Abstract
Skjoldbruskkirtlen er en bilobated endokrin kirtel lokaliseret ved bunden af halsen, der producerer thyroidhormoner T3, T4 og calcitonin. T3 og T4 er produceret af differentierede thyrocytter, organiseret i lukkede områder kaldet hårsække, mens calcitonin syntetiseret af C-celler, afbrudt i mellem follikler og et tæt net af blod kapillærer. Selv voksne skjoldbruskkirtlen arkitektur og funktioner er blevet udførligt beskrevet og studeret, dannelsen af de "angio-follikulært" enheder, fordelingen af C-celler i parenkym og parakrine kommunikation mellem epitel og endotelceller er langt fra at blive forstået.
Denne metode beskriver sekventielle trin af muse embryonale skjoldbruskkirtlen anlagen dissektion og dets kultur på semiporous filtre eller på mikroskopi plastik dias. Inden for en periode på fire dage, denne kultur-system trofast rekapitulerer in vivo skjoldbruskkirtlen udvikling. Faktisk (i) miaobation af organet forekommer (for E12.5 eksplantater), (ii) thyrocytter forstadier organisere sig i follikler og polariserer (iii) thyrocytter og C-celler differentierer, og (iv) endotelceller stede i Mikrodissekterede væv formere, migrerer ind i thyreoidea lapper, og arbejde tæt sammen med de epitelceller, som de gør i vivo.
Skjoldbruskkirtel væv kan opnås fra vildtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoner. Desuden eksplantater kultur kan manipuleres ved tilsætning af inhibitorer, blokerende antistoffer, vækstfaktorer, eller endog celler eller konditioneret medium. Ex vivo-udvikling kan analyseres i realtid, eller på ethvert tidspunkt af kulturen ved immunfarvning og RT-qPCR.
Konklusionen er, skjoldbruskkirtel explant kultur kombineret med nedstrøms hel-mount eller på strækninger billedbehandling og genekspressionsprofilering giver et kraftfuldt system til at manipulere og studere morfogenetiske og differentiering begivenheder skjoldbruskkirtlen organogenesis.
Introduction
Skjoldbruskkirtlen er en samling af uafhængige epitelial kugler, kaldet hårsække, omgivet af et fintmasket net af endotel kapillærer. Denne organisation giver skjoldbruskkirtel funktion: endotel kapillærer give thyrocytter med jod, der kræves for T3 og T4 hormon syntese og distribuere disse sidstnævnte til hele kroppen. Spredt mellem de hårsække og kapillærer, C-celler producerer hypocalcæmiske hormon calcitonin 1. Selv voksne skjoldbruskkirtlen arkitektur og funktioner er velkendte, de cellulære og molekylære mekanismer involveret i skjoldbruskkirtlen embryonale udvikling (follikelstimulerende dannelse og differentiering), er langt fra at blive forstået.
Under embryogenese, thyrocytter progenitor stammer som en fortykkelse (midterlinjen Anlage), i den ventrale væg foregut endoderm på embryonisk dag (e) 8.5 i museembryo, mens C-celler progenitorer stamme fra e11.5 som dråbe-formede fremspring ( den ultimobranchial bodør) i fjerde svælg poser 2-6. Midterlinjen knop derefter frigøres fra endodermen udvider bilateralt til at smelte ved E13.5 med ultimobranchial organer på hver side af trachea. Endelig thyrocytter organisere sig i follikler og C-celler differentierer.
Aktuel viden om skjoldbruskkirtlen dannelse kommer hovedsageligt fra histologisk analyse af faste væv, men de morfogenetiske begivenheder involveret i skjoldbruskkirtlen dannelse er meget dynamisk og involverer kommunikation og interaktion mellem forskellige celletyper og med den ekstracellulære matrix. Tidligere arbejde viste, at thyrocyte progenitorer producerer høje niveauer af VEGF til at rekruttere endotelceller til at udvikle skjoldbruskkirtlen, og til gengæld, ansat endotelceller fremme follicle dannelse og C-celler differentiering 7.
De fleste ex vivo undersøgelser af skjoldbruskkirtlen er blevet udført på isolerede voksne thyreoidea-afledte celler dyrket enten 2D vævsdyrkningsplastik dishes eller i 3D matricer. Ved hjælp af disse typer af kulturer, differentierede follikelceller enten forblive polariseret og organiseret som hårsække eller generhverve en 3D organisation 8-10. Men disse rene epitelceller eksplanterede fra deres fysiologisk miljø, og dyrket i 2D, ignorere interaktioner med ekstracellulære matrix, cytokiner, vækstfaktorer og med andre celletyper, såsom endotelceller eller nerver celler, som de normalt støder på in vivo. En meget flot undersøgelse for nylig beskrevet en differentiering protokol af ES-celler i skjoldbruskkirtlen hårsække ved hjælp af et sidste skridt kultur i 3D matrigel 11. Men disse 3D-kulturer mangler kontakt med andre celletyper.
Baseret på tidligere ekspertise på bugspytkirtlen og spytkirtlerne organkultur 12-14, en fremgangsmåde til at dissekere musefostre skjoldbruskkirtlen anlagen og dyrkning eksplantaterne på semiporous filtre eller på mikroskopi plast dias blev udviklet.
Hvornårarbejder med E12.5 embryoer, den dobbelte oprindelse i skjoldbruskkirtlen anlagen (midterlinjen anlage og de to laterale ultimobranchial organer) indførte mikrodissektion af et stort fragment af væv. Dette indeholdt luftrøret, men ikke spiserøret og udvidet fra buen arterier op til arytenoid hævelse. Når dyrket på filtre, midterlinjen Anlage strækker sig sideværts på hver side af luftrøret, hvor de smelter sammen med ultimobranchial organer til dannelse af de to skjoldbruskkirtlen lapper, der stadig er forbundet med en smal landtange.
I kultur, epitelceller formere sig, organisere sig i hårsække og differentiere i thyrocytter og C-celler, afhængigt af deres oprindelse. Endotelceller indeholdt i mikrodissekeres væv også formere sig og invadere skjoldbruskkirtlen lapper til endelig at knytte tæt sammen med epitelial follikulært struktur, uafhængigt af blodgennemstrømning eller cirkulerende faktorer. Da udviklingen af eksplantaterne trofast rekapitulerer in vivo udvikleling, denne kultur-system er optimal til at studere morfogenetiske og differentiering begivenheder i skjoldbruskkirtlen udvikling.
Skjoldbruskkirtel væv kan opnås fra vildtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoner og kulturen systemet er modtagelig for tab og gevinst-of-funktion eksperimenter. Endelig kunne time-lapse billeddannelse af fluorescens-mærkede skjoldbruskkirtlen eksplanteret på mikroskopi plast retter udnyttes til bedre undersøge kinetik og kontinuitet i morfogenetiske bevægelser, der forekommer in vivo. Time-lapse imaging er allerede blevet brugt til at studere forgrening morfogenese i bugspytkirtlen 15,16 eller ureteric opløbet 17..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus blev rejst og behandlet i overensstemmelse med principperne for laboratoriedyr pleje af University Animal Welfare udvalget. Alle procedurer og protokoller blev godkendt af udvalget.
1.. Coating af Mikroskopi Plastic Kultur Chambers
BEMÆRK: Udfør alle følgende trin under sterile forhold i en laminar flow hætte. De to typer af belægning er funktionelt ækvivalente.
- Coat plast kultur kamre med fibronektin en dag før isolering af skjoldbruskkirtlen væv:
- Fortynd steril fibronectin til en 50 ug / ml slutkoncentration i M199-medium suppleret med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 0,25 ug / ml fungizon og 2 mM glutamin 12.
- Dæk brøndene med 200 pi fortyndet fibronektin og inkuberes natten over i et 4 ° C køleskab.
- På dagen for dissektion, opsug fibronektin, skylles brøndene en gang med M199 og tilføje et minimum volumen på 200 pi af M199 suppleret med antibiotika, glutamin og 10% føtalt kalveserum.
- Lad de coatede kamre i inkubatoren indtil den er klar til tallerken eksplantaterne.
- Frakke plast kultur kamre med type I kollagen 2 hr før isolering af skjoldbruskkirtlen væv:
- Fortyndet steril type I collagen til et 50 ug / ml endelig koncentration i 10 mM HCI. BEMÆRK: Opbevar kollagen stamopløsning på is.
- Dæk brønde med 200 pi fortyndet type I collagen og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur (RT).
- Aspirer type I collagen opløsning, skylles brøndene en gang med M199 og tilføje et minimum volumen på 200 pi af M199 suppleret med antibiotika, glutamin og 10% føtalt kalveserum.
- Lad de coatede kamre i inkubatoren indtil den er klar til tallerken eksplantaterne.
2.. Dissektion af Skjoldbruskkirtel Anlagen-indeholder væv (E12.5), eller Thyreoidea Lobes (E13.5-E14.5)
BEMÆRK: Brug rene Dissecting værktøjer og Petri / Kultur plader. De generelle trin og indsnit beskrevet nedenfor er de samme for E12.5 og E14.5 embryoer.
- Sacrifice tidsbestemt gravide hunmus ved den ønskede embryonale (e) dag (fra E12.5 til E14.5), og fjerne livmoderen ved hjælp dissektionsinstrumenter.
- Placer dissekeret livmoderen i en 10 cm plade indeholdende HBSS.
- Hold den ene ende af livmoderen med en pincet og åbne livmoderen med en lille saks gradvist at befri alle de embryoner.
- Adskil embryoner fra placenta med en saks og overføre embryoner med deres extraembryonic membraner i en ny 10 cm plade indeholdende HBSS.
- Fjern blommesækken og fosterhinden. BEMÆRK: Fra dette punkt, arbejder under et stereomikroskop med gennemlysning nedefra; stigende forstørrelse med dissektion trin. Brug wolfram nåle i glaskapillarer som dissekere værktøjer.
- Ved hjælp af nåle somen kniv og gaffel, fjerne den øverste del af hovedet, herunder overkæben og ørerne (figur 1A langs en).
- Hold embryonet på ryggen og fjerne først et ekstra stykke af neuralrøret (figur 1A, skåret langs b), så den nederste del af embryonet, lige under de forreste ben og over hjertet (figur 1B).
- Overfør embryo skive indeholdende tunge (at orientere væv) og halsområdet i en ny 10 cm-plade indeholdende HBSS.
- Fjern neuralrøret og væv posteriort spiserøret / trachea (figur 1C, skæres langs en).
- Forsigtigt afsnittet vævssnit langs begge sider af tungen (figur 1C, skåret langs b og b ').
- Find spiserøret og luftrøret, i forlængelse af tungen, og dissekere væk tungen, forlader arytenoid hævelse (figur 1D, klippe langs a), og vævet på both sider i spiserøret / luftrøret (figur 1D, klippe langs b og b ').
- Fjern spiserøret, og placer luftrøret med sin ventrale side opad.
- Dissekere væk de uønskede væv såsom thymus (figur 1E), og alle de væv, der ligger sideværts til buen arterier. For E13.5 eller E14.5 embryoer, visualisere skjoldbruskkirtlen lapper på hver side af luftrøret (figur 1F, røde stiplede linjer) og videre dissekere lapper fra luftrøret.
- Overfør det isolerede E12.5 luftrøret region eller E13.5-E14.5 skjoldbruskkirtlen lapper i en 35 mm dyrkningsplade indeholdende forvarmet M199-medium suppleret med antibiotika, glutamin og 10% føtalt kalveserum. Overfør eksplantater under anvendelse af et befugtet filter tip på en P-200 mikropipette. For E12.5 explanter, skæres det yderste af spidsen for at udvide åbningen. BEMÆRK: Rutinemæssigt, og hvis embryoner har samme genotype udføre trin 6 & 7 på alle de embryoner, denn 9-11, og endelig 12 & 13.
3.. Plating og Kultur Skjoldbruskkirtel Eksplantater
- Vask eksplantaterne ved successiv overførsel i tre brønde i en 24-brønds plade indeholdende 1 ml forvarmet dyrkningsmedium (= M199 suppleret med antibiotika, glutamin og 10% føtalt kalveserum).
- Plettering af thyreoidea lapper på coated mikroskopi plast kultur kamre:
- Aspirer M199 dyrkningsmedium fra de coatede kamre.
- Forsigtigt, overføre skjoldbruskkirtlen eksplantaterne i kulturen kamre Med en mikropipette og filter tips. Placer den ene explant i midten af hvert kammer.
- Fjern overskydende medium og placere kulturen kammer i en vævskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 2 timer for at lade eksplantaterne tillægger matrixen.
- Forsigtigt tilføje 200 til 300 pi foropvarmede kulturmedium til hver brønd.
- Inkuber i langvarig kultur i vævskultur inkubator.
- Belægning of luftrøret region eller skjoldbruskkirtlen lapper på semiporous filtre:
- Fyld antallet af brønde i en plade med 24 brønde påkrævet med 330 pi foropvarmede dyrkningsmedium.
- Placer filtre (fx 0,4 um Millipore filter) på mediet, idet man for at undgå indfangning af luftbobler under kultur-filter.
- Omhyggeligt med en mikropipette og filter tip, overføre skjoldbruskkirtlen eksplantaterne med et minimalt volumen af medium på midten af filtrene (maksimal 4/filter).
- Fjerne overskydende medium og rummet ud eksplantater med en wolfram nål.
- Inkuber i langvarig kultur i vævskultur inkubator. BEMÆRK: Skift dyrkningsmedium hver anden dag under laminar flow hætte. Kultur eksplantaterne op til 7 dage.
4.. Whole-mount immunofluorescensfarvning Protokol for Thyreoidea Eksplantater
Løsne eksplantater dyrket på filtre (efter trin 2 nedenfor) ved anvendelse af wolfram nåle ellerfin pincet og overføres til en 24-brønds plade til alle trin, bortset fra den primære (trin 5) og sekundære (trin 7) antistofinkubationer (96-brønds plade). For vedhængende explanter dyrket på mikroskopi plastik kamre, udføre alle trinene i kulturen kamre.
- Aspirer M199 dyrkningsmedium og fastsætte eksplantatet med iskold 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min (500 pi i 24-godt fad og 300 pi i mikroskopi dias).
- Vask 2x 10 minutter i Tris-bufret saltvand med Triton (TBST, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) ved stuetemperatur.
- Behandle eksplantaterne straks eller opbevares ved -20 ° C. BEMÆRK: For langtidsopbevaring ved -20 ° C, dehydrere eksplantaterne i methanol ved gradvist at øge methanol koncentration i TBST at nå op på 100% methanol. Når klar til at fortsætte med immunfarvning (trin 4), rehydrere eksplantaterne ved gradvis tilsætning TBST til methanol.
- Udskift TBST med blokerende opløsning (10% normalt gedeserum i TBST), Og der inkuberes i en hav-sav rocker i 30-60 min ved RT.
- Fortyndet primære antistof i blokerende opløsning (100-200 ml pr betingelse). Overfør "filter" eksplantater fra en 24-brønds plade til en 96-brønds plade. Inkuber explanter med de primære antistoffer på en hav-sav rocker natten over ved 4 ° C.
- Den næste dag, det primære antistof løsningen kassere, overføre "Filter" explanter tilbage i en 24-brønds plade, og vask mindst fem gange med TBST på et hav-sav rocker for 45-60 min hver ved RT.
- Fortyndet sekundært antistof (fx ged anti-X-Alexa Fluor på 1:2.000 fortynding) i TBST indeholdende 1% normalt gedeserum og inkuber eksplantaterne med denne fortynding natten over på en hav-sav rocker ved 4 ° C og i mørke. For nukleare kontrastfarvning, omfatter 1 mg / ml af bis-benzimid (Hoechst) sammen med det sekundære antistof løsning.
- Den næste dag, den sekundære antistof løsning kassere og vask 5x med TBST på en hav-savrocker for 45-60 min hver ved RT. Under vask, holde eksplantaterne i mørke.
- Udfør en ekstra vask i TBST blidt hvirvlende natten over ved 4 ° C i mørke.
- Postfix de immunofarvede eksplantater i 4% PFA ved 4 ° C i 10 min.
- Vask 2x 10 min med TBST.
- Overfør eksplantaterne enten gradvist i methanol 100% for langtidsopbevaring ved -20 ° C, eller analysere det samme. For eksplantater dyrket på filtre, og immunofarvede i en 24-brønds plade, overførsel i en mikroskopi kammer (f.eks LabTek eller Ibidi) med TBST eller bedre fluorescerende montering medium forud for analyse med en multiphoton eller konfokal mikroskop.
5.. Ekstraktion af RNA fra Skjoldbruskkirtel
Arbejde i et RNase-frit miljø. Brug derfor nukleinsyre og nukleasefrit pipettespidser og rengør både bænk og udstyr fra forurenende stoffer og RNaser. Denne protokol er baseret på phenol / kloroform, udføre det første skridts (1 til 7) under en kemisk hætte.
- Homogenisere en skjoldbruskkirtlen eksplantatet eller to skjoldbruskkirtlen lapper med 300 pi RNA-ekstraktion opløsning ved hjælp af en engangs pistil i 1,5 ml rør. I mellem prøverne vaskes pistil i 2% SDS, derefter med vand, derefter ethanol.
- Tilføje yderligere 100 pi RNA-ekstraktion opløsning vortex 10 sek, og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Vortex i 30 sekunder og tilsættes 20 ng tRNA til hver prøve.
- Vortex for 1 min og tilsættes 80 pi chloroform.
- Vortex kraftigt i 30 sek, og der inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Spin i 15 min ved 19.000 xg i et køleskab (4 ° C) centrifuge.
- Overfør forsigtigt den farveløse øvre vandige fase i en frisk rør indeholdende 20 ug glykogen som coprecipitant.
- Vortex og tilsæt 200 pi 100% isopropanol alkohol.
- Vortex kraftigt i 15-30 sekunder og lade RNA-bundfald ved -20 ° C i 2-3 timer eller ved -80 ° C i 1 time.
- Spin i 30 minutter ved 19.000xg ved 4 ° C, og fjerne supernatanten.
- Vask pelleten med 450 pi kold 75% ethanol og vortex at fjerne bundfaldet.
- Spin i 10 minutter ved 19.000 xg ved 4 ° C, og fjerne supernatanten.
- Tør pelleten under hætten i 5 min.
- Pelleten resuspenderes med 10 pi RNase-frit vand og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur.
- Assay RNA-koncentrationen, opbevares ved -80 ° C eller omvendt transskribere for genekspression analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thyreoidea anlages (midterlinjen og UB, sammen med omgivende væv), og skjoldbruskkirtel lapper dissekeres fra museembryoer på E12.5 og e13.5/e14.5 henholdsvis (figur 1). Efter en dag i kultur på filter midterlinjen Anlage er synlig (figur 2A) som et langstrakt væv spænder oven på luftrøret. Den gradvist danner to kamre på hver side af trachea. Hvis isolerede skjoldbruskkirtlen lapper (E13.5 eller E14.5) dyrkes, vil de udvide, undergår morfogenese og epitelceller vil organisere sig i makroskopisk synlige follikulært strukturer (figur 2b).
Organisation og polarisering af epitelceller, mærket med E-cadherin, kan visualiseres ved ezrin immunolabeling (figur 3A). Ezrin positive intracellulære strukturer progressivt, og på en samordnet måde, sikring med den ene pol af den celle, der bliver den apikale pol. Under denne proces positionere endotelcellertive for PECAM formere og organisere omkring udviklingslandene hårsække til at danne angio-follikulære enheder (figur 3B). For at kvantificere differentiering af thyrocytter og C-celler, kan RNA isoleres fra de dyrkede skjoldbruskkirtlen lapper, og genekspression analyseres ved RT-qPCR (figur 3C). Mens ekspressionen af skjoldbruskkirtlen transkriptionsfaktor Nkx2.1 ikke ændres under kultur, ekspression af thyrocyte-specifikke thyroglobulin og C-cellespecifik calcitonin steget dramatisk, hvilket indikerer funktionel differentiering.
Figur 1.. Dissektion skridt til at isolere skjoldbruskkirtlen fra E14.5 mus foster. Snit er afbildet med gule stiplede linjer. (A) Den øverste del af hovedet er fjernet ved to snit for at blotlægge tungen. (B) NECk region er adskilt fra resten af kroppen ved sektionering embryonet under de øvre lemmer og over hjertet. (C) holde tungen (til) som en guide, fjerne neuralrøret (nt), og de laterale væv og lemmer. (D) Tungen, arytenoid hævelse (*) og spiserøret / luftrøret er perfekt afstemt. Fjern først tungen og derefter væv laterale til spiserøret / luftrøret region. (E) Thyreoidea lapper er delvist skjult af thymus (thym), der skal kasseres. (F) Thyroid lapper er synlige på hver side af luftrøret (rød punkterede stenkulsbriketter) eller bedre visualiseret under anvendelse af fluorescerende reporter embryoner (Pax8-Cre, Rosa-stop YFP, indsat). Forkortelser:. Til (tunge), Thym (thymus), tra (trachea), * (arytenoid hævelse) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Dissekeret skjoldbruskkirtlen eksplantaterne på filtrer og skjoldbruskkirtlen lapper på fibronektin pænt udvikle ex vivo. (A) Fotografier af en E12.5 skjoldbruskkirtel explant dyrket i 1, 2 og 3 dage på semiporous filter, ved air-medium interface. Thyroid epitelceller migrere bilateralt på hver side af luftrøret og danne to voksende skjoldbruskkirtlen lapper. (B) lysfelt billeder på dag 1 og dag 2 i en E14.5 skjoldbruskkirtlen lap dyrket på mikroskopi plastik kultur kamre. Bemærk udvidelse og ombygning af epithel, som i sidste ende danner store (20-100 um) follikler omkring dag 7. Gul stiplede linje afgrænser epithelial periferien af skjoldbruskkirtlen. Skalapanelerne, 100 um. venligst klick her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Folliculogenesis, angiogenese og differentiering af skjoldbruskkirtel i kultur. Thyreoidea lapper blev dyrket i den angivne tid. (A) Faste væv hel-mount immunfarvet med antistoffer mod den basolaterale markør E-cadherin, og subapikale membran markør Ezrin. Efter en dag i kultur, epitelceller i skjoldbruskkirtlen parenchym tilstedeværende små ezrin-positive strukturer, der svarer til intracellulære vesikler 7. Samordnet fusion af vesiklerne fra tilstødende celler vil danne små lumen på dag 2; deres progressiv vækst, og organisering af de omkringliggende celler omkring lumen vil afgrænse pre-follikulært strukturer efter 4 dage. Scale bar, 20 um. (B) Thyreoidea lObe immunofarvet med antistoffer mod Trombocyt og endotelcelleadhæsion Molecule (PECAM) og Ezrin. Follikler er omgivet af endotel strukturer. Scale bar, 50 um. (C) RNA, udvundet fra skjoldbruskkirtlen lapper blev revers transkriberet før kvantitativ PCR. Ekspressionen af skjoldbruskkirtlen transkriptionsfaktor Nkx2.1 og to af differentiering gener, thyroglobulin og calcitonin, blev målt under anvendelse af specifikke primerpar. For at beregne den relative genekspression blev ΔΔ Ct anvendte metode, ved hjælp af E-cadherin som reference-genet og det sidste tidspunkt af kulturen som 100%. Illustrationerne i A og B er enkelt konfokal optiske sektioner af hel-mount immunofarvede skjoldbruskkirtlen lapper. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en metode til at dissekere og dyrkning skjoldbruskkirtlen eksplantaterne (E12.5) eller lapper (E14.5) for at studere og bedre forstå de komplekse begivenheder, der førte til skjoldbruskkirtlen dannelse. På grund af den dobbelte oprindelse skjoldbruskkirtlen anlagen (midterlinjen Anlage og de to laterale ultimobranchial organer) og deres lille størrelse, et fragment af E12.5 væv lokaliseret rostralt til buen arterier og indeholdende luftrøret, men ikke spiserøret er mikrodissekeres. Som illustreret, inden for en periode på fire dage, denne kultur-system trofast rekapitulerer in vivo skjoldbruskkirtlen udvikling siden: (i) midterlinjen anlage vandrer bilateralt og udvider til at danne med UB, to skjoldbruskkirtlen lapper forbundet med en smal landtange (figur 2A) , (ii) skjoldbruskkirtlen forstadier reorganisere fra en masse af celler i follikler og i sidste ende polarisere (figur 2B og 3A), (iii) endotelceller til stede imikrodissekeres væv formere sig, migrere ind i skjoldbruskkirtlen lapper, og arbejde tæt sammen med de epithelceller (figur 3b), og (iv) thyrocytter og C-celler differentierer kvalitativt (figur 3C), som de gør i vivo 7. Som dissektion fysisk afbryder in utero udvikling og eksplanterede væv har til at tilpasse sig til dyrkningsbetingelser, er en smule forsinket morfologiske og differentiering begivenheder sammenlignet med in vivo-situationen.
Kritiske trin i protokollen
Det kritiske aspekt ved denne fremgangsmåde er i dissektion. Først er det vigtigt at fjerne laterale væv, samt højre og venstre kamre af thymus fra E12.5 eksplantaterne, da deres ekspansion i kultur hindrer en ordentlig udvikling af skjoldbruskkirtlen lapper. For det andet, hurtighed er også kritisk, hvis man ønsker at opretholde endotelceller i live. Hvis dissektion ikke udføres under en steril atmosfære, er det vigtigt at vaske flere gange eksplantater i sterilt dyrkningsmedium. Endelig, når dyrkning af eksplantater på semiporous filtre, er det vigtigt at anvende en lille mængde medium, og placere eksplantaterne på midten af filteret. For meget medium vil strømme til periferien af filteret og skabe en menisk med filtervæggen. I dette tilfælde vil eksplantatet følge mediet og når menisken; dens udvikling vil være i medium snarere end ved luft / medium-grænsefladen.
Mulige ændringer og begrænsninger
Den her beskrevne protokol gælder for E12.5 skjoldbruskkirtlen eksplanteret og E13.5 og E14.5 isolerede skjoldbruskkirtlen lapper. Yngre og ældre udviklingsstadier kan testes i funktion af det videnskabelige spørgsmål behandlet. Andre dyrkningsbetingelser kan også blive testet: skjoldbruskkirtlen eksplantater eller lapper kunne dyrkes i 3D matrigel, eller mediet kan suppleres med insulin / transferrin / Selen snarere end med 10% serum.
Et vigtigt aspekt af vævskultur er iltkoncentration. Når der dyrkes på mikroskopi plastik dias, er iltkoncentrationen svært at sætte pris på, da det vil falde med højden af mediet over eksplantaterne. Når der dyrkes på filtre på luft / medium-grænsefladen, eksplantater er i kontakt med atmosfæren, og derfor med 21% oxygen. I sidstnævnte tilfælde kan man forsøge at gengive den "hypoxisk" i livmoderen miljø ved hjælp af lavere pO 2-koncentrationen inde i inkubatoren.
Hvis tissular kompleksitet E12.5 eksplantater er en fordel for korrekt udvikling, er det også en stor ulempe, da epitelcellerne ikke er tilgængelige for virus eller transfektionsreagenser. Manipulation kan udføres med diffunderbare reagenser (inhibitorer, blokerende antistoffer, vækstfaktorer, cytokiner, konditioneret medium), holdening i betragtning, at det exogene forbindelsen påvirker alle celletyper. Desuden væv kompleksitet og den lille størrelse af lapperne i forhold til hele vævseksplantat (se figur 2A, højre panel), reducerer renheden af ekstrakterne (RNA eller protein) fremstillet.
Selv om de fleste af de data, der præsenteres i dette papir blev indhentet fra 4-5 dage dyrkede eksplantater, er det muligt at holde orglet i kultur i længere tid, op til 10 dage på plast, med en kontinuerlig udvikling af follikler (se figur 2B på dag 7). Hvis længere kulturer skal udføres, bør man kontrollere, at alle de celletyper, herunder endotelceller, overleve i eksplantaterne.
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende metoder eller andre alternative metoder
I forhold til kultur af rene populationer af thyrocytter i 2D retter eller 3D-matrices, dette organ dyrkningssystem viser fordelen ved at opretholde de naturlige og fysiologiske sammensætning af Mikrodissekterede fragmenter. Faktisk foruden thyrocytter og C-celler stamceller eksplantater indeholder mesenkymale og endotelceller såvel som ekstracellulære matrix. Som allerede demonstreret med spytkirtlerne, nyre, lunge eller bugspytkirtel, organkulturer pænt efterligne in vivo udvikling. Desuden giver det en måde til hurtigt at analysere og manipulere (gevinst eller tab af funktion) vildtype og knockout organer.
Fremtidige applikationer eller retninger efter mestre denne teknik
Dette papir viser, at de cellulære og molekylære aspekter af skjoldbruskkirtlen udvikling kan analyseres med et mikroskop eller ved RT-qPCR, in situ-hybridisering eller western blotting kan også udføres. Denne kultur system er modtagelig at vinde-og tab af funktion eksperimenter via tilsætning af specifik inhibitors, blokerende antistoffer, vækstfaktorer, cytokiner eller endda celler i dyrkningsmediet 7. Men alle de celletyper, der findes i væv påvirket. Det ville være interessant at udvikle virus-baserede celletypespecifik målretning.
Anvendelse af en fluorescerende reporter stamme, med et fluorescerende dissektionsmikroskop letter mikrodissektion af vævet stykke (figur 1F, indsat), men også som rapporteret af andre anvendelse af en membran-mærket fluorescerende protein 16, gør det muligt at udføre tidstro billeddannelse af udviklingen organ i 3D 15,16 eller til at følge en bestemt cellepopulation i kulturen. Udvikling af nye fluorescerende reporter stammer vil være nødvendigt omhyggeligt at visualisere morfogenetiske begivenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
References
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
