Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En Published: June 6, 2014 doi: 10.3791/51641
Automatic Translation
1, 1, *1, *1
1Pole of Cell Biology, Université catholique de Louvain & de Duve Institute
* These authors contributed equally

Abstract

Den skjoldbrusk er en bilobated endokrin kjertel lokalisert på bunnen av nakken, som produserer skjoldbrusk hormoner T3, T4, og kalsitonin. T3 og T4 er produsert av differensierte thyrocytes, organisert i lukkede områder som kalles follikler, mens calcitonin er syntetisert av C-celler, ispedd i mellom folliklene og et tett nettverk av blodkapillærer. Selv om voksen thyroid arkitektur og funksjoner har blitt omfattende beskrevet og undersøkt, er dannelsen av "angio-follikulære"-enheter, fordelingen av C-celler i parenchyma og parakrine kommunikasjon mellom epiteliale og endoteliale celler langt fra å bli forstått.

Denne metoden beskriver sekvensielle trinn av mus embryonale thyroid anlagen disseksjon og sin kultur på halvporøst filtre eller på mikros plast lysbilder. I løpet av en periode på fire dager, trofast sammenfatter dette kultursystem in vivo thyroid utvikling. Faktisk, (i) milliobation av organet skjer (for E12.5 eksplantater), (ii) thyrocytes forløpere organisere i folliklene og polariserer, (iii) thyrocytes og C-cellene differensieres, og (iv) endotel-cellene som er tilstede i microdissected vev spre seg, vandrer inn i thyroid fliker og tett forbinder med epitelceller, slik de gjør in vivo.

Skjoldbrusk vev kan fås fra villtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoer. Videre eksplantater kultur kan bli manipulert ved tilsetning av inhibitorer som blokkerer antistoffer, vekstfaktorer, eller til celler eller kondisjonerte medium. Ex vivo utvikling kan bli analysert i sanntid, eller når som helst av kulturen ved farging og RT-qPCR.

I konklusjonen, skjoldbrusk eksplantering kultur kombinert med nedstrøms hel-mount eller på strekninger bildebehandling og genuttrykk profilering gir et kraftig system for å manipulere og studere morphogenetic og differensiering hendelsene i skjoldbrusk organogenesis.

Introduction

Skjoldbruskkjertelen er en samling av uavhengige epitel sfærer, kalt follikler, omgitt av et tett nettverk av endothelial kapillærer. Denne organisasjonen lar thyroideafunksjonen: endothelial kapillærer gi thyrocytes med jod, som kreves for T3 og T4 hormon syntese, og distribuere disse sistnevnte til hele kroppen. Spredt i mellom folliklene og kapillærer, C-celler produsere hypocalcemic hormonet calcitonin en. Selv om voksen thyroid arkitektur og funksjoner er godt kjent, de cellulære og molekylære mekanismene som er involvert i skjoldbruskembryoutvikling (hårsekken dannelse og differensiering) er langt fra å bli forstått.

Under embryogenesen thyrocytes stamfar stammer som en fortykkelse (midtlinjen anlage) av ventral veggen av forutgående endoderm på embryonale dag (e) 8,5 i musen embryo, mens C-celler forfedre stammer på e11.5 som dråpeformede utvekster ( den ultimobranchial bodør) av fjerde svelget poser 2-6. Den midtlinjen knopp deretter løsner fra endoderm, utvides bilateralt for å smelte ved e13.5 med ultimobranchial legemer på hver side av luftrøret. Endelig thyrocytes organisere inn follikler og C-cellene differensieres.

Nåværende kunnskap om skjoldbruskdannelse kommer hovedsakelig fra histologisk analyse av faste vev, men de morphogenetic hendelser involvert i skjoldbruskdannelse er svært dynamisk og involvere kommunikasjon og samhandling mellom ulike celletyper og med den ekstracellulære matrise. Nyere arbeider har vist at thyrocyte progenitorer produsere høye nivåer av VEGF for å rekruttere endotelceller til å utvikle skjoldbruskkjertelen, og i sin tur rekruttert endotelceller fremme follicle dannelse og C-celler differensiering 7..

De fleste ex vivo studier på skjoldbruskkjertelen har blitt utført på isolerte voksne skjoldbrusk-avledet celler, dyrket enten på 2D vev kultur plast dønsker flere kvinner eller i 3D-matriser. Ved hjelp av disse typer kulturer, differensierte follikkelcellene enten forbli polarisert og organisert som follikler eller gjenanskaffe en 3D organisasjon 8-10. Men disse rene epitelceller, eksplanterte fra deres fysiologisk miljø, og dyrket i 2D, ignorerer interaksjon med ekstracellulære matriks, cytokiner, vekstfaktorer og med andre celletyper slik som endotel-celler, eller nerver som de normalt støter på in vivo. En veldig fin studie nylig beskrevet en differensiering protokoll av ES-celler i skjoldbrusk follikler ved hjelp av en endelig kultur skritt i 3D matrigel 11. Men disse 3D-kulturer mangler kontakt med andre celletyper.

Basert på tidligere kompetanse på bukspyttkjertel og spyttkjertler organ kultur 12-14, en metode for å dissekere mus embryonale thyroid anlagen og dyrking explants på halvporøst filtre eller på mikros plast lysbilder ble utviklet.

Nårarbeider med E12.5 embryo, den doble opprinnelsen til skjoldbrusk anlagen (midtlinjen anlage og de to laterale ultimobranchial organer) innførte microdissection av et stort fragment av vev. Dette inneholdt i luftrøret, men ikke i spiserøret, og forlenget fra svelg-bue arterier opp til arytenoid hevelse. Når dyrket på filtrene, strekker midtlinjen anlage lateralt på hver side av luftrøret, hvor de smelter sammen med den ultimobranchial organer for å danne de to thyroid fliker, fremdeles forbundet med en landtunge.

I kultur, epitelceller spre seg, organisere i folliklene og differensiere i thyrocytes og C-celler, avhengig av deres opprinnelse. Endotelceller som finnes i microdissected vev også spre seg og invadere skjoldbrusk lapper til slutt knytte tett med epitel follicular struktur, uavhengig av blodstrøm eller sirkulerende faktorer. Som utviklingen av eksplantater trofast sammenfatter in vivo utvikleling, er dette kultursystem optimalt å studere morfogenetiske og differensierings hendelser som skjer i løpet av thyroid utvikling.

Skjoldbrusk vev kan fås fra villtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoer, og kultur-systemet er mottagelig for tap-og gevinst-av-funksjon eksperimenter. Endelig kunne time-lapse avbildning av fluorescensmerkede skjoldbrusk explants på mikros plast retter utnyttes til å bedre undersøke kinetikk og kontinuitet i morphogenetic bevegelser som skjer in vivo. Time-lapse bildebehandling har allerede blitt brukt til å studere forgrening morfogenese i bukspyttkjertelen 15,16 eller ureteric knopp 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus ble hevet og behandlet i henhold til prinsippene i forsøksdyr vare på Universitetet Animal Welfare Committee. Alle prosedyrer og protokoller ble godkjent av denne komiteen.

En. Coating av Mikrosplast Kultur Chambers

MERK: Utfør alle de følgende trinnene under sterile forhold i en laminær hette. De to typer av belegg er funksjonelt ekvivalente.

  1. Coat plast kultur kamre med fibronektin en dag før isolering av skjoldbrusk vev:
    1. Fortynn sterile fibronektin til en 50 ug / ml endelig konsentrasjon i M199-medium supplert med 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 0,25 ug / ml Fungizone, og 2 mM glutamin 12.
    2. Dekk til brønnene med 200 pl av fortynnet fibronektin og inkuberes over natten i et 4 ° C kjøleskap.
    3. På dagen for disseksjon, aspirer fibronektin, skyll brønnene gang med M199 og legge til et minimum volum på 200 pl M199 supplert med antibiotika, glutamin og 10% føtalt kalveserum.
    4. La de belagte kamre i inkubatoren til den er klar til plate explants.
  2. Frakk plast kultur kamre med type I kollagen 2 time før isolering av skjoldbrusk vev:
    1. Fortynn steril type I-kollagen til en 50 ug / ml endelig konsentrasjon på 10 mM HCl. MERK: Hold kollagen stamløsning på is.
    2. Dekk til brønnene med 200 mL fortynnet typen kollagen og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur (RT).
    3. Aspirer den type I kollagen løsning, skylles brønnene en gang med M199 og legge til et minimum volum på 200 pl M199 supplert med antibiotika, glutamin og 10% føtalt kalveserum.
    4. La de belagte kamre i inkubatoren til den er klar til plate explants.

2. Disseksjon av Thyroid Anlagentechnik inneholder Vev (E12.5) eller Thyroid Lobes (e13.5-E14,5)

MERK: Bruk rene dissecting verktøy og Petri / kultur plater. De generelle trinn og snittene som er beskrevet nedenfor er de samme for E12.5 og E14.5 embryoer.

  1. Ofre for tidsbasert gravid hunnmus ved den ønskede embryonale (e) dag (fra E12.5 til E14.5) og fjerne livmoren ved hjelp av dissekere instrumenter.
  2. Plasser dissekert livmoren på en 10 cm plate inneholdende HBSS.
  3. Hold den ene ende av livmoren med pinsett og åpne livmoren med liten saks for å frigjøre progressivt alle embryoene.
  4. Separer embryoene fra morkaken med saks og overføre embryoene med sine extraembryonic membraner i en ny 10 cm plate som inneholder HBSS.
  5. Fjern plommesekken og amnion. MERK: Fra dette punktet, arbeide under en stereo med transilluminasjon nedenfra; økende forstørrelse med disseksjon trinn. Bruk wolfram nåler i glasskapillærer som dissekere verktøy.
  6. Ved hjelp av nålene somen kniv og gaffel, fjerne den øvre del av hodet, inklusive den øvre kjeve, og ørene (figur 1A, snitt langs a).
  7. Hold embryo på ryggen og fjerne først en ekstra bit av det nevrale røret (figur 1A, skåret langs b), så den nederste del av embryoet, like under den fremre bena og over hjertet (figur 1B).
  8. Overfør embryo skive inneholder tungen (for å orientere vevet) og nakkeregionen i en ny 10 cm plate som inneholder HBSS.
  9. Fjern det nevrale røret og vev posteriort for spiserøret / luftrøret (figur 1C, skåret langs en).
  10. Forsiktig seksjon vevet stykke langs begge sider av tungen (figur 1C, skåret langs b-og b ').
  11. Lokaliser spiserør og luftrør, i forlengelse av tungen, og dissekere bort tungen, slik at den arytenoid hevelse (figur 1D, skåret langs en), og vevet på both sider av spiserøret / luftrøret (figur 1D, klippe langs b og b ').
  12. Fjern spiserøret, og plasser luftrøret med sin ventral siden opp.
  13. Skjær bort de uønskede vev som thymus (figur 1E) og alle vev som ligger lateralt til svelg arch arteriene. For e13.5 eller E14.5 embryoer, visualisere skjoldbrusk fliker på hver side av luftrøret (figur 1F, røde stiplede linjer) og videre dissekere flikene fra luftrøret.
  14. Overfør den isolerte trachea E12.5 region, eller e13.5-E14.5 thyroid fliker inn i en 35 mm kultur-plate inneholdende forvarmede M199-medium supplert med antibiotika, glutamin og 10% føtalt kalveserum. Overfør eksplantater ved hjelp av en pre-fuktet filter tips på en P-200 micropipette. For E12.5 eksplantater, kuttet enden av spissen for å utvide åpningen. MERK: Rutinemessig, og hvis embryoer har samme genotype, utfør trinn 6 og 7 på alle embryoene, denn 9-11, og til slutt 12 & 13.

Tre. Plating og kultur av Thyroid explants

  1. Vask explants ved suksessiv overføring i tre brønner i en 24-brønners plate inneholdende 1 ml av forvarmede kulturmedium (= M199 supplert med antibiotika, glutamin og 10% kalvefosterserum).
  2. Plating av skjoldbrusk lapper på bestrøket mikros plast kultur kamre:
    1. Aspirer M199 kulturmedium fra de belagte kamre.
    2. Nøye, overføre skjoldbrusk explants i kulturen kammere med en mikropipette og filterspisser. Plasser en eksplantering i midten av hvert kammer.
    3. Fjerne overskytende medium og kulturen plasseres kammeret i en vevskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 2 timer for å la explants fester seg til matriksen.
    4. Tilsett 200 til 300 mL av forvarmede kulturmedium til hver brønn.
    5. Inkuber i langtidskultur i vevskultur-inkubator.
  3. Plating of luftrør region eller skjoldbrusk lapper på halvporøst filtre:
    1. Fyll antall brønner på en 24-brønns plate som kreves med 330 mL av forvarmede kulturmedium.
    2. Plasser filtre (f.eks 0,4 mikrometer Millipore filter) på mediet, ta vare å unngå fangst av luftbobler under kultur filter.
    3. Nøye, ved hjelp av en mikropipette og filtertips, overfører de skjoldbrusk explants med et minimalt volum av medium inn i sentrum av filtrene (maksimum 4/filter).
    4. Fjern overskudd av medium og plass ut explants med en wolfram nål.
    5. Inkuber i langtidskultur i vevskultur-inkubator. MERK: Endre kultur medium annenhver dag under laminær hette. Kultur explants opp til 7 dager.

4. Whole-mount Immunfluorescens Farging Protokoll for Thyroid explants

Løsne eksplantater dyrket på filtre (etter trinn 2 nedenfor) bruker wolfram nåler ellerfin pinsett og transfer i en 24-brønns plate for alle trinnene, med unntak av primær (trinn 5) og sekundære (trinn 7) antistoff inkubasjoner (96-brønners plate). For heft eksplantater dyrket på mikros plast kamre, utføre alle trinnene i kulturen kamre.

  1. Sug M199 kultur medium og fikse explant med iskald 4% Paraformaldehyde (PFA) for 20 min (500 mL i 24-brønn fatet og 300 mL i mikros lysbilder).
  2. Vask 2 x 10 minutter i Tris-bufret saltløsning med Triton (TBST, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) ved romtemperatur.
  3. Behandle eksplantater straks eller oppbevar ved -20 ° C. MERK: For langtidslagring ved -20 ° C, dehydrerer explants i metanol ved gradvis å øke metanolkonsentrasjon i TBST å nå 100% metanol. Når du er klar til å fortsette med farging (trinn 4), rehydrere explants ved gradvis å legge TBST til metanol.
  4. Erstatt TBST med den blokkerende løsning (10% normal geit serum i TBST) Og inkuberes på et hav-sag rocker i 30-60 min ved RT.
  5. Spe primær antistoff i blokkering løsning (100-200 mL per tilstand). Overfør "filter" eksplantater fra en 24-brønns plate i en 96-brønns plate. Inkuber explants med de primære antistoffer på et hav-sag rocker natten ved 4 ° C.
  6. Den neste dag, kast den primære antistoff løsning, overføre "filter" eksplantater tilbake i en 24-brønns plate, og vaske minst fem ganger med TBST på et hav-sag rocker for 45-60 min hver på RT.
  7. Fortynne sekundært antistoff (f.eks Goat anti-X-Alexa Fluor på 1:2,000 fortynning) i TBST inneholder 1% av normal geit serum og inkuber explants med denne fortynningen over natten på et hav-sag rocker ved 4 ° C og i mørket. For kjernekontrafarging, omfatter en mikrogram / ml av bis-Benzimide (Hoechst) sammen med det sekundære antistoff løsning.
  8. Den neste dag, kast den sekundære antistoff løsningen og vask 5x med TBST på et hav-sagrocker for 45-60 min hver på RT. Under vaskinger holde eksplantater i mørket.
  9. Utfør en ekstra vask i TBST forsiktig virvlende over natten ved 4 ° C i mørket.
  10. Postfix De immun eksplantater i 4% PFA ved 4 ° C i 10 min.
  11. Vask 2x 10 min med TBST.
  12. Overfør eksplantater enten gradvis i metanol 100% for langtidslagring ved -20 ° C, eller analysere umiddelbart. For explants dyrket på filtrene, og immunostained i en 24-brønns plate, overfører i en mikroskammer (f.eks LabTek eller Ibidi) med TBST eller bedre fluorescerende monteringsmedium før analyse med et multiphoton eller konfokal mikroskop.

5. Utvinning av RNA fra Thyroid

Arbeid i en RNase-fritt miljø. Derfor bruker nukleinsyre og nuklease gratis pipetter og rengjøre både benk og utstyr fra forurensninger og RNases. Denne protokollen er basert på fenol / kloroform, utføre det første skrittets (1 til 7) under en kjemisk hette.

  1. Homogen en skjoldbrusk eksplantering eller to thyroid fliker med 300 pl av RNA-ekstraksjon løsning ved hjelp av en engangs pistill i 1,5 ml rør. I mellom prøvene, vaske stampe i 2% SDS, så vann, deretter etanol.
  2. Legg ytterligere 100 ul RNA ekstraksjon løsning, vortex 10 sek og Inkuber ved RT i 10 min.
  3. Vortex i 30 sekunder og tilsett 20 ng av tRNA til hver prøve.
  4. Vortex i 1 min og tilsett 80 pl kloroform.
  5. Vortex kraftig i 30 sek, og inkuber i 15 min ved RT.
  6. Sentrifugering i 15 minutter ved 19,000 xg i et kjøleskap (4 ° C) sentrifuge.
  7. Overfør nøye fargeløs øvre vandige fase i et friskt rør inneholdende 20 ug glykogen som coprecipitant.
  8. Vortex og tilsett 200 ul av 100% isopropanol alkohol.
  9. Vortex kraftig i 15-30 sekunder og la RNA bunnfallet ved -20 ° C i 2-3 timer, eller ved -80 ° C i 1 time.
  10. Spinn 30 min ved 19 000xg ved 4 ° C, og fjerne supernatanten.
  11. Vask pelleten med 450 ul kald 75% etanol og vortex å løsne pelleten.
  12. Spin for 10 min på 19 000 xg ved 4 ° C, og eliminere supernatant.
  13. Tørk pellet under panseret for 5 min.
  14. Resuspender pelleten med 10 pl RNase-fritt vann, og inkuber i 10 min ved RT.
  15. Analyse RNA konsentrasjon, lagre ved -80 ° C eller reversere transkribere genekspresjonsanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Thyroid anlages (midtlinjen og UB, sammen med omkringliggende vev), og skjoldbrusk lobes er dissekert fra mus embryoer ved E12.5 og e13.5/e14.5, henholdsvis (figur 1). Etter en dag i kultur på filteret, er midtlinjen anlage synlig (figur 2A) som et langstrakt vev som strekker seg på toppen av luftrøret. Den danner progressivt to fliker på hver side av luftrøret. Hvis isolerte skjoldbrusk fliker (e13.5 eller E14.5) er kultivert, vil de utvide, gjennomgå morfogenese og epitelceller vil organisere inn makroskopisk synlige follikulære strukturer (Figur 2b).

Organization og polarisering av epitelceller, merket med E-cadherin, kan visualiseres ved ezrin immunolabeling (figur 3A). Ezrin-positive intracellulære strukturer gradvis, og i en samordnet måte, sikring med en stang av cellen som vil bli den apikale pol. I løpet av denne prosessen, endotelceller posisjoneretiv for PECAM sprer og organisere rundt utviklings follikler å danne angio-follikulære enheter (Figur 3B). For å kvantifisere differensiering av thyrocytes og C-celler, kan RNA isoleres fra de dyrkede thyroid fliker, og genekspresjon analysert ved RT-qPCR (figur 3C). Selv om ekspresjonen av thyroid transkripsjonsfaktor Nkx2.1 ikke endrer seg i løpet av kulturen, ekspresjon av thyrocyte spesifikk tyroglobulin og av C-celle-spesifikke calcitonin dramatisk økt, noe som indikerer funksjonelle differensiering.

Figur 1
Figur 1. Disseksjonsverktøyer skritt for å isolere thyroid fra E14.5 mus embryo. Snittene blir avbildet med gule stiplede linjer. (A) Den øvre del av hodet er fjernet av to snitt for å eksponere tungen. (B) NECk region er atskilt fra resten av kroppen ved seksjonering embryo under armene og over hjertet. (C) Å holde tungen (til) som en guide, fjerne nevralrøret (nt) og laterale vev og lemmer. (D) Den tunge, er arytenoid svelling (*) og i spiserøret / luftrøret perfekt justert. Først fjerner tungen og deretter vev lateral til spiserøret / luftrøret regionen. (E) Den skjoldbrusk lobes er delvis skjult av thymus (thym) som skal kastes. (F) Thyroid lobes er synlige på hver side av luftrøret (rød prikkete ovoids), eller bedre visualisert ved hjelp av fluorescerende reporter embryoer (Pax8-Cre, Rosa-stop-YFP; innfelt). Forkortelser:. Å (tunge), thym (thymus), tra (luftrør), * (arytenoid hevelse) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 2. Dissekert skjoldbrusk explants på filtrer og skjoldbrusk fliker på fibronektin pent utvikle ex vivo. (A) Fotografier av en E12.5 skjoldbrusk eksplantering kultivert for en, to og tre dager på halvporøst filter, ved luft medium grensesnitt. Thyroid epitelceller migrere bilateralt på hver side av luftrøret og danne to voksende thyroid fliker. (B) Lysfelt bilder på dag 1 og dag 2 av en E14.5 skjoldbrusk lobe dyrket på mikros plast kultur kamre. Legg merke til utvidelse og ombygging av epitel som til slutt danner store (20-100 mikrometer) follikler rundt dag 7. Gul stiplet linje markerer epiteliale periferien av skjoldbruskkjertelen. Scale barer, 100 mikrometer. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Folliculogenesis, angiogenese og differensiering av skjoldbruskkjertelen i kultur. Thyroid fliker ble dyrket i den angitte tid. (A) Faste vev ble hel-mount immunostained med antistoffer mot basolateral markør E-cadherin, og subapikal membran markør ezrin. Etter en dag i kultur, epitelceller i skjoldbruskkjertelen parenchyma presentere små ezrin-positive strukturer som svarer til intracellulære vesikler 7. Felles fusjon av vesikler fra tilstøtende celler vil danne små lumen på dag 2; deres progressive vekst, og organisering av de omkringliggende cellene rundt lumen vil avgrense pre-follikulære strukturer etter fire dager. Scale bar, 20 mikrometer. (B) Thyroid lObe immunostained med antistoffer mot blodplater og endotelceller celleadhesjonsmolekylet (PECAM) og ezrin. Follikler er omgitt av endothelial strukturer. Scale bar, 50 mikrometer. (C) RNA, hentet fra skjoldbrusk lapper, ble omvendt transkribert før kvantitativ PCR. Uttrykket av skjoldbrusktranskripsjonsfaktor Nkx2.1, og av to differensiering gener, tyreoglobulin og Calcitonin, ble målt ved hjelp av spesifikke primer parene. For å beregne den relative genekspresjon, ble ΔΔ Ct metode som brukes, ved hjelp av E-cadherin som referanse-genet og det siste tidspunkt for kulturen som 100%. Bildene i A og B er enkelt confocal optiske deler av hel-mount immunostained skjoldbrusk fliker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette notatet beskriver en metode for å dissekere og dyrking skjoldbrusk eksplantater (E12.5) eller lapper (E14.5) for å studere og bedre forstå de komplekse hendelser som fører til skjoldbruskdannelse. På grunn av den doble opprinnelsen av skjoldbrusk anlagen (midtlinjen anlage, og de to laterale ultimobranchial legemer), og deres lille størrelse, et fragment av E12.5 vev lokalisert rostral til svelg-bue arterier, og inneholdende i luftrøret, men ikke i spiserøret er microdissected. Som illustrert, i løpet av en periode på fire dager, trofast sammenfatter dette kultursystem in vivo thyroid utvikling siden: (i) midtlinjen anlage migrerer bilateralt og ekspanderer for å danne, med UB, to thyroid fliker er forbundet med en landtunge (figur 2A) , (ii) thyroid forløpere omstilling fra en masse av celler inn i folliklene og til slutt polariserer (figurene 2B og 3A), (iii) endotelceller til stede imicrodissected vev sprer, vandrer inn i skjoldbrusk lapper, og tett forbinder med epitelceller (Figur 3B), og (iv) thyrocytes og C-cellene differensiere kvalitativt (Figur 3C), som de gjør i vivo 7. Som disseksjon fysisk avbryter in utero utvikling og eksplantert vev har til å tilpasse seg til dyrkingsbetingelser er de morfologiske og differensiering arrangementer litt forsinket i forhold til in vivo-situasjonen.

Kritiske trinnene i protokollen

Det kritiske aspekt ved denne fremgangsmåte er i det disseksjon. Først er det viktig å fjerne side vev, samt høyre og venstre lobes av thymus kjertel fra E12.5 eksplantater, som deres ekspansjon i kultur hindre riktig utvikling av skjoldbrusk fliker. For det andre, er hurtighet også kritisk hvis man ønsker å opprettholde endothelialcellene i live. Hvis disseksjon ikke utføres under en steril atmosfære, er det viktig å vaske flere ganger explants i sterilt kulturmedium. Til slutt, når dyrkning explants på halvporøst filter, er det viktig å bruke et lite volum av mediet, og for å plassere explants på midten av filteret. For mye medium vil strømme til periferien av filter og skape en menisk med filterveggen. I dette tilfellet vil eksplantering følge medium og når menisken; dens utvikling vil være i medium heller enn ved luft / medium grensesnitt.

Mulige endringer og begrensninger

Protokollen er beskrevet her gjelder E12.5 skjoldbrusk eksplantater og til e13.5 og E14.5 isolerte skjoldbrusk fliker. Yngre og eldre utviklingsstadier kan bli testet i funksjon av det vitenskapelige spørsmålet adressert. Andre kultur forhold kan også testes: skjoldbrusk eksplantater eller lapper kunne dyrkes i 3D matrigel, eller mediet kan bli supplert med insulin / Transferrin / Selen snarere enn med 10% serum.

En viktig del av vev kultur er oksygenkonsentrasjonen. Når dyrket på mikrosplast slides, er oksygenkonsentrasjon er vanskelig å sette som det vil avta med høyden av medium over eksplantater. Når dyrket på filter, ved luft / medium grensesnitt, explants er i kontakt med atmosfæren, og dermed med 21% oksygen. I dette siste tilfellet, kan man prøve å gjenskape "hypoksisk" in utero miljø ved hjelp av lavere pO 2 konsentrasjon inne i inkubatoren.

Hvis tissular kompleksiteten i E12.5 eksplantater er en fordel for riktig utvikling, er det også en største ulempen som epitelceller er ikke tilgjengelige for virus eller transfeksjon reagenser. Manipulering kan utføres med diffusible reagenser (inhibitorer, blokkerer antistoffer, vekstfaktorer, cytokiner, klimaanlegg medium), holdeing i bakhodet at den eksogene sammensatte påvirker alle celletyper. Videre vev kompleksitet og den lille størrelsen av flikene i forhold til hele vevseksplantatet (se figur 2A, høyre panel), reduserer renheten av ekstraktene (RNA eller protein) fremstilt.

Selv om mesteparten av de data som presenteres i dette papir ble oppnådd fra 4-5 dager dyrkede eksplanter, er det mulig å holde organet i kultur i lengre tid, opptil 10 dager på plast, med en kontinuerlig utvikling av follikler (se figur 2B ved dag 7). Hvis lengre kulturer må utføres, må man kontrollere at alle celletyper, inkludert endotelceller, overleve i eksplantater.

Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende metoder og andre alternative fremgangsmåter

Sammenlignet med kultur av rene bestander av thyrocytes i 2D retter eller 3D Matrices, presenterer denne organkultur-system fordelen av å opprettholde den naturlige fysiologiske og sammensetningen av de microdissected fragmenter. Faktisk, i tillegg til thyrocytes og C-celler progenitorer, explants inneholder mesenchymale og endotelceller og ekstracellulær matriks. Som allerede demonstrert med spyttkjertlene, nyre, lunge eller bukspyttkjertel, orgel kulturer pent ligne in vivo utvikling. Dessuten gir det en måte å raskt analysere og manipulere (gevinst eller tap-av-funksjon) villtype og knockout organer.

Fremtidige søknader eller retninger etter å mestre denne teknikken

Dette dokumentet viser at de cellulære og molekylære aspekter av thyroid utvikling kan analyseres med et mikroskop eller ved RT-qPCR, in situ hybridisering, eller western blotting kan også utføres. Dette kultursystem er mottakelig for å få-og tap-av-funksjon eksperimenter via tilsetning av spesifikke inhibitors, blokkerende antistoffer, vekstfaktorer, cytokiner, eller til celler i kulturmediet 7.. Imidlertid blir alle celletypene som er tilstede i vevet påvirket. Det ville være interessant å utvikle virus-basert celle-type spesifikke målrettingen.

Bruken av et fluorescerende reporter belastning, med et fluorescerende disseksjonsmikroskop, letter mikrodisseksjon av vevet stykke (figur 1F, innfelt), men også, som rapportert av andre ved hjelp av en membran-merket fluorescerende protein 16, gjør det mulig å utføre sanntids avbilding av det fremkallende organ i 3D 15,16, eller for å følge en bestemt cellepopulasjon i kulturen. Utvikling av nye fluorescerende reporter stammer vil være nødvendig å nøye visual morphogenetic hendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile proxylab 80826
Collagen Type I, rat tail Millipore 08-115
Fibronectin from human plasma Invitrogen # 33010-018
M199 Invitrogen 31150-022
HBSS Invitrogen 14025-100
Tungsten wire Goodfellow LS237450
culture plate insert (12 mm diameter) Millipore PICM01250
GlycoBlue Invitrogen AM9516
E-cadherin BD Biosciences 610182 1/1,000
Ezrin Thermo Scientific MS-661-P1 1/400
PECAM BD Biosciences 550274 1/100
Hoechst Sigma B2261

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
  2. Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
  3. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
  4. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
  5. De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
  6. De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
  7. Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
  8. Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
  9. Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
  10. Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
  11. Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
  12. van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
  13. Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
  14. Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
  15. Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
  16. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
  17. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).

Tags

Cellular Biology Utvikling cellebiologi skjoldbruskkjertelen orgel kultur epitelial morphogenesis farging bildebehandling RNA
En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur system for å studere Thyroid Development
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delmarcelle, A. S., Villacorte, M.,… More

Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development. J. Vis. Exp. (88), e51641, doi:10.3791/51641 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter