斑马鱼成人肾脏是一个很好的系统,肾功能恢复及疾病的研究。这种研究的一个重要方面是肾结构和功能的评估。这个协议描述了可被实现来评估肾小管组成,并评估肾重吸收的数种方法。
斑马鱼模型已成为一个相关制度,研究肾脏发育,再生和疾病。两个胚胎和成年斑马鱼的肾脏组成的被称为肾功能单元,它是高度保守的和其他脊椎动物,包括哺乳动物。研究斑马鱼最近表明,两种截然不同的现象蒸腾成年后产生肾损害:第一,政府现时有肾,取代被破坏的肾小管上皮细胞内强大的再生;第二,全新的肾单位是肾脏祖细胞被称为neonephrogenesis的方法生产。相比之下,人类和其他哺乳动物似乎有只对肾上皮再生的能力有限。迄今,负责这些肾脏再生现象的机制仍然知之甚少。由于成年斑马鱼的肾脏进行肾两者上皮再生和neonephrogenesis,他们提供了一个出色的实验段digm研究这些事件。此外,还存在多种可用于描绘调节肾再生的细胞和分子机制的斑马鱼模型可用的遗传学和药理学工具。这种研究的一个重要方面是肾单位结构和功能的评价。这个协议描述了一组可被用来测量肾功能的组合物和测试肾功能在成年斑马鱼肾标记技术。因此,这些方法广泛适用于成年斑马鱼肾损伤的范例,其包括但不限于,nephrotoxicant接触途径或靶向的细胞死亡的基因的方法,例如硝基还原酶介导的细胞消融技术未来的表型特征。此外,这些方法可用于研究基因的扰动在成年肾的形成,并且也可应用在慢性疾病模型,以评估肾状态。
肾是一个复杂的器官,满足多种生理功能,在体外。肾脏最重要的功能是代谢废物的排泄,这个任务是与流体稳态的维持交织在一起。肾经过滤血液和尿液中形成,同时伴随调节血压,电解质水平和酸碱平衡执行这些作业。高度专门化的上皮细管称为肾作为肾1,2的基本功能单位。在成年脊椎动物,肾通常在组织周围的集中排水系统紧密盘绕的安排,从而使许多小管包装成相当小的器官。例如,每个人的肾脏可以含有超过100万个肾3。其它哺乳动物如小鼠具有的每肾4 8-10千肾单位的数量级。肾的复杂程度这些哺乳动物和其他VERT之间是不同的ebrates由于变化的总肾单位数量和它们的肾脏内建筑布局。脊椎动物物种形成发展过程中多达三个连续的肾脏结构和每个表单显示增加的复杂性有关肾禀赋和安排:前肾,中肾和后肾。最后的肾脏结构被保留作为成人的肾脏器官通常是中肾或后肾2。每个肾的形式,但是,有一个肾为主组成2。
肾单位是肾脏的主力,是沿着与代谢产物的分泌和再吸收负责血液过滤。肾单位是由上皮细胞的简单的管状结构,并有一个节段的组织,其中分化的上皮细胞的分离,高度专业化的域执行特定任务。在滤液流经肾单位的顺序,通常有三个主要部件,comprise每种单位:(1)肾小体,(2)近端,中间,和远段的小管,以及(3)集合管1。近端小管是负责的有机溶质,最主要的是葡萄糖和氨基酸1的重吸收。中间小管(或亨勒的循环)是盐和水调节1的主要场所。最后,微调的盐和其它离子发生在远曲小管和收集管,并通过内分泌系统1被高度调控。从那里,将滤液穿过输尿管和膀胱,最终离开身体作为废产物1。
肾功能的丧失可能源于多种原因,以防止正常肾单位的活动。发生这些原因肾脏发育, 如先天性缺陷,导致肾5,或导致对不同类型的损伤畸形(从遗传和environme过程中所产生NTAL的起源)。后天的伤害,大致分为急性肾损伤(AKI)或慢性肾损伤(CKD)。 AKI涉及的急剧丧失的肾功能,经常是局部缺血或毒素暴露6,7得到的。在哺乳动物中,肾上皮修复可能这种伤害8后,不少人AKI后表现出全面恢复肾功能。 70%的发病率范围6,7 -然而,AKI也与高发病率和死亡率已报道在宽30相关联。 CKD,与此相反,与肾功能而导致的年长期损害,通常具有纤维化8,9相关联的逐渐丧失有关。进一步,一个相互作用的AKI和CKD之间存在,作为其中之一可以易患个体的其他10-12。例如,那些谁从AKI遭受更易患慢性肾病,甚至死亡13。肾脏疾病的发病率,无论是在美国和世界各地,已经达到epide麦克风的比例和预计将上升,因为老年人口膨胀,因此有越来越多的需要确定再生医学干预肾14,15。
尽管AKI患者可以恢复的知识,它一直被认为肾为先天无再生能力的器官。这种传统的观点已经被大幅修订,近年来16。已经试验研究了肾损伤小鼠和大鼠急性肾损伤后表明,肾小管上皮细胞能够增殖和重建功能性肾单位17-20。虽然哺乳动物具有再生肾这个适应能力,也有明显的局限性和不适应性响应可以触发而导致肾脏纤维化和CKD 21。例如,最近的研究表明,在小鼠肾重复上皮细胞消融用减少的再生和肾纤维化,表明肾甲肝关联EA限制再生的阈值22。没有任何证据表明,成年哺乳动物的肾脏形成新的肾单位,以代替丢失或损坏的人,因此他们的破坏会导致永久性的肾赤字8,9。有趣的是,一些脊椎动物都用再生肾上皮细胞,并同时产生新的肾单位应对AKI,这个过程被称为neonephrogenesis或肾新生23。 Neonephrogenesis发生在毒素暴露或部分切除后的鱼,以及损伤模型历来包括金鱼24,25,罗非鱼26,滑板27,鳉28,以及最近的斑马鱼29,30。其中,斑马鱼提供了一个可行的遗传研究模型,发现负责肾脏再生的细胞和分子途径。
在这个视频中,我们演示了如何在成年斑马鱼标签肾段。知识肾解剖,分子特征的,和功能特点是使用斑马鱼成功的未来肾功能的研究是必不可少的。成年斑马鱼的肾脏是中肾的结构和本质上是不太复杂的肾单位数目及组织比成年哺乳动物,鸟类,爬行类31发现后肾结构上。然而,斑马鱼肾段组织类似于哺乳动物,以及在胚胎肾基于基因表达研究(31-35)被首次记载。斑马鱼胚胎肾含有线性小管,其中包括近曲小管(PCT),近端直细管(PST),远端早期(DE)和远侧末(DL)31-35( 图1)。斑马鱼成年肾具有相似的管状段30,31,36,37( 图1)。在PCT也可以识别由功能表型:上皮细胞中的百分比将结合荧光标记的葡聚糖化合物(10-70 kDa的大小),存在于该循环,这已在两个胚胎和成年斑马鱼的肾脏被用于由这些近端小管细胞38-41( 图1),以评估细胞内吞摄取。在斑马鱼和哺乳动物之间肾段的一个区别是,斑马鱼缺少一个中间细管,或汉勒30-37的环;因为在哺乳动物中这部分功能,以节约用水,和斑马鱼是一种淡水物种没有紧迫感,集中他们的尿液,这并不奇怪,斑马鱼缺乏这部分32,33。因此,整个肾单位组合物在很大程度上斑马鱼和哺乳动物肾32,33之间保守的。这些相似性已启用斑马鱼是一种有效的研究工具中的发育nephrogenesis 32-35,42调查肾脏表达的基因的功能和模拟多种肾脏疾病43,44,从而增加了对人的条件,可以大幅度列表使用调查斑马鱼45,46。
如今,成年斑马鱼的肾脏是一个有吸引力的模型肾脏再生的比较研究,由于其遗传可追踪性和技术资源可用来查询功能基因和信号通路在这一品种的扩大口感。几项研究已经使用了斑马鱼中肾调查再生的AKI 29,30,37后的机制。对于使用成年斑马鱼的肾脏持续AKI的研究,它必须有精致的方法来标记不同的肾单位区域和方法来调查肾功能。有几种方法,成人肾脏的分析已经改编自胚胎肾协议。腹膜内注射在成年斑马鱼荧光标记的葡聚糖的标签在中肾肾PCT的上皮经由内吞作用30,如在斑马鱼胚胎38-41( 图1)。此方法已被用于visualiz当近端小管重拾再吸收特性如下AKI,这使得对恢复生理功能30( 图1)1评估É。在肾近端小管的另一个特征是,上皮细胞在这个段具备刷状缘37,其示出了高浓度的内源性碱性磷酸酶活性。因此,近端上皮可以在视觉上,在成年斑马鱼肾使用被称为ELF-(酶标记的荧光),基于荧光的技术-97 47本地化。
在这里,我们描述了如何在成年斑马鱼的肾脏进行荧光葡聚糖的摄取测定法30,48,以便获得近端小管的功能评估,并映射该小管部分的尺寸和轮廓。接着,我们描述的技术来与荧光标记的碱性磷酸酶标记的成年肾近端小管区。第三,我们显示了第一次的RHOD胺标记的外源凝集素扁豆biflorus凝集素(DBA),它已被用作集合管在哺乳动物肾脏49一般标志,标志着成年斑马鱼肾远端小管。作为DBA的是互斥的碱性磷酸酶染色,这些标签提供了一种方法来区分广义泛近端与成年斑马鱼肾泛远端延伸。纵观两个整装和低温恒温组织切片这些荧光染料的实施,我们与相关的溶质转运蛋白基因,它唯一标识每个肾单位分段表达域这些标签。因此,该协议还包含了修改后的组织处理成人组织整体原位杂交(WISH)分析,根据我们的胚胎愿望协议50程序的指南。这些程序可以在各种组合使用( 图2)来记录形态和功能属性ö˚F成年斑马鱼肾肾。因此,这些协议可以应用于再生研究的其他肾疾病模型的表型特征,甚至用于学习形成的成年肾中。
这里,我们已经描述了方法,使肾段组件在成年斑马鱼的可视化。的荧光葡聚糖偶联物的注射使因这些近端小管细胞30,38的内吞属性优先厘标签。该方法能以极大的灵活性来执行,由于葡聚糖,可以用不同的荧光偶联物的一群得到的存在。此外,利用赖氨酸定影葡聚糖是一种特别方便的方法来标记的PCT段,作为二次标记的程序不是必需的。这使得能够相对直接的信号检测,并与许多其它的荧光标记,免疫标记,并且使用转基因报告线兼容。碱性磷酸酶标记也标志着近曲小管,与PCT的强反应性和稍弱的反应在PST。最后,DBA染色使远曲小管段,其中显示一个通道的标签aracteristic支形态。各种植物血凝素分子,其是非免疫来源的糖结合蛋白质,已被广泛使用,以区分哺乳动物肾段47。有趣的是,DBA在斑马鱼相关与远端小管段,因为它是用于在哺乳动物肾脏47马克集合管。
两者合计,这些方法可用于以不同的组合来记录的肾组成和功能。因为所有这些方法都可以在整个肾脏制剂中使用时,它们提供的工具来评估肾的结构和功能在整个器官而不完全依赖于使用的更费时,繁琐的方法, 例如,冰冻切片工作和免疫标记。但是,这种方法的文章中描述的污点是可行的冷冻切片。冷冻切片分析,产生的样本(相对于整个安装)是更适合进行免疫组化检测特定pepti宫,虽然当然这种类型的分析,需要适当的一级抗体的可用性。不幸的是在斑马鱼的动物模型工作的一个主要限制仍然是抗体的可用性较差。因而WISH仍然是最广泛使用的,也就是说 ,“去到”程序用于基因表达的分析。 WISH用BCIP,NBT,和/或INT基板反应,以产生紫色或红色的沉淀物是不与冷冻切片的荧光染色兼容。一个办法是调用使用荧光WISH检测,而进行了优化的斑马鱼胚胎样本,可以针对与成人肾脏的使用程序。这个视频文章中的方法的描述应允许进一步的实验与像荧光愿望,结合转基因斑马鱼线,让市民段标记报告,如绿色荧光蛋白或mCherry技术。可选地,所述方法在此描述可以变成与其他重要的染料, 如其他凝集素结合ð进行测试。因此,进一步的适应和扩张的这里所描述的方法可以被调用,以满足研究者的需求整装肾制剂和分析。
正因为如此,这些方法具有广泛的潜在实施与正在进行的再生研究斑马鱼模型以及在遗传性疾病模型。有创新的研究和治疗肾苦难的迫切需要。数以百万计的人患有某种形式的肾脏疾病,每年导致先天性,急性和/或慢性的原因受到影响。此外,肾脏病的患病率在全球不断攀升,使得这些疾病的全球公共健康问题[14,15]。在治疗如血液透析,由此可外接透析机的作用是排除代谢废物病人的血液,如果他们的肾脏不能发挥这种作用。不幸的是,这种干预有其局限性,因为持续的治疗是必要的生存。此外,患者最终需要肾移植,这可能需要数年领取一次,一个病人被放在等候名单。即使获得了肾移植,许多患者遭受不利影响的过程的结果,必须对付这些影响他们的生活休息。这些困难表现出严重的需要对新的治疗方法的发展,既有助于预防肾脏疾病,或可能增加组织再生8,16,52,53。给出了使用在生物医学实验室人类测试受试者的明显的伦理局限性,动物模型对于人类疾病的发病机理的研究,并为新的治疗药物的试验是必不可少的。作为它的解剖相似度和进化接近的结果,小鼠已经成为人类疾病45的最广泛使用的模型。然而,存在与该动物的某些限制,包括原理荷兰国际集团无法想象体内并完成大规模遗传筛选的实用性器官的发育。斑马鱼是一种相关的,有用的模式生物器官发育人类疾病45,46和建模的研究。在关于人类疾病,功能同系物的斑马鱼近70%的人类基因54,55存在。
最近的工作强调了斑马鱼的实用程序,用于肾脏研究31,37,56许多领域。再生和修复斑马鱼急性肾损伤后的研究表明,肾小管上皮再生和neonephrogenesis是出现和整个再生时间过程30,37重叠的两个过程。使用氨基糖苷类抗生素称为庆大霉素已用作通过该学习AKI的结果在成年斑马鱼29,30,37受伤的范例。过了大约两个星期的期限庆大霉素损伤后,近端tubulES再生,同时新的肾单位在整个器官29,30,37形成。在一般情况下,调节上皮再生的机制存在很大的争议。在维修过程中的一个提议的机制,有初始急性损伤事件后,通过脱落的死细胞进入管腔。接着,是一系列去分化,增殖和迁移的事件,在这之后的新细胞分化,再植受伤基底膜和恢复功能的损伤部位。可替代地,其它的研究表明,置换细胞源自驻留肾小管内的干细胞/祖细胞。至于neonephrogenesis的过程中,斑马鱼,细胞聚集物已经观察下面的AKI庆大霉素注射29,30。这些聚集体成熟后成下探到已经存在的小管29,30新的肾单位。 ,团结肾上皮再生和neonephr的共同点ogenesis是其庞大的神秘面纱因素:目前有关于这些再生的壮举是如何发生的比可用的见解指数更多的问题。
迄今为止,然而,一些证据励磁线支持的概念,即使用斑马鱼肾再生研究的确可以提供相关的比较分析上市人类AKI也可以具有直接平移潜在56-58。化学筛选,以确定小分子,增加在斑马鱼胚胎最近导致了组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的甲基- (苯硫基) -丁酸(m4PTB)56,57的识别肾脏祖细胞的增殖。这种化合物对斑马鱼幼虫用庆大霉素致急性肾损伤的政府透露,幼虫成活率增加,肾小管细胞增殖增强56,58。当小鼠中度缺血诱导的急性肾损伤是与m4PTB治疗,其恢复的副教授加快iation与增殖肾小管细胞58两个肾小管萎缩和细胞周期阻滞的减少。这些结果表明,负责正常斑马鱼肾发展和/或AKI的再生反应的途径将与哺乳动物56是保守的。
因此,尽管还需要进一步研究,以梳理出的再生,即机制,以确定所涉及的信号通路,并了解它们之间的相互作用,斑马鱼提供了一个可行的途径去追求,在肾脏病领域的这一重要目标。工具,如在该协议中描述的肾细胞标记代表一个组可以被用来评估在AKI模型肾组合物和功能测定法。此外,它们可应用于表征肾脏疾病的转基因模型,并且可以提供方法来鉴定能够肾坝后促进恢复肾结构的化学疗法年龄。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由下列资金,支持RAW:美国国立卫生研究院授予K01 DK083512,DP2 OD008470和R01 DK100237;出生缺陷基金会罗勒奥康纳入门学者补助金#5 FY12-75的;开始从科学与生物科学系的圣母院书院的大学资金;和丰盛的礼物,巴黎圣母院大学的伊丽莎白和迈克尔·加拉格尔代表加拉格尔家庭,以促进干细胞研究。该资助者在研究设计,数据收集和分析,发布的决定,或准备的稿子没有任何作用。我们感谢生物科学部的工作人员的鼎力支持,以及中心的斑马鱼研究在巴黎圣母院为他们在我们的斑马鱼群体的照顾和福利的杰出贡献。最后,我们要感谢我们的研究实验室的成员对这项工作的意见,进行讨论和见解。
1X Pbs | Made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
1X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs. | ||
1X Pbs with 0.05 % Tween | 0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs. | ||
Tween 20 | American Bioanalytical | AB02038 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
Fine Forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
Glass Slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
Glass Coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
Modeling Clay | Hasbro | Playdoh | Other modeling clays can be substituted and work similarly |
Slide Holder | Thermo-Fisher | 12-587 | Optional: cardboard tray to store slides flat |
Bleaching solution | Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 mL with distilled water |
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Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | |
Blocking solution | Blocking Solution (for a 10 mL solution): 8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 2 mL of fetal calf serum 150 μl of DMSO |
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Alkaline phosphatase activity detection | Invitrogen | E6601 | We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit. To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. |
Alkaline phosphatase wash solution | Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 5 mL of 0.5M EDTA 120 mg of Levamisole 95 mL of 1X PBS |
||
Dextran, fluorescein, 40,000 MW | Invitrogen | D1844 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, cascade blue, 10,000 MW | Invitrogen | D1976 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW | Invitrogen | D1825 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW | Invitrogen | D1817 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine | Vector laboratories | RL-10-32 | DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS |
Propidium iodide | Invitrogen | E6601 | |
DAPI | Invitrogen | P1304MP | |
Vectashield Hard Set Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
Micro cover glass | VWR | 48393081 | |
Dimethyl Sulfoxide, DMSO | American Bioanalytical | 67-68-5 | |
Sucrose | Sigma | S0289 | |
EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502 | |
Levamisole | Sigma | L-9756 | |
Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TFM-C | |
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm | Sakura Finetek | 4565 | |
TruBond 380 Adhesive Microscope Slides | Tru Scientific | 0380W | |
Liquid Blocker – Super PAP Pen | Electron Microscopy Sciences | 71312 | |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen Scientific | 240-9020-Z10 | |
Cryostat | Therm | Microm™ HM 525 Cryostat | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |
Compound microscope | Nikon | 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |