Abstract
Tiroid tiroid hormonları T3, T4 ve kalsitonin üreten, boyun tabanında lokalize bir bilobated endokrin bezdir. Kalsitonin foliküllerinin ve kan kılcal yoğun bir ağ arasına serpiştirilmiş C-hücreleri tarafından sentezlenen ise T3 ve T4, folikül adlandırılan kapalı alanlarda düzenlenmiş farklı tirositlerin, tarafından üretilmektedir. Yetişkin tiroid mimari ve fonksiyonlar, kapsamlı olarak tarif ve incelenmiştir edilmiş olmasına rağmen, "anjiyo-foliküler" birimleri, parankimasında C-hücrelerinin dağılımı ve epitelyal ve endotelyal hücreleri arasındaki iletişimin parakrin oluşumu uzak anlaşılmalıdır değil.
Bu yöntem yarı macunsu filtrelerinde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde fare embriyonik tiroid anlagen diseksiyon ve kültürünün sıralı adımları açıklar. Dört günlük bir süre içinde, bu kültür sistemi sadakatle vivo tiroid geliştirme tartışıldı. Gerçekten de, (i) bilorganın obation (E12.5 eksplantlar için) ortaya çıkar, (ii) ön-maddeleri foliküllerine düzenlemek ve polarize, (iii) tirositler ve C-hücreleri ayırt eder, (iv) microdissected proliferatif doku içinde mevcut endotel hücreleri, içine göç tirositler Onlar in vivo gibi yakından tiroid lobları, ve, epitel hücreleri ile ilişkilendirmek.
Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir. Dahası, immün ve RT-qPCR ile Ex vivo gelişimi gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Kültür antikorlar, büyüme faktörleri, ya da hücreler ya da şartlandırılmış ortam engelleme, inhibitör ilavesiyle manipüle edilebilir eksplant ya da kültürün her zaman.
Aşağı bütün-mount veya bölümleri görüntüleme ve gen ekspresyon profili tiroid o bir morfogenetik ve farklılaşma olayları manipüle ve eğitim için güçlü bir sistem sağlar üzerinde kombine sonuç, tiroid eksplant kültürü içinderganogenesis.
Introduction
Tiroid bezi endotel kılcal damarların yoğun bir ağ ile çevrili folikül denilen bağımsız epitel küreler bir bütünüdür. Bu örgüt, tiroid fonksiyon verir: endotel kapilerler T3 ve T4 hormon sentezi için gerekli olan iyot ile tirositler sağlamak, ve tüm vücuda bu son dağıtmak. Foliküllerinin ve kılcal arasında dağınık, C-hücreleri 1 kalsitonin Hipokalsemik hormonu üretir. Erişkin tiroid mimarisi ve fonksiyonları iyi bilinmesine rağmen, tiroid embriyonik gelişim (folikül oluşumu ve farklılaşma) dahil hücresel ve moleküler mekanizmalar çok anlaşılır olmaktan vardır.
Embriyojenez sırasında, (Cı-hücrelerinin ataları damla şeklinde çıkıntılar olarak E11.5 de kaynaklanan sırasında projenitör embriyonik gün foregut endoderm ventral duvarının kalınlaşması (orta hat anlage) (e) fare embriyo 8.5, olarak çıkar tirositler ultimobranchial boDördüncü faringeal torbalar 2-6) ölür. Orta hat tomurcuk daha sonra, endoderm ayrılır trakea her tarafında ultimobranchial organları ile E13.5 kaynaştırmak için bilateral genişler. Son olarak, tirositler foliküllerinin düzenlemek ve C-hücreleri ayırt.
Tiroid oluşumu üzerinde akım bilgisi temel olarak sabit dokuların histolojik analiz gelmektedir, ancak tiroid oluşumunda rol oynayan morfojenik olaylar yüksek dinamik ve farklı hücre tipleri arasında ve hücre dışı matris ile iletişimi ve etkileşimleri içerir. Son çalışmalar tirosit progenitorlar gelişmekte olan tiroid endotel hücrelerini işe VEGF'nin yüksek düzeylerde üretilmesi, ve buna bağlı olarak, endotel hücreleri folikül oluşumunu teşvik etmek ve C-hücrelerinin farklılaşma 7 işe gösterdi.
Tiroid üzerinde en ex vivo çalışmalar hem 2D doku kültürü plastik d yetişen, izole erişkin tiroid kaynaklı hücreler üzerinde yapılmıştırishes veya 3D matrislerde. Bu tür kültürlerin, farklılaşmış foliküler hücreleri polarize kalır ve folikül olarak düzenlenen veya 3D organizasyon 8-10 reacquire kullanarak. Ancak, fizyolojik bir ortamda eksplante ve 2D kültürlenmiş, bu saf epitel hücreler, hücre dışı matris, sitokinler, büyüme faktörleri ve normal olarak in vivo olarak karşılaştıkları gibi endotel veya sinir hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile etkileşimi yok sayar. Çok güzel bir çalışma, son zamanlarda 3D matrigel 11 bir son kültür adımı kullanarak tiroid foliküllerinin ES hücrelerinin bir farklılaşma protokol nitelendirdi. Bununla birlikte, bu 3D kültürler diğer hücre tipleri ile temas yoksundur.
Pankreas ve tükrük önceki uzmanlığa dayalı bir organ kültürü 12-14, fare embriyonik tiroid Anlagen diseksiyon ve yarı macunsu filtrelerde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde eksplantlarm için bir yöntem bezleri geliştirilmiştir.
Ne zamanE12.5 embriyolar ile çalışan tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ikili kökeni dokusunun büyük bir parçasının mikrodiseksiyon empoze. Bu trakea, ancak yemek borusu bulunan ve aritenoid şişme kadar faringeal kemer arterlerden uzatıldı. Filtreler üzerinde kültürlenmiştir zaman yine de dar bir kıstak tarafından bağlanan iki tiroid lobları, meydana getirmek üzere ultimobranchial organlarla sigorta burada, orta hat Anlage, trakea her iki tarafına yatay olarak uzanır.
Kültüründe, epitel hücreler çoğalmaya folikül halinde organize ve kaynağına bağlı olarak, tirositlerin ve C-hücreleri içinde farklılık gösterir. Microdissected dokusunda bulunan endotel hücreleri çoğalır ve son olarak da, bağımsız bir şekilde kan akışının veya dolaşan faktörlerin foliküler epitel yapısı ile yakından ilişkilendirmek için tiroid lobları istila. Eksplantlarının gelişme sadakatle geliştirmek vivo özetlediği gibi,ment, bu kültür sistemi morfogenetik ve tiroid bezi gelişimi sırasında meydana gelen farklılaşma olayları incelemek için en uygunudur.
Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir, ve kültür sistemi kaybı-ve kazanç-fonksiyon deneyleri elverişlidir. Son olarak, mikroskopi plastik tabaklar üzerinde floresan etiketli tiroid eksplantlarının zaman atlamalı görüntüleme daha iyi in vivo meydana kinetik ve morfogenetik hareketlerin devamlılığını araştırmak için yararlanılabilir. Zaman atlamalı görüntüleme önceden pankreas 15,16 ya da 17 ureterik gonca arasında dallanma morfolojilerinden incelemek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler Üniversitesi Hayvan Refahı Komitesi laboratuvar hayvan bakım ilkelerine göre kaldırdı ve tedavi edildi. Tüm prosedürler ve protokoller bu Komitesi tarafından kabul edildi.
1.. Mikroskopi Plastik Kültür Odaları Kaplama
Not: bir laminar akış başlığı içinde steril koşullar altında, aşağıdaki tüm adımları uygulayın. Kaplamanın iki tür işlevsel olarak eşdeğerdir.
- Fibronektin önce tiroid dokuların izolasyonu için bir gün ile kaplayın plastik kültür odaları:
- 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.25 ug / ml fungizon ve 2 mM glutamin, 12 ile takviye edilmiş M199 ortamı içinde bir 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar steril fibronektinin seyreltin.
- Seyreltilmiş fibronektinin 200 ul ile kuyu kapağı ve 4 ° C gece boyunca buzdolabında inkübe edin.
- Diseksiyon gününde, M1 ile bir kez kuyu durulayın, fibronektin aspire99 ve antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş M199 200 ul minimum hacim eklemek.
- Eksplantlar plaka hazır kadar inkübatör kaplı odaları bırakın.
- Türü ile kaplayın plastik kültür odaları Ben tiroid dokularında izolasyonu 2 saat önce kollajen:
- I 10 mM HCI içinde 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar steril kollajen tipi seyreltin. NOT: buz üzerinde kollajen stok çözüm tutun.
- Tip I kollajenin seyreltilmiş 200 ul ile kuyu örtün ve oda sıcaklığında (RT), 2 saat boyunca inkübe edilir.
- I çözeltisi kollajen tipi aspire, M199 ile bir kez durulama kuyu ve antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş M199 200 ul minimum hacim eklemek.
- Eksplantlar plaka hazır kadar inkübatör kaplı odaları bırakın.
Tiroid Anlagen içeren Dokular 2. Diseksiyonu (E12.5) veya tiroid lobları (E13.5-e14.5)
NOT: temiz kesme aletleri ve Petri / kültür plakaları kullanın. Aşağıda tarif edilen genel adımlar ve insizyon E12.5 ve E14.5 embriyolar için aynıdır.
- İstenilen embriyonik (E12.5 itibaren E14.5 için) (e) günlük zaman aşımına gebe dişi fareler Kurban ve diseksiyon aletleri kullanarak rahim kaldırmak.
- HBSS içeren bir 10 sm'lik plaka içinde parçalara rahim yerleştirin.
- Forseps ile rahim bir ekstremite tutun ve giderek tüm embriyolar kurtarmak için küçük bir makas ile rahim açın.
- Makas ile plasenta embriyoların ayırın ve HBSS içeren yeni bir 10 sm'lik plaka içinde kendi Extraembryonic membranlarla embriyolar aktarın.
- Sarısı kesesi ve amniyon çıkarın. NOT: Bu noktadan itibaren, alttan transillüminasyon ile stereomicroscope altında çalışmak; diseksiyon adımlarla büyütme artmaktadır. Kesme aletleri gibi cam kılcal tungsten iğneler kullanın.
- Gibi iğneler kullanarakBir bıçak ve çatal, üst çene ve kulak (a boyunca kesilir Şekil 1A) de dahil olmak üzere, başın üst kısmını çıkarmak.
- Sırtında embriyo tutun ve ilk nöral tüp ilave bir parça (b boyunca kesilir Şekil 1A), embriyo daha sonra alt kısmı, sadece ön bacaklarda altında ve kalp (Şekil 1B) yukarı kaldırın.
- HBSS içeren yeni bir 10 sm'lik plaka içinde dil (doku yönlendirmek için) ve boyun bölgesini içeren embriyo dilim aktarın.
- Nöral tüp çıkarın ve dokular (Bir boyunca kesilir Şekil 1C) yemek borusu / trakea posterior.
- Yavaşça bölüm (b ve b 'birlikte kesme Şekil 1C) dilin her iki tarafın birlikte doku dilim.
- Dilin uzaması, özefagus ve trakea bulun ve (Şekil 1D bir birlikte kesme), ve bot üzerindeki dokuların şişmesine Aritenoid bırakarak, dil uzak teşrih(b ve b 'birlikte kesme Şekil 1D) yemek borusu / trakea h yanları.
- Yemek borusu çıkarın ve ventral yüzü yukarı bakacak trakea yerleştirin.
- Böyle timus (Şekil 1E) ve yutak kemer arterlerin lateral bulunan tüm dokular gibi istenmeyen dokuların uzak teşrih. (Şekil 1F; kırmızı noktalı çizgiler) E13.5 veya E14.5 embriyolar için, trakea her tarafında tiroid lobları görselleştirmek ve daha trakea lobları teşrih.
- Antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış M199 ortamı ihtiva eden bir 35 mm kültür levhası içine izole edilmiş E12.5 trakea bölge veya E13.5-E14.5 tiroid lobları aktarın. P-200 mikropipet bir önceden filtre ucu kullanarak eksplantlar aktarın. E12.5 eksplantlar için, açılış genişletmek için ucunun ekstremite kesti. NOT: embriyolar aynı genotipi varsa Rutin ve tüm embriyolar üzerinde adımları 6 & 7 gerçekleştirmek,n, 9-11, ve son olarak da 12 ve 13.
Tiroid Eksplantlarından 3. Kaplama ve Kültür
- Önceden ısıtılmış kültür ortamı, 1 ml ihtiva eden bir 24-yuvalı plakanın üç kuyu ardışık transferi ile eksplantların yıkayın (= M199 antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiştir).
- Kaplı mikroskopi plastik kültür odalarına tiroid lobu Kaplama:
- Kaplanmış odalarından aspire M199 kültür ortamı.
- Dikkatle, bir mikropipet ve filtre ipuçlarını kullanarak kültür odalarına tiroid eksplantlarının aktarın. Her bir bölmenin ortasına bir eksplant yerleştirin.
- Aşırı Ortamı çıkarın ve bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde kültür odası yer (37 ° C,% 5 CO2), 2 saat boyunca, eksplantlar matrise takmak izin.
- Yavaşça her kuyuya, önceden ısıtılmış kültür ortamının 200-300 ul ekle.
- Doku kültürü inkübatörü içinde, uzun dönemli kültür inkübe edin.
- Kaplama oyarı macunsu filtreleri f trakea bölge veya tiroid lobu:
- Önceden ısıtılmış kültür ortamının 330 ul gereklidir, 24 gözlü bir levhanın gözleri sayısının doldurun.
- Kültür filtrenin altında hava kabarcıkları yakalama önlemek için özen ortamında yer filtreler (örneğin 0.4 mikron Millipore filtresi).
- Dikkatle, bir mikropipet ve filtre ipuçlarını kullanarak, filtrelerin merkezine (maksimum 4/filter) üzerine orta bir minimal hacimde tiroid eksplantlar aktarın.
- Tungsten iğne ile eksplantlardan dışarı orta ve uzayın aşırı çıkarın.
- Doku kültürü inkübatörü içinde, uzun dönemli kültür inkübe edin. NOT: laminer akış kaputun altında Change kültür ortamı her gün. 7 güne kadar Kültür eksplantlan.
Tiroid Eksplantlarından 4. Tüm montaj İmmünofloresan Boyama Protokolü
Tungsten iğneler kullanılarak veya (aşağıda 2 adımından sonra) filtreler üzerinde yetiştirilen eksplantlarını bağdakiince forseps ve primer (aşama 5) ve ikinci (basamak 7) antikor inkübasyonunun (96 çukurlu plaka) hariç tüm adımları, için bir 24-çukurlu plaka içinde transferi. Mikroskopi plastik odalarına kültüre yapışık eksplantlanndakinden, kültür odalarında tüm adımları uygulayın.
- Aspire M199 kültür ortamı, 20 dakika boyunca (24 çukurlu tabak 500 ul ve mikroskopi slaytlar olarak 300 ul), buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit (PFA) ile eksplant sabitleyin.
- Triton ile Tris Tamponlu Salin içinde 2 x 10 dakika yıkayın (TBST, 50 mM Tris HCI pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100), oda sıcaklığında karıştırıldı.
- -20 ° C'de hemen eksplantlarm veya mağaza Süreç Not: -20 ° C de, uzun süreli depolama için, kademeli olarak% 100 metanol ulaşmak için TBST içerisinde metanol konsantrasyonunu arttırarak, metanol içinde eksplantlar kurutmak. Hazır imüno (aşama 4) ile devam etmek için, yavaş yavaş metanol TBST ekleyerek eksplantlar rehidrate.
- Bloklama çözeltisi (% 10 TBST içerisinde normal keçi serumu ile TBST yerine) Ve oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca bir deniz testere rocker üzerinde inkübe edilir.
- (Koşul başına 100-200 ul) çözümü engelleme birincil antikor sulandırmak. 96 oyuklu bir plaka, 24-çukurlu plaka "filtre" eksplantlar aktarın. 4 ° C'de gece boyunca bir deniz testere rocker primer antikorlar ile inkübe eksplantlar
- Ertesi gün, birincil antikor solüsyonu atın arka bir 24-çukurlu plaka içindeki "filtre" eksplantlar transferi ve 45-60 dakika oda sıcaklığında her biri için bir deniz testere rocker TBST ile en az beş kez yıkayın.
- Normal keçi serumu,% 1 ihtiva eden TBST içinde sekonder antikor (1:2,000 seyreltmede örneğin keçi anti-X-Alexa Fluor) seyreltilir ve 4 ° C'de ve karanlıkta bir deniz testere rocker gece boyunca bu seyreltme ile eksplantların inkübe edin. Nükleer counterstaining için, birlikte ikincil antikor çözeltisi ile bis-Benzimide (Hoechst) içinde 1 ug / ml içerir.
- Ertesi gün, ikincil antikor çözüm atmak ve bir deniz gördüm üzerinde TBST'yi 5x yıkayın45-60 dakika oda sıcaklığında her biri için rocker. Yıkama sırasında, karanlıkta eksplantlar tutun.
- TBST yavaşça karanlıkta 4 ° C'de gece boyunca dönen ek bir yıkama yapın.
- Postfix 10 dakika boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA içinde immunosteyn eksplantlar.
- TBST ile 2x 10 dakika yıkayın.
- -20 ° C de, uzun süreli depolama için ya da kademeli olarak metanol içinde% 100 transfer eksplantlar ya da hemen analiz. Filtreler üzerinde kültürlenmiş ve bir 24-çukurlu plaka içinde immunosteyn önce bir multiphoton veya konfokal mikroskobu ile analiz TBST ya da daha iyi floresan montaj ortamı ile bir mikroskopi bölmesi (örneğin LABTEK veya Ibidi) transfer için eksplantlar.
Tiroid RNA 5. Ekstraksiyon
Bir Rnase-serbest ortamda çalışmak. Bu nedenle, nükleik asit ve nükleaz ücretsiz pipet ipuçlarını kullanın ve kirletici ve RNases gelen tezgah ve ekipman hem de temizleyin. Fenol / kloroform dayalı olarak bu protokol, ilk adımı gerçekleştirinKimyasal bir başlık altında (1 ile 7).
- 1.5 ml tüp için tek kullanımlık bir havan tokmağı kullanılarak RNA ekstraksiyon çözeltisi 300 ul bir eksplant tiroid ya da iki tiroid lobları homojenize. In örnekleri arasında, etanol, daha sonra su, daha sonra,% 2 SDS içinde havan tokmağı yıkayın.
- RNA ekstraksiyonu çözeltisi başka bir 100 ul, 10 saniye girdap ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- 30 saniye vorteksleyin ve her numune için 20 ng tRNA ekleyin.
- 1 dakika vorteksleyin ve kloroform içinde 80 ul ekle.
- Vortex sert biçimde 30 saniye süre ile ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- Bir buzdolabında (4 ° C) santrifüjü içinde 19,000 x g'de 15 dakika boyunca Spin.
- Coprecipitant olarak glikojen 20 ug içeren bir tüpe dikkatli bir şekilde renksiz bir üst sulu faz transfer.
- Vorteks ve% 100 izopropanol alkol 200 ul ekleyin.
- 15-30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde Vortex ve 2-3 saat boyunca -20 ° C'de ve 1 saat boyunca -80 ° C'de RNA çökelti sağlar.
- 19.000 ° C'de 30 dakika boyunca Spin4 ° C'de xg, ve yüzen ortadan kaldırır.
- Pelet çıkarmak için, soğuk% 75 etanol ve vorteks 450 ul pelet yıkayın.
- 4 ° C'de 19,000 x g'de 10 dakika boyunca Spin ve supernatant ortadan kaldırır.
- 5 dakika için kaputun altında pelet kurulayın.
- RNase-içermeyen su içinde 10 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
- Tahlil RNA konsantrasyonu, -80 ° C'de mağaza veya ters gen ekspresyon analizi için uyarlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tiroid anlages (orta hat ve UB, birlikte çevre dokulara), ve tiroid lobları sırasıyla E12.5 ve e13.5/e14.5 fare embriyoları, (Şekil 1) disseke. Filtre üzerinde kültür bir gün sonra, orta hat anlage trakea üstüne yayılan uzun bir doku olarak (Şekil 2A) görülebilir. Bu giderek trakea her iki tarafında iki lobu oluşturur. Izole tiroid lobları (E13.5 veya E14.5) kültür varsa, bunlar, genişletmek morfolojilerinden ve epitel hücreler makroskopik olarak görülebilen foliküler yapılar (Şekil 2B) içine düzenleyecek uğrayacaktır.
Organizasyon ve E-kaderin ile etiketlenmiş epitel hücrelerinin, polarizasyon, Ezrin immunolabeling (Şekil 3A) tarafından görüntülenmiştir. Ezrin-pozitif hücre içi yapılar kademeli ve uyumlu bir şekilde, apikal kutup olacak hücrenin bir kutup sigorta. Bu işlem sırasında, endotel hücreleri, sıcPECAM çoğalarak için çabaya verilen ve anjiyo-foliküler üniteler (Şekil 3B) oluşturmak için gelişmekte köklerinin çevresinde düzenlemek. Tirositlerin ve C-hücreleri farklılaşmasını ölçmek için, RNA kültürlenmiş tiroid lob izole edilir ve RT-QPCR (Şekil 3C) ile tahlil gen ifade edilebilir. Tiroid transkripsiyon faktörü Nkx2.1 ekspresyonu kültür sırasında değişmez birlikte, tirosit özgü tiroglobulin ve C-hücreye özel kalsitonin ifadesi, büyük oranda işlevsel farklılaşma gösteren artmıştır.
E14.5 fare embriyo tiroid izole etmek için Şekil 1.. Diseksiyon adımlar. Kesikler sarı noktalı çizgilerle tasvir ediliyor. (A) başın üst kısmı dil ortaya çıkarmak için iki yarık ile çıkarılır. (B) Başka yerde sınıflandırılmamışk bölge üst ekstremite altında ve kalp üzerinde embriyo kesit ile vücudun geri kalanından ayrılır. (C), bir kılavuz olarak (to) dil tutulması, nöral tüp (nt) ve yanal doku ve bacaklarda çıkarın. (D) dil, aritenoid şişlik (*) ve yemek borusu / trakea mükemmel hizalanır. İlk dilini çıkarın ve daha sonra dokular özofagus / trakea bölgeye lateral. (E) Tiroid lobları kısmen atılmalıdır timus (thym) tarafından gizlidir. (F) Tiroid lobları trakea (kırmızı noktalı topak) her tarafında görülebilir, ya da daha iyisi floresan raportör embriyoları kullanılarak görüntülendi (PAX8-Cre; Rosa-stop-YFP; içerlek). Kısaltmalar:. (Dil) için, thym (timus), tra (trakea), * (aritenoid şişme) , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Fibronektin, filtre ve tiroid lobu Şekil 2. Dissected tiroid eksplantlan güzel ex vivo gelişir. Yarı macunsu filtre üzerinde 1, 2 ve 3 gün kültüre bir E12.5 Tiroid eksplant (A) Fotoğraf, hava orta arayüzü. Tiroid epitel hücreleri trakea her iki tarafında karşılıklı iki geçiş ve artan tiroid lobları oluşturur. (B) Günde 1 ve mikroskopi plastik kültür odalarına kültüre bir E14.5 tiroid lobun 2 gününde aydınlık görüntüler. Sonuçta günde yaklaşık 7 büyük (20-100 mikron) köklerini oluşturur. Sarı noktalı çizgi tiroid epitel çevresini delineates epitel genişleme ve yenileme unutmayın. Ölçek bar, 100 mikron. Lütfen cliBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya ck.
Şekil 3,. Folikülogenez, anjiyojenez ve kültür tiroid farklılaşma. Tiroid loblar belirlenen süre içinde kültürlenmiştir. (A) Sabit dokuların tüm montaj bazolateral işaretleyici E-kaderin karşı antikorlar ile boyanmış, ve edildi subapikal membran işaretleyici Ezrin. Bir günlük kültürden sonra, hücre içi veziküller 7 tekabül tiroid parankimi, mevcut küçük Ezrin pozitif yapıların epitel hücreleri. Komşu hücrelerden vezikül Ortak füzyon 2 gün küçük lümen oluşturacaktır; lümen etrafında çevreleyen hücreler onların ilerici büyüme ve organizasyon 4 gün sonra ön-foliküler yapılar tasvir edecektir. Ölçeği bar, 20 mikron. (B) Tiroid lTrombosit ve endotel hücre adezyon molekülü (PECAM) ve Ezrin karşı antikorlar ile boyanmış OBE. Folikülleri endotel yapılarla çevrilidir. Ölçek çubuğu, 50 mm. Tiroid loblar çıkarılan (C) RNA, nicel PCR, ters transkribe edilmiştir önce. Tiroid transkripsiyon faktörü Nkx2.1 ekspresyonu ve iki farklılaşma gen, tiroglobulin ve kalsitonin, spesifik primer çiftleri kullanılarak ölçülmüştür. Göreceli gen ekspresyonu hesaplamak için, ΔΔ Ct yöntem, referans geni ve% 100 olarak, kültürün son zaman noktası olarak E-kaderin ile kullanılmıştır. A ve B gösterilen Görüntüler tüm montaj immunostan tiroid lobu tek konfokal optik bölümleridir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, kesme ve tiroid oluşumuna yol açan karmaşık olay çalışma ve daha iyi anlamak amacıyla, tiroid eksplantlar (E12.5) ya da loblar (E14.5) kültürlenmesi için bir yöntem tarif etmektedir. Nedeniyle tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ve kendi küçük boyutu, yutak kemer arterlere E12.5 doku lokalize rostral bir parçası, ve trakea içeren, ancak yemek borusu ikili kökeni microdissected edilir. Gösterildiği gibi, dört günlük bir süre içinde, bu kültür sistemi sadık Başlangıcı vivo tiroid gelişiminde tekrarıdır: (i) orta hat anlage ikili göç ve UB ile, dar bir kıstak tarafından bağlanan iki tiroid lobu (Şekil 2A) oluşturmak üzere genişler , (ii) ön-maddeleri, tiroid folikül içine bir hücre kütlesinden yeniden düzenlemek ve sonuçta in (iii) endotel hücreleri mevcut olduğunda, (Şekil 2B ve 3A) polarizemicrodissected doku, bölünerek çoğalmakta ve tiroid lob içine göç ve yakından epitel hücreleri (Şekil 3B) ile ilişkilendirir ve in vivo 7'de olduğu gibi (iv) tirositler ve C-hücrelerinin, (Şekil 3C) niteliksel olarak ayırt. Diseksiyon fiziksel utero geliştirme keser ve eksplante doku kültürü duruma uyum için olduğu gibi, morfolojik ve farklılaşma olayları biraz in vivo duruma göre gecikmelidir.
Protokolü içerisindeki kritik adım
Bu yöntemin önemli bir özelliği, diseksiyon bulunmaktadır. Kültüründe büyüme tiroid lobların doğru gelişmesini engellemek İlk olarak, bu yan dokular yanı sıra, doğru ve E12.5 eksplantlardan timus bezi sol lobları kaldırmak için gereklidir. Bir endotel korumak istiyorsa, ikinci, hız da önemlidircanlı hücreler. Diseksiyon steril atmosferi altında gerçekleştirilmezse, bu steril kültür ortamı içinde birkaç kez, eksplantlar yıkamak için önemlidir. Yarı macunsu filtreler üzerinde eksplantların kültürlenmesiyle Son olarak, bu orta küçük bir hacmini kullanma ve filtre ortasına eksplantlar için önemlidir. Çok fazla orta filtrenin çevresine akış ve filtre duvarı ile bir menisküs oluşturacaktır. Bu durumda, eksplant orta takip ve menisküs ulaşır olacaktır; gelişimi daha çok hava / orta arayüzü göre bir ortam içinde olacaktır.
Olası değişiklikler ve sınırlamalar
Burada açıklanan protokol E12.5 Tiroid eksplantlanna ve E13.5 ve tiroid lobu izole E14.5 için geçerlidir. Genç ve yaşlı gelişim evreleri ele bilimsel soru fonksiyonu test edilebilir. Diğer kültür koşulları da test edilebilir: tiroid eksplantlarında veya lobları 3D matrig yetiştirilen olabilirEl veya orta insülin / Transferrin / selenyum ile yerine% 10 serum ile tamamlanabilir.
Doku kültürü içinde önemli bir yönü oksijen konsantrasyonudur. Mikroskopi plastik slaytlar üzerinde yetiştirilen, oksijen konsantrasyonu bu eksplantların yukarıdaki ortamın yüksekliği azalır olarak takdir etmek zordur. Filtreler üzerinde yetiştirildiğinde, hava / orta arayüzü, eksplantlar, dolayısıyla oksijen,% 21 ile, bir atmosfer ile temas içinde bulunmaktadır. Bu son durumda, bir inkübatör içinde alt pO2 konsantrasyonu kullanılarak utero ortamda "hipoksi" yeniden deneyebilirsiniz.
E12.5 eksplantlarının dokusal karmaşıklığı doğru gelişimi için bir avantaj ise epitel hücreleri virüs veya transfeksiyon reaktifler için erişilebilir değil gibi, o da bir ana dezavantajı. Manipülasyon yayılabilir reaktifler (önleyicileri, bloke edici antikorlar, büyüme faktörleri, sitokinler, şartlandırılmış ortam) ile yapılabilir, tutuneksojen bileşik tüm cep türlerini etkiler akılda ing. Ayrıca, doku karmaşıklığı ve tüm doku eksplantı (Şekil 2A, sağ panel bakınız) göre lobların küçük boyutlu, hazırlanan ekstrelerin (RNA ya da protein) saflığını azaltır.
Bu çalışmada sunulan veri çoğu 4-5 gün kültürlendi eksplantlar elde edilmiştir, ancak, bu Şekil 2B, bakınız (folikül sürekli bir gelişim ile, en fazla 10 gün plastik üzerinde, daha uzun bir süre için kültürdeki organı tutmak mümkündür 7 gün sonra). Artık kültürler yapılacak varsa, bir endotel hücreleri dahil olmak üzere tüm hücre tipleri, eksplantlarında hayatta olduğunu doğrulamalısınız.
Mevcut yöntemlerle ya da diğer alternatif yöntem ile ilgili olarak tekniğin önemi
2D veya 3D yemekleri matrice içinde tirositlerin saf popülasyonlarının kültürüne kıyaslas, bu organ kültür sisteminde microdissected parçalarının doğal ve fizyolojik bileşimin korumanın avantajını sunar. Gerçekten de, tirositlerin ve C-hücrelerinin ataları ek olarak, eksplantlar mezenkimal ve endotel hücrelerinin yanı sıra dışı matrisi içerir. Daha önce belirtildiği gibi tükürük bezleri, böbrek, akciğer ya da pankreas, organ kültürleri güzel bir şekilde taklit eden in vivo gelişimi ile gösterdi. Ayrıca, hızla vahşi tip ve nakavt organları analiz ve (kazanç veya kaybı-fonksiyonu) işlemek için bir yol sağlar.
Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamaları veya tarifi
Bu çalışma, tiroid gelişme hücresel ve moleküler yönleri, bir mikroskop ya da RT-qPCR analiz edilebilir olduğunu göstermektedir, bir yerinde hibridizasyon veya western blot da gerçekleştirilebilir. Bu kültür sistemi müsait kazanç ve spesifik inhibitörü ilave edilerek zarar fonksiyon-deneyleri içins, bloke edici antikorlar, büyüme faktörleri, sitokinler, ya da kültür ortamında 7 bile hücreler. Bununla birlikte, doku içinde mevcut tüm hücre tipleri etkilenir. Bu virüs temelli bir hücre tipi özel hedefleme geliştirilmesi için ilginç olabilir.
Bir flüoresan raportör soyunun kullanılması, bir flüoresan mikroskop ile, doku parçasının (Şekil 1F, ek), mikrodiseksiyon kolaylaştıran, aynı zamanda, bir zar-etiketli floresan protein kullanılarak 16 diğerleri tarafından rapor edilen, gerçek zamanlı gerçekleştirmek için olanak sağlar 3D 15,16 ya da kültürde bir belirli hücre popülasyonunu izlemek için gelişmekte olan organ görüntüleme. Yeni bir floresan haberci soylarının gelişimi dikkatle morfojenik olayları görselleştirmek için gerekli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
References
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
