Abstract
갑상선은 갑상선 호르몬 T3, T4, 그리고 칼시토닌을 생산, 목의 기지에서 지역화 bilobated 내분비 선입니다. 칼시토닌은 모공과 모세 혈관의 밀도가 네트워크 사이에 산재 C-세포에 의해 합성되는 동안 T3와 T4는 여포라는 폐쇄 된 분야로 구성 차별화 thyrocytes에 의해 생성된다. 성인 갑상선 아키텍처 및 기능은 광범위하게 기술되고 연구되어 왔지만, "angio-모낭"단위, 실질에서 C-세포의 분포 및 상피와 내피 세포 사이의 주변 분비 통신의 형성은 작게 이해되는 것이다.
이 방법은 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN 해부와 문화의 순차적 단계를 설명합니다. 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 생체 충실히 갑상선 발달 되풀이되었습니다. 사실, (I) 억원기관의 obation는 (E12.5 외식을 위해)가 발생, (II) 전구체는 여포로 구성하고 극화 (III) thyrocytes와 C-세포가 분화하고, (ⅳ) microdissected 조직의 증식에 존재하는 내피 세포가로 마이그레이션 thyrocytes 그들은 생체 내에서와 마찬가지로 밀접하게 갑상선 엽 (叶), 그리고, 상피 세포와 연결합니다.
갑상선 조직은 야생형, 녹아웃 또는 형광 유전자 변형 배아에서 얻을 수 있습니다. 또한, 면역 염색 및 RT-qPCR에 의해 생체 외 개발이 실시간으로 분석 할 수있다. 문화 항체, 성장 인자, 또는 세포 또는 배양 상청을 차단 억제제의 첨가에 의해 조작 될 수 이식편 또는 배양 언제든지.
하류 전체 마운트 또는 섹션 이미징 및 유전자 발현 프로파일 링 갑상선 O의 형태 형성과 분화 사건을 조작하고 공부를위한 강력한 시스템을 제공에 결합 된 결론, 갑상선 이식편 문화rganogenesis.
Introduction
갑상선 내피 모세 혈관의 밀도가 네트워크에 둘러싸여 여포라는 독립적 인 상피 분야의 모음입니다. 이 조직은 갑상선 기능 수 : 내피 모세관은 T3와 T4 호르몬 합성에 필요한 요오드와 thyrocytes를 제공하고, 몸 전체에 후자를 배포 할 수 있습니다. 모공과 모세 혈관 사이에 흩어져, C-세포는 1 칼시토닌 hypocalcemic 호르몬을 생산하고 있습니다. 성인 갑상선의 구조와 기능이 잘 알려져 있지만, 갑상선 배아 발달 (뿌리의 형성과 분화)에 관련된 세포 및 분자 메커니즘은 지금까지 이해되지 있습니다.
배 발생시, (C-세포의 전구 세포는 물방울 모양의 돌기로 E11.5에서 시작하는 동안 조상이 배아 일에 foregut의 내배엽의 복부 벽의 비후 (중간 선 anlage) (E) 마우스 배아에서 8.5으로 유래 thyrocytes ultimobranchial 보네 번째 인두 낭 2-6) 죽는다. 중간 선 봉오리는, 내배엽에서 분리 기관의 각 측면에 ultimobranchial기구와 E13.5에서 융합 양측으로 확장됩니다. 마지막으로, thyrocytes는 여포로 구성하고 C-세포는 분화.
갑상선 형성에 대한 현재의 지식은 주로 고정 된 조직의 조직 학적 분석을 제공하지만 갑상선 형성에 관여 형태 발생 이벤트는 매우 동적이며 다른 종류의 세포 사이의 세포 외 기질 (extracellular matrix)과의 통신 및 상호 작용을 포함한다. 최근 작품은 thyrocyte 전구 세포가 개발 갑상선에 내피 세포를 보충하는 VEGF의 높은 수준을 생산하고, 차례 차례로, 내피 세포가 모낭의 형성을 촉진하고 C-세포의 분화 7 모집 것으로 나타났다.
갑상선에있는 대부분의 생체 연구는 어느 차원 조직 배양 플라스틱 D에게 성장, 고립 된 성인의 갑상선 유래 세포에 수행 된ishes 또는 3D 행렬에. 문화의 이러한 유형의 차별화 된 모낭 세포 편광 유지하고 여포로 구성하거나 3D 조직 8-10을 다시 가져 오기를 사용하여. 그러나, 그들의 생리적 환경에서 외식 및 2D에서 배양 이러한 순수 상피 세포는, 세포 외 기질, 시토 킨, 성장 인자와 함께 그들이 일반적으로 생체 내에서 발생할 같은 내피 또는 신경 세포와 같은 다른 세포 유형의 상호 작용을 무시한다. 아주 좋은 연구는 최근 3 차원 매트 리겔 (11)에서 최종 배양 단계를 사용하여 갑상선 여포에 ES 세포의 분화 프로토콜을 설명했다. 그러나, 이러한 3 차원 배양은 다른 세포 유형과의 접촉이 부족하다.
췌장과 타액에 대한 이전의 전문 지식을 바탕으로 기관 배양 12-14, 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN을 해부하고 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 외식을 배양하는 방법을 동맥이 개발되었다.
언제E12.5 배아 작업, 갑상선 ANLAGEN (중간 선 anlage 두 측면 ultimobranchial 기관)의 이중 기원은 조직의 큰 조각의 미세 절제를 부과했다. 이것은 기관 아니지만 식도를 포함하고, 조각으로 부서져 종기까지 인두 아치 동맥으로부터 연장. 필터상에서 배양하면 그들은 여전히 좁은 지협에 의해 접속이 갑상선 돌출부를 형성하도록 ultimobranchial 체와 융합 여기서 정중선 anlage은 기관의 각 측면에 횡 방향으로 연장된다.
문화, 상피 세포 증식, 모낭에 정리하고 자신의 기원에 따라 thyrocytes와 C-세포로 분화. microdissected 조직에 포함 된 내피 세포는 증식하고 마지막으로 독립적으로 혈액의 흐름 또는 순환 요인의 상피 모낭 구조와 밀접하게 연관 갑상선 엽 (叶)에 침입. 외식의 개발은 충실하게 개발 생체 내에서 되풀이되었습니다으로, 표준이 문화 시스템은 형태 발생과 갑상선 개발 과정에서 발생하는 차별 사건을 연구하기에 최적입니다.
갑상선 조직은 야생형 녹아웃 또는 형광 형질 전환 배아로부터 수득 될 수 있고, 배양 시스템은 손실 및 기능 획득 실험 의무이다. 마지막으로, 현미경 플라스틱 접시에 형광 표지 갑상선 외식의 시간 경과 영상은 더 나은 생체 내에서 발생하는 반응 속도와 형태 형성 운동의 연속성을 조사하기 위해 악용 될 수 있습니다. 시간 경과 영상은 이미 췌장 15, 16 또는 ureteric 버드 (17)의 분기 형태 형성을 연구하는 데 사용되었습니다.
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Protocol
마우스는 대학 동물 복지위원회의 실험실 동물 관리의 원칙에 따라 제기 및 처리 하였다. 모든 절차 및 프로토콜은이위원회에 의해 승인되었다.
1. 현미경 플라스틱 문화 챔버의 코팅
참고 : 층류 후드에서 무균 조건 하에서 다음의 모든 단계를 수행합니다. 코팅의 두 종류가 기능적으로 동일하다.
- 피브로넥틴 전에 갑상선 조직을 분리 한 하루 코트 플라스틱 문화 실 :
- 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.25 ㎍ / ㎖의의 fungizone 2 MM의 글루타민 (12)와 보충 M199 배지에서 50 ㎍ / ml의 최종 농도로 멸균 피브로넥틴을 희석.
- 희석 피브로넥틴의 200 μL와 우물을 덮고 4 ° C의 냉장고에 하룻밤 배양한다.
- 해부의 날, M1에 한 번 우물을 씻어, 피브로넥틴을 대기음99 및 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 M199 200 μL의 최소 부피를 추가한다.
- 외식을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 코팅 된 실을 남겨주세요.
- 유형 코트 플라스틱 문화 챔버 나는 갑상선 조직을 분리하기 전에 2 시간 콜라겐 :
- 나는 10 mM의 염산에 50 ㎍ / ㎖의 최종 농도 콜라겐 멸균 유형을 희석. 참고 : 얼음 콜라겐 원액을 유지합니다.
- I 콜라겐 희석 타입의 200 μL와 우물을 덮고 실온 (RT)에서 2 시간 동안 배양한다.
- 내가 솔루션을 콜라겐 유형을 대기음, M199 한 번 우물을 씻어 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청으로 보충 M199 200 μL의 최소 볼륨을 추가합니다.
- 외식을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 코팅 된 실을 남겨주세요.
갑상선 ANLAGEN 함유 조직의 2. 해부 (E12.5) 또는 갑상선 엽 (E13.5-E14.5)
참고 : 깨끗한 해부 도구와 페트리 / 문화 판을 사용합니다. 아래에서 설명하는 일반적인 단계와 절개 E12.5 및 E14.5 배아에 대해 동일합니다.
- 원하는 배아 (E12.5에서 E14.5에) (E) 일에 시간 초과 - 임신 여성 생쥐를 희생과 해부 도구를 사용하여 자궁을 제거합니다.
- HBSS를 포함하는 10cm 접시에 해부 자궁을 놓습니다.
- 집게로 자궁의 한 끝단을 잡고 점진적으로 모든 배아를 해방하는 작은 가위로 자궁을 엽니 다.
- 가위로 태반에서 배아를 분리하고 HBSS를 포함하는 새로운 10cm 접시에 자신의 배외 (extraembryonic) 멤브레인 배아를 전송합니다.
- 난황과 양막을 제거합니다. 참고 :이 시점에서, 아래에서 transillumination와 실체 현미경을 작동; 해부 단계 배율을 증가시킨다. 도구를 해부로 유리 모세관에있는 텅스텐 바늘을 사용합니다.
- 같은 바늘을 사용나이프와 포크는, 위 턱과 귀 (따라 절단 그림 1A)를 포함하여, 머리의 윗부분을 제거합니다.
- 그 뒷면에있는 배아를 잡고 먼저 신경 튜브의 추가 조각 (B 따라 절단 그림 1A), 배 (胚)의 후 하부, 단지 전방 사지에서와 마음 (그림 1B) 이상을 제거합니다.
- HBSS를 포함하는 새로운 10cm 접시에 혀 (조직의 방향을)과 목 영역을 포함하는 배아 슬라이스를 전송합니다.
- 신경 튜브를 제거하고 조직 (따라 절단 그림 1C) 식도 / 기관에 후부.
- 부드럽게 섹션 (B와 B '를 따라 잘라 그림 1C) 혀의 양측을 따라 조직 슬라이스.
- 혀의 연장에서, 식도와 기관을 찾아 (그림 1D, 따라 절단), 그리고 로봇의 조직을 팽창 조각으로 부서져을 떠나, 혀를 멀리 해부(B와 B '를 따라 잘라 그림 1D) 식도 / 기관 h의 측면.
- 식도를 제거하고, 그 복부면이 위로 향하게하여 기관을 배치합니다.
- 이러한 흉선 (그림 1E)와 인두 아치 동맥 옆으로있는 모든 조직과 원치 않는 조직을 멀리 해부하다. (그림 1 층, 빨간 점선) E13.5 또는 E14.5 배아의 경우, 기관의 양쪽에 갑상선 엽 (叶)을 시각화하고 또한 기관에서 엽 (叶)을 해부하다.
- 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 예열 된 M199 배지를 함유하는 35mm 배양 접시에 절연 E12.5 기관지 영역 또는 E13.5-E14.5 갑상선 엽 전송. P-200 마이크로 피펫에 prewetted 필터 팁을 사용하여 외식을 전송합니다. E12.5 외식의 경우, 개방을 확대하는 팁의 사지를 잘라. 참고 : 배아가 동일한 유전자형이있는 경우 정기적으로하고, 모든 배아 단계 6 및 7을 수행,N 9-11, 그리고 마지막으로 12 & 13.
갑상선 외식 3. 도금 및 문화
- 예열 된 배지 1 ㎖를 함유하는 24 - 웰 플레이트의 웰에 세 연속 전송으로 이식편을 워시 (= M199 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된).
- 코팅 현미경 플라스틱 문화 실에 갑상선 엽 (叶)의 도금 :
- 코팅 챔버에서 대기음 M199 배지.
- 조심스럽게, 마이크로 피펫 및 필터 팁을 사용하여 배양 챔버로 갑상선 외식을 전송합니다. 각 실의 중앙에 하나의 이식편을 놓습니다.
- 초과 매체를 제거하고 조직 문화 인큐베이터에서 배양 챔버를 배치 (37 °의 C, 5 % CO 2) 2 시간 동안 외식 행렬에 부착 할 수 있습니다.
- 부드럽게 잘 각각 예열 문화 매체의 200-300 μl를 추가합니다.
- 조직 문화 인큐베이터에서 장기 문화를 품다.
- 도금 Osemiporous 필터에 대한 F의 기관 영역 또는 갑상선 엽 (叶) :
- 예열 된 배지 330 μL에 필요한 24 - 웰 플레이트의 우물의 수를 입력합니다.
- 문화 필터 아래 기포의 포획을 방지하기 위해주의하면서 중간에 자리 필터 (예를 들어, 0.4 μm의 밀리 포아 필터).
- 조심스럽게, 마이크로 피펫 및 필터 팁을 사용하면, 필터의 중심 (최대 4/filter)에 매체의 최소한의 볼륨 갑상선 외식을 전송합니다.
- 텅스텐 바늘로 외식 밖으로 매체와 공간의 초과를 제거합니다.
- 조직 문화 인큐베이터에서 장기 문화를 품다. 참고 : 층류 후드에서 변경 배지 매일. 7 일까지 문화 외식.
갑상선의 Explants 4. 전체 마운트 면역 형광 염색법 프로토콜
텅스텐 바늘을 사용하거나 (아래 2 단계 이후) 필터에 성장 외식을 제거미세 집게와 차 (5 단계), 제 2 (7 단계) 항체 배양 (96 - 웰 플레이트)을 제외한 모든 단계를위한 24 - 웰 플레이트에 전송. 현미경 플라스틱 실에서 배양 부착 외식의 경우, 문화 챔버의 모든 단계를 수행합니다.
- 기음 M199 배지와 20 분 (24 - 잘 접시에 500 μL와 현미경 슬라이드에 300 μL)를위한 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 이식편을 고정합니다.
- 트리톤과 트리스 완충 생리 식염수로 2 배 10 분 세척 (TBST, 50 mM 트리스 염산의 pH 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트리톤 X-100)를 RT에서.
- -20 ℃에서 바로 외식 또는 저장 처리 주 : -20 ° C에서의 장기 저장을 위해, 서서히 100 % 메탄올에 도달하는 TBST에 메탄올 농도를 증가시킴으로써 메탄올 이식편 탈수. 준비가 면역 염색 (4 단계)를 계속하면 점차 메탄올 TBST를 추가하여 외식을 재수.
- 차단 용액 (10 % TBST 정상 염소 혈청 TBST를 교체)와 실온에서 30 ~ 60 분 동안 바다를 보았다 로커에 품어.
- (조건 당 100 ~ 200 μL)를 차단 솔루션 1 차 항체를 희석. 96 - 웰 플레이트에 24 - 웰 플레이트에서 "필터"외식을 전송합니다. 4 ℃에서 하룻밤 바다 톱 로커의 기본 항체 절편을 품어
- 다음 날, 차 항체 솔루션을 버리고 다시 24 웰 플레이트의 "필터"외식을 전송하고, 45 ~ 60 분 실온에서 각각 바다 톱 로커에 TBST로 5 배 이상 씻는다.
- 정상 염소 혈청의 1 %가 포함 된 TBST에서 이차 항체 (1:2,000 희석 예를 들어, 염소 항 - X-알렉사 플 루어)를 희석하고 4 ° C에서와 어둠 속에서 바다를 보았다 로커에 하룻밤이 희석 외식을 배양한다. 핵 counterstaining를 들어, 함께 차 항체 솔루션 비스 - Benzimide (헥스) 1 ㎍ / ㎖의 (가) 있습니다.
- 다음 날, 차 항체 솔루션을 버리고 바다 톱에 TBST로 배를 씻어45 ~ 60 분 실온에서 각각 로커. 세척하는 동안 어둠 속에서 외식을 유지합니다.
- TBST 부드럽게 어둠 속에서 4 ° C에서 하룻밤 소용돌이에 추가 세척을 수행합니다.
- 후위 10 분 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 면역 염색 외식.
- TBST로 2 배 10 분 씻으십시오.
- -20 ° C에서 장기 저장을 위해 하나 점차 메탄올 100 %를 외식을 전송하거나 즉시 분석 할 수 있습니다. 필터에서 배양, 24 웰 플레이트에 면역 염색, 이전에 다 나 공 초점 현미경 분석 TBST 이상 형광등 설치 매체와 현미경 실 (예 : LabTek 또는 Ibidi)에 전송 외식하십시오.
갑상선에서 RNA의 5. 추출
RNase가없는 환경에서 작업 할 수 있습니다. 따라서, 핵산과 핵산 분해 효소 무료 피펫 팁을 사용하여 오염 물질과 RNases에서 벤치 및 장비를 모두 청소합니다. 페놀 / 클로로포름를 기반으로하기 때문에이 프로토콜은, 첫 번째 단계를 수행의 화학 후드 (1 ~ 7).
- 1.5 ML 튜브에 일회용 유를 사용하여 RNA 추출 용액 300 μL로 한 갑상선 이식편 또는 두 개의 갑상선 엽 (叶)을 균질화. 의 샘플 사이에, 에탄올 다음, 물 다음, 2 % SDS에서 유를 세척한다.
- RNA 추출 솔루션의 또 다른 100 μL, 소용돌이 10 초를 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- 30 초 동안 소용돌이와 각 샘플의 tRNA의 20 NG를 추가합니다.
- 1 분 동안 소용돌이와 클로로포름의 80 μl를 추가합니다.
- 소용돌이가 격렬하게 30 초 및 RT에서 15 분 알을 품다.
- 냉장 (4 ℃) 원심 분리기에서 19,000 XG에 15 분 동안 스핀.
- coprecipitant으로 글리코겐의 20 μg을 함유하는 신선한 튜브에 조심스럽게 무색 위 수성 단계를 전송합니다.
- 소용돌이와 100 % 이소프로판올 알코올의 200 μl를 추가합니다.
- 15 ~ 30 초 동안 격렬하게 소용돌이 2 ~ 3 시간 동안 -20 ° C 또는 1 시간 동안 -80 ° C에서 RNA 침전물을 할 수 있습니다.
- 19,000에서 30 분 동안 스핀4 ° C에서 XG, 상층 액을 제거한다.
- 펠렛을 제거하는 차가운 75 %의 에탄올과 소용돌이의 450 μL로 펠렛을 씻으십시오.
- 4 ° C에서 19,000 XG에 10 분 동안 회전하고, 상층 액을 제거한다.
- 5 분 후드 펠렛을 건조.
- RNase가없는 물 10 μL로 펠렛을 재현 탁하고, 실온에서 10 분 알을 품다.
- 분석 RNA 농도, -80 ° C에서 저장 또는 역방향 유전자 발현 분석을위한 표기.
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Representative Results
갑상선 anlages (중간 선 및 UB 함께 주위 조직과), 갑상선 엽 (叶)은 각각 E12.5 및 e13.5/e14.5에서 마우스 배아 (그림 1)에서 해부된다. 필터에 문화에서 하나의 하루를 보낸 후, 중간 선 anlage는 기관의 상단에 걸쳐 연장 된 조직으로 (그림 2A)를 볼 수 있습니다. 그것은 점진적으로 기관의 각 측면에 두 개의 엽 (叶)을 형성한다. 고립 된 갑상선 엽 (叶) (E13.5 또는 E14.5)이 배양, 그들은 확장 형태 형성과 상피 세포가 거시적으로 볼 여포 구조 (그림 2B)로 구성됩니다 받게 될 것이다.
조직 및 E-cadherin의 레이블이 상피 세포의 편광, ezrin의 immunolabeling (그림 3A)에 의해 시각하실 수 있습니다. Ezrin 양성 세포 내 구조를 점진적으로, 그리고 공동의 방법으로, 꼭대기의 기둥이 될 것입니다 세포의 하나의 극과 융합. 이 과정은 내피 세포 포지PECAM의 증식을 위해 세 심하게 배와 angio-모낭 단위 (그림 3B)를 형성하기 위해 개발 모낭 주위 조직. thyrocytes와 C-세포의 분화를 정량화하기 위해, RNA는 배양 갑상선 엽 (叶)에서 분리 및 RT-qPCR에 (그림 3C)에 의해 정량 유전자 발현 될 수있다. 갑상선 전사 인자 Nkx2.1의 표현은 문화 동안 변경되지 않는 반면, thyrocyte 특정 티로 글로불린과 C-세포 관련 칼시토닌의 발현이 크게 기능적 분화를 나타내는 증가했다.
E14.5 마우스 배아에서 갑상선을 분리하는 그림 1. 해부 단계. 절개는 황색 점선으로 그려져있다. (A) 헤드의 상부는 탄을 노출이 절개에 의해 제거된다. (B) NECK 영역은 상지 아래 및 가슴 위에 배아를 구획하여 신체의 나머지로부터 분리된다. (C) 기준으로 (에) 혀를 유지하는 것은, 신경 튜브 (NT) 및 측면 조직과 사지를 제거합니다. (D) 혀, 조각으로 부서져 부종 (*)와 식도 / 기관이 완벽하게 정렬됩니다. 먼저 혀를 제거하고 조직 식도 / 기관 영역에 래터럴. (E) 갑상선 엽 (叶)은 부분적으로 폐기해야 흉선 (THYM)에 의해 숨겨져 있습니다. (F) 갑상선 엽 (叶)은 기관 (빨간색 점선 마 젝탄)의 각 측면에 볼 수 있습니다, 또는 더 나은 형광 기자 배아를 사용하여 시각 (Pax8-크레; 로사 스톱 YFP을, 삽입). 요약 :. (혀)으로는, THYM (흉선), TRA (기관), * (조각으로 부서져 부종) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
피브로넥틴에 필터 및 갑상선 엽 (叶)의 그림 2. 해부 갑상선 외식 멋지게 생체 개발. semiporous 필터 1, 2, 3 일간 배양 E12.5 갑상선 이식편의 (A) 사진을, 공기 매체 인터페이스에서. 갑상선 상피 세포는 기관의 각 측면에 좌우 마이그레이션 및 두 개의 성장 갑상선 엽 (叶)을 형성한다. (B) 1 일 및 현미경 플라스틱 문화 실에서 배양 E14.5 갑상선 엽의 날 2 명 시야 이미지. 궁극적으로 하루 약 7 대 (20 ~ 100 μm의) 난포를 형성한다. 황색 점선은 갑상선의 상피 주변을 묘사 상피 세포의 확장과 리모델링을합니다. 스케일 바, 100 μm의. 하십시오 CLI이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 CK.
그림 3. 난포, 혈관 신생과 문화에 갑상선의 차별화. 갑상선 엽 (叶)은 지정된 시간 동안 배양 하였다. (A) 고정 조직은 전체 마운트 기저 마커 E-cadherin의에 대한 항체와 면역 염색하고 있었다 subapical 막 마커 Ezrin. 문화의 한 하루를 보낸 후, 세포 내 소포 7에 해당하는 갑상선 실질 본 작은 ezrin 양성 구조의 상피 세포. 인접 셀의 소포의 공동 융합 2 일에 작은 루멘을 형성 할 것이다; 루멘 주변의 주변 세포의 자신의 진보적 인 성장, 그리고 조직 4 일 후에 사전 모낭 구조를 묘사한다. 스케일 바, 20 μm의. (B) 갑상선 L혈소판과 내피 세포 접착 분자 (PECAM) 및 Ezrin에 대한 항체와 면역 염색 OBE. 여포는 내피 세포의 구조에 의해 둘러싸여있다. 스케일 바, 50 μm의. 갑상선 엽 (叶)에서 추출 (C) RNA는, 역 정량 PCR 전에 전사했다. 갑상선 전사 인자 Nkx2.1의 발현 및이 분화 유전자, 티로 글로불린 및 칼시토닌은 특정 프라이머 쌍을 사용하여 측정 하였다. 상대 유전자 발현을 계산하려면 ΔΔ 캐럿 방법은 참조 유전자를 100 %로 배양 전회 점으로 E-카드 헤린을 사용 하였다. A와 B에 표시된 이미지는 전체 마운트 면역 염색 갑상선 엽 (叶)의 단일 공 초점 광학 부분이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 해부 갑상선 형성으로 이어지는 복잡한 이벤트를 공부하고 더 잘 이해하기 위해 갑상선 외식 (E12.5) 또는 돌출부 (E14.5)를 배양하는 방법을 설명합니다. 인해 갑상선 ANLAGEN (정중선 anlage 및이 횡 ultimobranchial 체), 및 그 작은 크기, 인두 아치 동맥 E12.5 조직 지역화 주동이의 단편, 및 기관을 포함하는, 그러나 식도의 이중 원점 microdissected 있습니다. 도시 된 바와 같이, 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 충실히 이후 생체 내 갑상선 발달 되풀이되었습니다 : (ⅰ) 정중선 anlage는 양측 마이그레이션 및 UB로, 좁은 지협에 의해 연결된 두 개의 갑상선 돌출부 (도 2A)를 형성하도록 해 (II) 전구체는 갑상선 여포 세포로의 질량으로부터 재구성 궁극적 소재 (III) 내피 세포가 존재하는 (도 2b 및도 3a)을 편광microdissected 조직의 증식은 갑상선 엽 (叶)으로 마이그레이션과 밀접하게 상피 세포 (그림 3B)와 연결, 그들은 생체 내 7처럼 (IV) thyrocytes와 C-세포 (그림 3C) 질적으로 차별화. 절개가 물리적으로 자궁의 개발 중단 및 외식 조직 배양 조건에 적응하는 바와 같이, 형태 학적 분화 이벤트는 약간 생체 내 상황에 비해 지연됩니다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
이 방법의 중요한 측면은 해부이다. 문화에서 그들의 팽창 갑상선 엽의 적절한 발달을 저해 같이 먼저, 좌우의 조직뿐만 아니라 좌우 E12.5 이식편에서 흉선의 좌측 엽을 제거하는 것이 필수적이다. 하나 내피를 유지하고 싶은 경우 둘째, 신속성도 중요살아있는 세포. 절개는 멸균 분위기 하에서 수행되지 않은 경우, 멸균 배지에서 여러 번 이식편 세척하는 것이 중요하다. semiporous 필터에 이식편을 배양 할 때 마지막으로, 그 중간의 작은 양을 사용하고, 필터의 중심에 이식편을 배치하는 것이 중요하다. 너무 많은 매체는 필터의 외주에 흘러 필터 벽과 메 니스 커스를 만들 것이다. 이 경우, 체외 이식편은 매체를 따라 메 니스 커스에 도달한다; 개발은 오히려 공기 / 매체 인터페이스에서보다 중간에있을 것입니다.
가능한 수정 및 제한
여기에 설명 된 프로토콜은 E12.5 갑상선 절편과 E13.5 갑상선 엽 (叶)을 고립 E14.5에 적용됩니다. 젊은 세 이상 발달 단계는 해결 된 과학적 질문의 기능을 테스트 할 수 있습니다. 다른 배양 조건도 테스트 할 수 있습니다 : 갑상선 외식 또는 엽 (叶)은 3 차원 matrig에서 재배 될 수있다엘, 또는 매체는 인슐린 / 트랜스페린 / 셀레늄이 아닌 10 %의 혈청을 보완 할 수있다.
조직 문화의 중요한 측면은 산소 농도이다. 플라스틱 현미경 슬라이드 상에 성장하는 경우, 산소 농도는 이식편 상기 매체의 높이가 감소하므로 평가하는 것은 어렵다. 필터 상에 성장하면, 공기 / 매질의 계면에서, 체외 이식편, 따라서 산소의 21 %로, 분위기와 접촉한다. 후자의 경우, 하나는 인큐베이터 안에 낮은 PO 2의 농도를 사용하여 자궁의 환경에서 "저산소을"재현을 시도 할 수 있습니다.
E12.5 이식편의 tissular 복잡도가 정확 개발 장점 경우 상피 세포가 바이러스 또는 형질 감염 시약에 액세스 할 수없는 등, 또한 주요 단점이다. 조작 확산 성 시약 (저해제, 차단 항체, 성장 인자, 사이토 카인, 조정 배지)로 수행 될 수 있으며, 계속외인성 화합물은 모든 종류의 세포에 영향을 미친다는 것을 염두에 주입. 또한, 조직의 복잡성과 전체 조직 이식편 (그림 2A, 오른쪽 패널 참조)를 기준으로 한 엽 (叶)의 작은 크기는 제조 된 추출물 (RNA 또는 단백질)의 순도를 줄일 수 있습니다.
이 논문에 제시된 데이터의 대부분이 4 ~ 5 일 배양 외식으로 하였다 있지만 그림 2B에게 볼 (모낭의 지속적인 개발과 함께, 최대 10 일 플라스틱에, 긴 시간 동안 문화 기관을 유지하는 것이 가능하다 일 7시). 더 이상 문화가 수행해야하는 경우, 하나는 내피 세포를 포함한 모든 세포 유형, 외식에서 살아남을 확인해야합니다.
기존의 방법 또는 기타 다른 방법에 대하여 기술의 중요성
2D 요리 또는 3D matrice에 thyrocytes의 순수한 인구의 문화 비교S, 본 기관 배양 시스템 microdissected 단편의 천연 생리 학적 조성물을 유지할 수 있다는 장점을 제공한다. 실제로, thyrocytes와 C-세포 전구 세포뿐만 아니라, 외식은 중간 엽 및 내피 세포 등 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 포함한다. 로 이미 침샘, 신장, 폐 또는 췌장, 기관 배양 잘 모방 생체 개발을 보여 주었다. 또한, 급속 야생형 및 녹아웃 장기를 분석하여 (이득 또는 기능 상실) 조작하는 방법을 제공한다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램이나 방향
이 논문은 갑상선 개발의 세포 및 분자 측면이 현미경으로 또는 RT-qPCR에 의해 분석 될 수 있음을 보여준다 현장 하이브리드 또는 웨스턴 블롯도 수행 할 수 있습니다. 이 배양 시스템은 의무가 이득 및 특정한 억제제의 첨가를 통해 기능 상실하는 실험S, 차단 항체, 성장 인자, 사이토 카인, 또는 배양 배지 7에서도 세포. 그러나, 조직에 존재하는 모든 종류의 세포가 영향을 받는다. 그것은 바이러스 기반의 셀 타입 별 타겟팅을 개발하기 위해 흥미로운 일이 될 것이다.
형광 리포터 균주의 사용은 형광 해부 현미경으로, 조직 조각 (도 1F, 인셋)의 미세 절제를 용이하게, 또한, 막 - 태그 된 형광 단백질 (16)을 이용하여 다른 사람에 의해보고 된, 실시간으로 수행 할 수있게 3D (15, 16), 또는 문화의 특정 세포 집단을 수행 할 수있는 개발 기관의 영상. 새로운 형광 기자 균주의 개발은 조심스럽게 형태 발생 이벤트를 시각화 할 필요가있을 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
References
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