に溶解する1〜1.5時間、連続して混ぜる。
- 一方、ポリグリコール酸（PGA）のシートを削除冷凍庫から感じた、いくつかの5×8ミリメートルの部分を切り取る。また、単にフィルター上0.1〜10μlのピペットの先端を切り落とした。
- ピペットチップの先端部に19gの針（1.5長さ）を挿入し、PGAはマイクロピンセットを用いて、針の周りに感じ包む。
- 19 Gの針をその中に挿入されている間、慎重に、内腔が鈍い18 Gの針を使用して、近位部よりも直線的であるピペットチップの先端にフェルトを押してください。
- ピペット上からピペットチップに40μlのP（CL / LA）ソリューションを提供します。 PGAは、溶液と感じ飽和する。次いで、ピペットディスペンサーを用いて気泡を押し出す。 必要な場合には、このプロセスを繰り返す。
- 場所の50ミリリットルチューブ内移植片および20分間-80℃の冷凍庫に入れてください。針の頭は下向きにしてください。
- 24時間凍結乾燥し、真空中にチューブを移す。空気の流れを持っているチューブの蓋を開けていることを確認してください。
- 移植片を取り出し、針から削除します。 〜5ミリメートルのセクションを残して、移植片の両端をカットし、その形状を維持するために、針の上に戻ってそれらを置く。デシケーター中での移植片を保管してください。
- バイオセーフティーフードのO / Nの前に細胞播種のUV光の下で足場を置きます。
2。骨髄単核細胞の回収および単離
- ケタミン/キシラジンの過剰摂取（ケタミン、200 mg / kgのキシラジンと、20 mg / kg）を持つマウスを安楽死させる。
- 骨（大腿骨をAN削除する10 CCのRPMIでペトリ皿中10移植注入や場所のための3匹のマウスからDの脛骨）。 3のCC RPMIで新しいペトリ皿に25 G針で注射器を用いて骨とフラッシュ骨髄の両端をカットします。 15 CC管内に骨髄およびRPMI液を収集し、BMの残りの部分を収集するために、追加の2のCC RPMIでペトリ皿を洗う。
- サンプル（5〜10μl）を取り、 自動細胞カウンターまたは血球計数器を用いて細胞を数える。その結果を記録します。
- 15 CC遠心管に5のCCフィコールを入れて、骨髄およびRPMIソリューションを追加します。フィコールと混合するのを防ぐために非常に穏やかに溶液を入れる。
- 24℃で「ブレーキなし」と30分間528×gで遠心分離
- 上側のピンクの層を除去する。 MNC層であるミドルクリア層の図1を収集し、PBS 1時01分でそれを希釈する。
- 遠心分離機24℃で10分間528×gで希薄MNCソリューション
- 上清およびジを削除5ミリリットルのPBSでペレットをリュート。
- 24℃で10分間、528×gでペレット溶液を遠心分離
- 上清を取り除きます。 RPMI中（〜200μL）の適切な量で、ペレットを希釈します。
- 5〜10μlのサンプルを取り、 自動細胞カウンターまたは血球計算板を用いて細胞を数える。その結果を記録します。 1より多くの時間をカウントし、細胞を繰り返して、平均セル数を計算する。
- のRPMIを使用してμlの1,000,000 cells/10に細胞濃度を希釈する。
3。細胞播種
- のRPMIを削除して、5分間の管腔内5μLのRPMIを追加することで、予備湿潤足場。
- 足場内腔へのステップ2.12からRPMI中で10μlの骨髄由来の単核細胞を加え、10分、細胞が足場に取り付けることができるようにするのを待ちます。
- 1cmの長さに19 G針をカットし、足場の形状を維持するために、足場の内腔に針を入れた。 24ウェルプレートに載せてください。</李>
- 各ウェルに千μLのRPMIを加え、インキュベーター中で、O / Nインキュベートする。
4。グラフト移植
- 手術前に、すべての手術器具をオートクレーブ：細かいハサミ、3Xマイクロ鉗子、2倍のマイクロ血管クランプ、鉗子を適用する1Xクランプ、1Xマイクロニードルホルダー、1X春のはさみ、1Xリトラクターを1X。
- 6〜8週齢の雌C57BL / 6は、組織工学的血管移植片のレシピエントとして使用されている。そのケージからマウスを削除し、ケタミン/キシラジンカクテルで腹部の右下の象限（ケタミン、100 mg / kgのキシラジンと、10 mg / kg）を腹腔内注射により麻酔して、それを比較検討する。ケトプロフェン（5 mg / kgを、IPは）事前に麻酔鎮痛剤として使用されます。
- 物語つまんで鎮静のレベルを確認し、腹部の毛をクリップ。無菌眼軟膏で目を潤滑し、パッド上の背側横臥位にマウスを置きます。ベタジンとアルコールパッドで腹部を消毒。 CO無菌ドレープでマウスをVERだけ切開領域を公開します。
- 恥骨領域への剣状突起下から正中開腹切開を行い、自己保持リトラクターを挿入します。生理食塩水湿らせたガーゼで腸を包む。ぶっきらぼう大動脈大動脈と大静脈を定義します。
- 近位大動脈と大静脈の遠位両側の2のマイクロ血管のクランプを配置し、ぶっきらぼうに大静脈トランセクト大静脈から大動脈を分離する。必要に応じて、テーパー針に10-0モノフィラメント縫合糸で腹部大動脈の枝を結紮。
- 無菌10-0縫合糸を使用して吻合を終了するために、近位端および遠位端と下大静脈の介在移植片を移植する。マウスの解剖学に依存し、移植片、出荷までmmで、トリム。近位端および遠位端の両方で1ステッチで移植性を確保し、移植片の反対側から4-5 stichesで連続縫合を開始します。前面を終えた後、クランプおよび移植片を反転反対側に、グラフトの裏側を縫合。注入中に、急性血栓症を予防するために頻繁にヘパリン溶液で移植片をフラッシュします。
- 近位クランプを外し、局所吸収性無菌止血剤を塗布して出血を制御します。出血が完全に停止すると、遠位クランプを取り外して、出血を同じように制御します。血液が移植片を流れていることを確認してください。
- 含まねじ切り針で6-0黒色ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用した2層に腹部の筋肉と皮膚を閉じます。
- 0.5ミリリットルの生理食塩水を皮下注射すると、マウスが完全にモバイルになるまで、温暖化パッド上で回復ケージにマウスを置きます。復旧時には、紙の寝具で新しいケージにマウスを返す。 48時間、鎮痛薬（イブプロフェン、30 mg / kgで、飲料水）を得た。
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Representative Results
TEVG注入の概略図を図1に示されている。骨髄は、ドナーマウスから採取し、単核細胞を密度遠心分離を用いて単離し、その後、生分解性足場上に播種する。シードされた足場は、O / Nインキュベートし、下大静脈の介在移植片としてレシピエントマウスに移植した。
図2は、PGA-P（CL / LA）骨格の走査型電子顕微鏡を示す。内径は約1mmであり、壁の厚さは約0.17ミリメートルであった。総気孔率は78.5％であり、孔の大きさは45.4±17.6であったわけで。
C57BL / 6マウスのIVCに介在しTEVGの総イメージは注入（A）と打ち込み、（B）の後の2週間後に、図3右に示します。 （C）は、比較したネイティブIVCのグロス画像を示している。それがあることは明らかである移植片は、新組織で充填されたが、それはまだ元の移植片の形状を保った。私たちの前の結果は、全グラフト劣化が12週10まで取ることが示された。
移植された移植片の開存性を示すためにTEVGの図4A-Bに注入された2週間の超音波Bモードとカラードプラ画像。ネイティブIVCイメージが比較（ 図4、C）が追加されました。細胞播種が大幅にグラフトの開存性を改善し、非シード播種、移植片のための2週でpatenciesはそれぞれ65％と91％、（P <0.05、フィッシャーの正確確率検定）である。
図5は 、移植の2週間後の細胞の浸潤やTEVGにおける細胞外マトリックスの沈着を示している。 H＆E染色で染色した外植された移植片は、足場材料（A）のグラフトと剰余を通じて新組織形成を示した。ハーツとマッソンの三重染色は中にエラスチンの沈着を示したtimal層（B）及び中間層（C）中のコラーゲン。内皮細胞のライニングが内膜層（D）全体にわたって観察され、それぞれ、CD31およびαSMA染色によって示されるように、コンフルエント平滑筋細胞は、特にライニングEC（E）以下、TEVGにわたって存在した。 F4/80染色（F）に示すように、注入後の第二週、マクロファージ浸潤は、明らかであった。
図1。TEVG注入の回路図。骨髄単核細胞は、ドナーマウスから採取し、生分解性足場に播種し、その後、レシピエントマウスへのIVC介在移植片として移植した。
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図2足場の走査型電子顕微鏡画像は 、 平均外径1.45 mmで、管腔の直径は1.1 mmで、長さは3mmであった。
図3。植え付けTEVG 2週間とネイティブIVC後。 A）移植直後、比較のために、B）2週間、移植後、C）がネイティブIVC。
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図4。超音波画像2週間とネイティブIVC。比較のために2週間。C）ネイティブIVC後TEVGのA）と BモードとB）のカラードプラ画像。
図5。2週間の代表的な画像は、手術TEVGを投稿してください。 A）H＆E（内腔）、B）ハーツ（ピンク=エラスチン）、C）Massionトリクロム（青=コラーゲン）、D）CD31（褐色=内皮細胞）、E）αSMA（ブラウン=平滑筋細胞）、およびF ）F4/80（ブラウン=マクロファージ）。
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Discussion
TEVGのマウスモデルは、新組織形成と狭窄の開発の細胞および分子メカニズムを研究するための貴重なツールです。シードされたBM-MNCが移植11に播種した細胞の組織学的およびSEM画像の両方で示された。細胞播種の効率はまた、DNAアッセイ7を用いて示された。このモデル系を用いて、我々は、細胞播種が私たち人間の臨床試験3の故障の主なモードだっTEVG狭窄の開発の発生率を減少させることを示した。播種した細胞は、急速に、彼らはパラクリン機構8,12を経由してその効果を発揮することが示唆され、TEVGから姿を消した。また、新血管形成が免疫媒介回生プロセスであり、新生血管は、足場の管腔表面に沿って隣接する血管壁から血管細胞（ECおよびSMC）の内方成長から生じることが示された。また、通常のマクロファージ浸潤は、血管新組織形成のために不可欠であるこのプロセスが過剰になると、それはTEVG狭窄7,8の開発につながる。これらの結果は、ヒト疾患に対するこのマウスモデルの妥当性を示している。顕微技術は、動脈の移植片13および静脈瘻の動脈を含む、他の血管の用途に適合させることができる。
我々は、毎年1,000 IVC溝形グラフト注入を操作して、死亡率は1％未満である。成功した移植片の移植のために、もちろん、いくつかの重要なポイントがあります。
それは、吻合中に数回の周りにマウスをオンにする必要があるため、まず、注射可能な麻酔は、この操作のために好ましい。麻酔の効果は通常、約1時間持続し、熟練したマイクロ外科医のための手術全体の時間は、手術を完了するのに十分な時間を提供し、約30〜45分です。動物が手術中に目を覚ます場合は、麻酔カクテル0.05〜0.1 mLを筋肉内に注射することができるcularly。
第二に、小さな動脈枝のほとんどはIVCと腹部大動脈から分離して過剰な血液の損失を防止するためにライゲートする必要があった。また、それは大動脈から分離されたときにIVCを傷つけないことに留意してください。
移植片は縫合した際に第三に、両側の最初の2本の縫合糸は、全体のプロセスの中で最も重要なステップである。それらは慎重に配置されていない場合には、IVCの表裏層を分離することは困難である。層が明確に特定されていない場合は、誤ってそれらを一緒に縫合する高い可能性がある。移植片にIVCを縫合しながら、それは上にティアリングが発生することがありますIVCを、ストレッチしないことが重要です。また、移植片の同じ長さを置き換えるためにあまりにも多くのIVCを遮断しないように注意してください。通常、IVCの約1〜2ミリメートルに起因IVCの長手方向の張力3〜5ミリ移植片を置換するために除去した。 IVCの同じ長さが除去される場合、それは吻合を行うMOSIS非常に厳しい。
第四に、TEVG形成と狭窄の開発に関しての変化を歪みに大きな負担があります。例えば、播種していないC57BL / 6マウス（野生型）をSCID / bgのマウス（免疫不全マウス）8,12よりもはるかに高い狭窄率を示した。加えて、我々の経験から、SCID / BGマウスは、その堅いIVC壁14にC57BL / 6マウスと比較して動作がはるかに容易になります。マウスの新しい株を操作するときに覚えておく。
移植片の製造、BM-MNCの収穫、および細胞播種プロセスが単純である、を認識できるように処理する唯一のいくつかあります。 18 Gの鈍針を使用してそれをプッシュしながら、まず、移植片の製造のために、そうではない「束」と感じ、非常に重要である。私たちはダウンピペットチップの先端部にフェルトをプッシュするさまざまな方法を試してみました。鈍針で移植を押すと群を抜いて、最高の結果を示した。インナー鈍針の直径は、フェルトを巻き付けている針の外径よりわずかに大きい。そのため、小さい針がぴったりと大きな鈍針にスライドでき、フェルト、その後、すべてのフェルトの集群を防ぐフェルト、の周囲に力を同量のプッシュダウンすることができます。我々は以前束ね移植片は2週間でより低い開存性を示したことを観察した。気泡が足場面と血の上の穴が移植後に穴から漏出する原因となりますので、また、それは、すべての気泡を除去することが重要です。第二に、骨が、彼らはあまりにも多くの筋肉や毛が含まれていませんので、可能な限りの骨をきれいにすることを確認し、BM-MNCの収穫のために離れている場合。必要であれば、それは密度遠心分離処理の前に、組織のストレーナーを使用することをお勧めします。
TEVGのこのモデルは、低圧および高流量システムで静脈循環、上うまくいった。しかし、動脈循環において、A高圧·大流量システムは、我々はその速い劣化特性に起因し、PGA移植と破裂率の高さを観察した。これは新組織は、動脈圧に耐える十分な強度を得る前に、移植片は、その構造的強度を失うことを意味する。当社は、ポリ乳酸（PLA）、以前にグラフトを使用しますが、動脈瘤形成の高い有病率を示したている。また、それは完全にマウスの寿命よりも大きいインビボで PLAを分解するために2年以上かかる。動脈循環グラフト製造技術における将来の応用のためには、例えば、エレクトロスピニングされた移植片は、現在開発中である。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、CKBのNIH（RO1 HL098228）からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 15 cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Littauer bone cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine prep pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol prep pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - fine forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish needle holder/forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For suturing the graft |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-woven sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1.5 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in, Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in, Needle | BD | 305106 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Warming pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
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