Abstract
甲状腺是一个bilobated内分泌腺定位在颈部的基部,产生甲状腺激素T3,T4,和降钙素。 T3和T4是由区别的甲状腺细胞,组织在封闭的球体称为卵泡产生的,而降钙素是由C-细胞,穿插在卵泡和密集的网络毛细血管之间的合成。虽然成人甲状腺结构和功能已被广泛地描述和研究,对“血管滤泡”单位,C-细胞在软组织的分布和上皮细胞和内皮细胞之间的旁分泌通信的形成远未了解。
这种方法描述了semiporous过滤器或显微镜塑料滑梯的连续步骤的小鼠胚胎甲状腺原基剥离和它的文化。在为期四天,这个文化系统忠实地概括体内甲状腺发展。事实上,(ⅰ)亿的脏器obation发生时(E12.5植),(ⅱ)前体甲状腺组织成毛囊和极化,(ⅲ)甲状腺细胞和C-细胞分化,以及(iv)中存在的显微组织增殖的内皮细胞,迁移到甲状腺叶,并紧密地与上皮细胞联系起来,因为他们在体内 。
甲状腺组织可以从野生型,基因敲除或荧光转基因胚胎获得。此外,外植体培养可以通过添加抑制剂被操纵,阻断抗体,生长因子,或什至细胞或条件培养基。 体外发育可以实时进行分析,或在培养的任何时间,通过免疫染色和RT-qPCR的。
总之,甲状腺外植体培养结合下游全贴或部分成像和基因表达分析提供了强大的系统,用于操纵和研究甲状腺邻形态发生和分化活动rganogenesis。
Introduction
甲状腺是独立的上皮领域的集合,称为卵泡,通过密集的网络毛细血管内皮细胞所包围。该组织允许甲状腺功能:毛细血管内皮提供甲状腺与碘,所需的T3和T4激素的合成,并分发这些后期到全身。散落在毛囊和毛细血管之间,C-细胞产生的低血钙激素降钙素1。虽然成人甲状腺结构和功能是众所周知的,参与甲状腺胚胎发育(卵泡形成和分化)的细胞和分子机制远未清楚。
在胚胎发育,甲状腺祖起源的前肠内胚层的腹壁在胚胎一天增厚(中线原基)(e)在小鼠胚胎8.5,而C-细胞祖细胞起源于E11.5为液滴状突起(在鳃博死亡的第四咽囊2-6)。中线芽然后从内胚层分离,扩大双边在E13.5融合与气管两侧的鳃组织。最后,甲状腺组织到毛囊和C-细胞分化。
甲状腺形成目前的知识主要来自固定的组织的组织学分析,但涉及甲状腺形成的形态发生的事件是高度动态的,并涉及不同的细胞类型之间以及与细胞外基质的通信和交互。最近的工作表明,甲状腺细胞祖细胞产生高水平的VEGF招募内皮细胞向显影甲状腺,并且,反过来,招募了内皮细胞的促滤泡形成和C-细胞分化7。
大多数体外研究对甲状腺孤立成人甲状腺来源的细胞已被执行,无论是种植在二维组织培养塑料ðishes或3D矩阵。使用这些类型的文化,差异化的滤泡细胞要么保持极化和组织为毛囊或重新获取三维组织8-10。然而,这些纯上皮细胞,由它们的生理环境中取出的,并且在二维培养,忽略与细胞外基质,细胞因子,生长因子和其它细胞类型,如内皮细胞或神经细胞,它们在体内 ,通常遇到的相互作用。一个很漂亮的研究最近描述了胚胎干细胞分化成的协议使用3D基质胶11的最终培养步骤甲状腺滤泡。然而,这些3D的文化缺乏与其他类型的细胞接触。
根据以往的专业知识对胰腺和唾液腺器官培养12-14,解剖小鼠胚胎甲状腺原基和培养上semiporous过滤器或显微镜塑料滑梯外植体的方法被开发了。
何时与E12.5胚胎工作时,甲状腺原基(中线原基和两个侧鳃体)的双重起源组织所施加的大片段的显微解剖。这包含在气管,但不是食道,并从咽弓的动脉到杓状肿胀延长。当培养于过滤器时,中线原基横向延伸的气管的每一侧,在那里它们与鳃体融合形成两个甲状腺瓣,通过一个狭窄的峡部仍然连接。
在文化方面,上皮细胞增生,组织成毛囊和分化为甲状腺细胞和C-细胞,这取决于它们的起源。包含在显微组织的内皮细胞也增殖和侵入甲状腺瓣到最后与上皮滤泡结构独立地血液流动或循环的因素,密切关联。为外植体的发展忠实地概括在体内发展换货,这种文化系统是最佳的学习形态和甲状腺发育过程中出现的分化事件。
甲状腺组织可以从野生型,基因敲除或荧光转基因胚胎获得,并且该培养系统是服从损耗和增益函数的实验。最后,在显微镜塑料菜荧光标记的甲状腺植时间推移成像可能被利用来更好地调查发生在体内的动力学和形态发生的动作的连续性。时间推移成像已被用于研究胰腺15,16或输尿管芽17的分支形态。
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Protocol
小鼠按照实验动物管理大学动物福利委员会的原则,提出和处理。所有的程序和协议已获本委员会。
1,显微塑料培养室的涂层
注意:执行以下所有在层流通风橱的无菌条件下的步骤。这两种类型的涂层在功能上是等价的。
- 外套塑料培养室与纤维连接蛋白的前一天甲状腺组织的隔离:
- 稀释无菌纤连蛋白在M199培养基50微克/毫升的最终浓度补充有100单位/毫升青霉素,100微克/毫升链霉素,0.25微克/毫升两性霉素B和2mM谷氨酰胺12。
- 盖井200微升稀释纤维连接蛋白,并在4℃冰箱孵育过夜。
- 在解剖当天,吸出纤连蛋白,与M1冲洗各孔一次99,并添加200微升M199的补充有抗生素,谷氨酰胺和10%胎牛血清的最低量。
- 留在孵化器的涂层室,直到准备板的外植体。
- 外套塑料培养室与I型胶原2小时的甲状腺组织中分离之前:
- 稀释无菌I型胶原蛋白,以在10mM盐酸50μg/ ml的终浓度。注:置于冰上胶原蛋白原液。
- 覆盖所述井用200微升稀释的I型胶原并孵育2小时,在室温(RT)。
- 吸出I型胶原溶液的类型,漂洗各孔一次,M199,并添加200微升M199的补充有抗生素,谷氨酰胺和10%胎牛血清的最低量。
- 留在孵化器的涂层室,直到准备板的外植体。
甲状腺含Anlagen的组织2。解剖(E12.5)或甲状腺叶(E13.5-E14.5)
注:使用干净的解剖工具和Petri /培养板。下面描述的一般步骤和切口都是相同的E12.5和E14.5胚胎。
- 牺牲定时怀孕的雌性小鼠在所需的胚胎(五)天(从E12.5到E14.5),并使用解剖仪器切除子宫。
- 将切开子宫在含有HBSS 10cm的板。
- 握住钳子子宫的一个末端,并用小剪刀逐步释放所有打开的胚胎在子宫。
- 从用剪刀胎盘中分离胚胎和转移他们的胚外膜的胚胎在含有HBSS一个新的10cm平板。
- 删除卵黄囊和羊膜。注:从这一点来说,用下从下方透体视显微镜工作;增加放大倍数与解剖步骤。使用钨针在玻璃毛细管作为解剖工具。
- 使用诸如针刀叉,去除头的上半部分,包括上颚和耳朵( 图1A,沿切)。
- 按住胚胎在它的后面,并先删除一个额外的一块神经管( 图1A,沿乙切),胚胎,然后下部,刚下过前四肢和心脏上方( 图1B)。
- 含有转舌(以定向组织)和颈部区域中包含的HBSS一个新的10cm平板胚胎切片。
- 除去神经管和组织后方的食道/气管( 图1C,沿着切割)。
- 轻轻部组织切片沿舌( 图1C,沿着B和B'切割)的两侧。
- 找到食道和气管,在舌头的延长,并剖析了舌头,留下杓状肿胀( 图1D,沿切),并在BOT组织食道/气管( 图1D,沿着B和B'切割)h的侧面。
- 取出食管,并放置气管,其腹面朝上。
- 解剖掉不想要的组织如胸腺( 图1E)和所有位于横向于咽弓的动脉组织。为E13.5或E14.5胚胎,可视化的甲状腺瓣上气管的每一侧( 图1F;红色虚线)和从气管进一步解剖瓣。
- 所述分离E12.5气管区,或E13.5-E14.5甲状腺瓣转移到含有补充了抗生素,谷氨酰胺和10%胎牛血清的预热的M199培养基在35 mm培养皿。使用预湿过滤嘴在P-200微量转移外植体。对于E12.5植,切尖的末端,以扩大开放。注:按常规,如果胚胎有相同的基因型,表现在所有的胚胎步骤6和7,Ñ9-11,最后12&13。
3,电镀甲状腺外植体与文化
- 通过连续转印在三个孔24孔板中含有1ml预热的培养基中洗涤外植体(= M199补充有抗生素,谷氨酰胺和10%胎牛血清)。
- 镀上涂层的显微塑料培养室甲状腺叶:
- 从涂覆室抽吸M199培养基中。
- 小心,转移甲状腺植成使用微量,过滤嘴棒的培养室。放置1外植体中的每个腔室的中心。
- 除去多余的培养基,并将培养容器在组织培养箱(37℃,5%CO 2)2小时,让外植体附着于基质。
- 轻轻地添加200至300μl的预热的培养基到每个孔中。
- 在组织培养培养箱中孵育长期培养。
- Ø电镀上semiporous滤波器F1气管地区或甲状腺叶:
- 填充330微升预热的培养基中所需要的24孔板的孔的数量。
- 过滤器的地方( 例如 0.4微米的微孔过滤器)的介质上,同时注意避免下面的文化过滤器气泡俘获。
- 小心,使用微量过滤和技巧,转移甲状腺外植体用介质的最小体积到过滤器的中心(最大4/filter)。
- 去除多余的介质和空间用钨针外植体。
- 在组织培养培养箱中孵育长期培养。注:更改文化层流罩下,隔日媒体。培养的外植体长达7天。
4,全安装免疫荧光染色甲状腺植协议
使用钨针或打跑生长在过滤器外植体(下面的步骤2后)细镊子和转让在24孔板中的所有步骤,除了初级(步骤5)和二级(第7步)抗体孵育(96孔板)。有关显微镜的塑料腔贴壁培养的外植体,进行在培养室中的所有步骤。
- 吸出物的M199培养基中,并固定用冰冷的4%多聚甲醛(PFA),20分钟(500微升在24孔培养皿和300微升在显微镜载玻片)的外植体。
- 在RT;在Tris缓冲盐水用Triton洗2×10分钟(50毫摩尔Tris盐酸pH为7.5,150 mM氯化钠,0.1%的Triton X-100的TBST)。
- 立即处理的外植体或储存在-20°C。注意:对于长期储存于-20℃,通过逐渐增加甲醇浓度在TBST达到100%甲醇脱水甲醇外植体。当准备继续与免疫染色(步骤4),通过逐渐加入TBST甲醇补充水分外植体。
- 用封闭溶液(10%正常山羊血清在TBST中替换TBST)和孵化在海摇臂锯在室温30-60分钟。
- 稀释第一抗体在阻断溶液(每个条件100-200微升)。从24孔板转移的“过滤器”外植体在96孔板中。培养外植体与在4℃下在海锯摇臂的第一抗体过夜
- 第二天,弃去第一抗体溶液,转移的“过滤器”植回在24孔板中,并用TBST上的海锯摇臂每个在室温45-60分钟冲洗至少5次。
- 在含有正常山羊血清的1%的TBST稀释的第二抗体( 例如山羊抗-X-的Alexa Fluor在1:2,000稀释)孵育的外植体与该稀释过夜上的海锯摇臂在4℃和在黑暗中。核复染,包括1微克/毫升双苯甲亚胺(Hoechst公司)与二级抗体溶液一起。
- 第二天,弃去二级抗体溶液并用TBST上的海锯洗5倍摇杆,每个在室温45-60分钟。在清洗,保持在黑暗的外植体。
- 执行在TBST轻轻摇动过夜,4°C黑暗额外洗。
- 后缀在4%PFA的免疫染色的外植体在4℃下10分钟。
- 用TBST洗涤2×10分钟。
- 转移外植体或逐渐在甲醇100%长期储存于-20℃,或立即分析。为外植体上的过滤器中培养,并进行免疫染色在24孔板中,转印在显微镜室( 例如 LabTek或Ibidi)用TBST或更好的荧光封固剂在分析前用多光子或共聚焦显微镜。
5,提取RNA的甲状腺
在无RNA酶的环境中工作。因此,使用核酸和核酸免费移液器吸头和污染物和RNA酶清洁两个板凳和设备。该协议是基于酚/氯仿,执行的第一步s(1至7)根据化学罩。
- 均质1甲状腺植或两个甲状腺叶用300微升的RNA提取液用一次性杵1.5 ml管。在样品之间,洗杵在2%SDS,然后在水,然后乙醇。
- 继续添加100μl的RNA提取溶液中,涡旋10秒并在室温下孵育10分钟。
- 涡旋30秒,加入20毫微克的tRNA到各样品中。
- 涡旋混合1分钟,并加入80μl的氯仿中。
- 涡流大力进行30秒,并培育15分钟,在室温。
- 旋转15分钟,以19,000×g离心在冷藏(4℃)离心分离。
- 小心转移含20微克的糖原作为一个共沉淀新的管无色的上层水相。
- 涡流并添加200微升的100%异丙醇酒精。
- 涡大力为15-30秒,并让RNA沉淀在-20℃下2-3小时,或在-80℃下1小时。
- 旋转30分钟19,000XG在4℃下,并消除上清液。
- 用450微升冷75%乙醇和涡流洗涤沉淀以去除沉淀。
- 自旋为19,000 XG在4℃下10分钟,并消除上清液。
- 干燥机罩5分钟下沉淀。
- 重悬沉淀用10微升不含RNA酶的水中,并培育10分钟,在RT。
- 检测RNA浓度,在-80℃下储存或反向转录基因表达分析。
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Representative Results
甲状腺原基(中线和UB连同周围组织)和甲状腺瓣从小鼠胚胎在E12.5和e13.5/e14.5分别( 图1)解剖。一天培养上过滤后,中线原基是可见的( 图2A),为一细长的组织生成树上的气管的上方。它逐渐形成于气管的每一侧两个波瓣。如果孤立甲状腺裂片(E13.5或E14.5)进行培养时,它们会扩展,经受形态发生和上皮细胞将组织成肉眼可见滤泡结构( 图2B)。
组织和极化上皮细胞中,标记的E-钙粘蛋白,可以通过埃兹蛋白免疫标记( 图3A)被可视化。埃兹蛋白阳性的细胞内结构逐步,并以一致的方式,保险丝与将成为根尖极电池的一极。在此过程中,内皮细胞POSI因而对于粘附分子增殖和周围组织的发育卵泡形成血管毛囊单位( 图3B)。量化甲状腺细胞和C-细胞的分化,RNA可以从培养的甲状腺叶中分离出来,并通过RT-qPCR的( 图3C)测定基因的表达。而甲状腺转录因子NKX2.1的表达没有在培养过程中改变,C-细胞特异性降钙素的甲状腺细胞特异性和甲状腺球蛋白的表达显着增加,这表明功能分化。
图1。解剖步骤,从E14.5小鼠胚胎分离出的甲状腺。切口用黄色虚线描绘。 (A)该头的上半部分是由两个切口移除以暴露舌。 ( 二)制造业ķ区域是从身体的其余部分由切片下方的上肢和高于心脏的胚胎分离。 ( 三)保持舌(至)为指导,取出神经管(NT)和横向的组织和四肢。 (D)该舌,杓状肿胀(*)和食道/气管完全对齐。首先拆下舌头,然后组织横向到食道/气管地区。 ( 五)甲状腺叶部分是由胸腺(THYM),它应该被丢弃隐藏。 (F)甲状腺叶可见于气管(红色虚线煤球)的每一侧,或用荧光报道胚胎更好可视化(PAX8-Cre重组酶;罗莎停止-YFP;插图)。缩写:至(舌头),THYM(胸腺),TRA(气管),*(杓状软骨肿胀) 请点击此处查看这个数字的放大版本。
对纤连蛋白的滤波器和甲状腺瓣图2。解剖甲状腺植很好地开发体外 (A)的照片的E12.5甲状腺外植体培养的对semiporous滤波器1,2和3天,在空气-介质界面。甲状腺上皮细胞迁移双侧上气管的每一侧,并形成两个生长甲状腺瓣。 ( 二)第1天在显微镜塑料培养室培养的E14.5甲状腺叶的2天明场图像。请注意,最终形成约7天大(20-100微米)的毛囊。黄色虚线描绘的甲状腺上皮周上皮的扩张和重塑。比例尺,100微米。 请CLI完蛋此处查看这个数字的放大版本。
图3。卵泡发育,血管发生和甲状腺中培养分化甲状腺叶中培养指定的时间。 ( 一 )固定组织进行整个安装免疫染色与抗基底外侧笔E-钙粘蛋白和根尖膜标记Ezrin蛋白。一天培养后,对应于细胞内囊泡7甲状腺实质存在小埃兹蛋白阳性结构的上皮细胞。来自相邻小区的囊泡融合一致就会形成小管开口于第2天;经过4天的进行性生长围绕有管腔的周围的细胞和组织会划定前卵泡的结构。比例尺,20微米。 (B)甲状腺升OBE免疫染色与抗血小板和内皮细胞粘附分子(PECAM)和Ezrin蛋白。卵泡是由内皮细胞结构所包围。比例尺,50微米。 (C)的RNA,从甲状腺叶中提取,定量PCR前反转录。甲状腺转录因子NKX2.1的两个分化的基因,甲状腺球蛋白,降钙素的表达,并且,使用特异性引物对进行测定。计算相对基因表达时,ΔΔ的Ct法,用的是E-钙粘蛋白作为参考基因和文化的最后时间点为100%。在A和 B显示的图像是整个安装免疫染色甲状腺叶单共焦光学部分。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本文介绍了解剖,并以研究,更好地了解复杂的事件,导致甲状腺生成甲状腺培养外植体(E12.5)或叶(E14.5)的方法。由于甲状腺原基(中线原基和两个侧鳃体),和它们的小尺寸,E12.5组织局部喙向咽弓的动脉的片段,以及含有该气管,但不是食道的双重原点是显微切割。如图所示,为期四天之内,这种文化系统忠实地概括体内甲状腺的发展,因为:(i)本中线原基迁移双边和膨胀形成,与UB,两名甲状腺叶由一条狭窄的地峡相连( 图2A) ,(ⅱ)甲状腺前体从一团细胞的重组进入毛囊和最终分化( 图2B和图3A),存在于所述(ⅲ)的内皮细胞显微组织增殖,迁移到甲状腺叶,并密切与上皮细胞( 图3B)相关联,以及(iv)甲状腺细胞和C-细胞分化定性( 图3C),因为他们在体内 7。作为夹层物理中断宫内发育和移植组织具有适应培养条件下,形态和分化事件被稍微延迟相比, 在体内的情况。
本协议中的关键步骤
该方法的关键方面是在夹层中。首先,它是必不可少的,除去外侧的组织,以及右侧和从E12.5植胸腺左叶,作为其扩张培养阻碍甲状腺瓣适当发展。其次,快速性也是至关重要的,如果一个人想维持内皮细胞存活。如果没有一个无菌环境下进行清扫,必须在无菌培养基中洗几次外植体是很重要的。最后,培养于semiporous过滤器外植体时,它使用一个小体积的培养基中,并以将外植体在过滤器的中心是重要的。太多的介质将流入过滤器的周边,并建立与该过滤器壁的弯液面。在这种情况下,外植体将遵循介质而到达弯液面;它的发展将是在中,而不是在空气/介质接口。
可能的修改和限制
这里描述的协议适用于E12.5甲状腺外植体和E13.5和E14.5分离甲状腺叶。年轻和年长的发育阶段可以在解决科学问题的功能进行测试。其他的培养条件也可进行测试:甲状腺外植体或瓣可以在三维matrig生长埃尔,或介质可辅之以胰岛素/转铁蛋白/硒而不是含10%血清。
组织培养物的一个重要方面是氧气浓度。当生长在显微镜塑料滑梯,氧气浓度是很难体会到,因为它会具有中等以上的外植体的高度降低。当生长在过滤器,在空气/介质界面,外植体是在与大气接触,因此与氧的21%。在后一种情况下,人们可以尝试使用培养箱内低氧分压pO 2浓度重现子宫内环境中的“缺氧”。
如果tissular的E12.5外植体的复杂性是正确发展的优点,这也是一个主要缺点为上皮细胞是不可访问的病毒或转染试剂。操作可以与扩散性的试剂(酶抑制剂,阻断抗体,生长因子,细胞因子,条件培养基)中进行,保持ING记住,外源性化合物,会影响所有类型的细胞。此外,组织的复杂性和叶的小尺寸相对于整个组织块( 见图2A,右图),减少准备的提取物(RNA或蛋白质)的纯度。
虽然大多数在本文所提出的数据从4-5天培养的外植体获得,它可以保持在培养的器官更长的时间,在塑料长达10天,与毛囊的不断发展( 见图2B在第7天)。如果需要更长的文化,必须执行,应验证所有类型的细胞,包括内皮细胞,外植体生存。
该技术相对于现有的方法或其他可供选择的方法的意义
相比于2D的菜肴或3D矩阵的计算方法甲状腺纯人口文化秒,此器官培养系统呈现维持显微切割片段的天然和生理组合物的优点。的确,除了甲状腺细胞和C-细胞前体细胞,外植体含有间充质细胞和内皮细胞以及细胞外基质。如已经展示了与唾液腺,肾,肺或胰,器官培养物很好地模拟体内发展。此外,它提供了一种快速分析和处理(收益或丧失功能的)野生型和敲除的器官。
掌握这一技术后,未来的应用或方向
本文表明,甲状腺发育的细胞和分子方面可以用显微镜或通过RT-qPCR的分析; 原位杂交或Western印迹也可以被执行。该培养系统是适合于获得和丧失功能的通过加入特异性抑制剂实验秒,阻断抗体,生长因子,细胞因子,或什至细胞在培养液中7。然而,所有的存在于组织中的细胞类型都受影响。这将是有趣的,开发基于病毒的细胞类型特异性靶向。
使用荧光报道菌株,用荧光解剖显微镜,便于组织片( 图1F,插图)的显微切割,而且,作为使用的膜标记的荧光蛋白16报告由他人,允许进行实时成像3D 15,16,或跟随一个特定的细胞群体在文化发展中器官。新的荧光报告株发展将有必要仔细可视化形态发生的事件。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
Hoechst | Sigma | B2261 |
References
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