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Biology

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

doi: 10.3791/51644 Published: August 9, 2014

Summary

Der Zebrafisch adulten Niere ist ein ausgezeichnetes System für Nierenregeneration und Krankheit Studien. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Beurteilung der nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt mehrere Methoden, die implementiert werden, um Nephron Tubuli Zusammensetzung zu beurteilen und renale Reabsorption zu bewerten.

Abstract

Der Zebrafisch-Modell wurde als relevante System zu Nieren Entwicklung, Regeneration und Krankheit zu studieren entstanden. Sowohl die embryonalen und erwachsenen Zebrafisch Nieren von Funktionseinheiten wie Nephrone bekannt, die stark mit anderen Wirbeltieren, einschließlich Säugetieren konserviert sind zusammengesetzt. Forschung im Zebrafisch hat kürzlich gezeigt, dass zwei unterschiedliche Phänomene transpirieren nach Erwachsenen Nephrone Schaden nehmen: Erstens, es ist robust Regeneration im Rahmen der vorhandenen Nephrone, die die Epithelzellen zerstört Röhrchen ersetzt; Zweitens sind völlig neue Nephronen Nieren Vorläufern in einem als neonephrogenesis bekannt ist. Dagegen Menschen und anderen Säugern scheinen nur eine begrenzte Fähigkeit zur Nephron Epithelregeneration haben. Bis heute sind die Mechanismen für diese Phänomene Nierenregeneration verantwortlich bleiben kaum verstanden. Seit erwachsenen Zebrafisch Nieren unterziehen sowohl nephron epithelialen Regeneration und neonephrogenesis, bieten sie eine hervorragende experimentelle paraDIGM, um diese Ereignisse zu studieren. Weiterhin gibt es eine Vielzahl von genetischen und pharmakologische Werkzeuge im Zebrafischmodell, das verwendet werden kann, um die zellulären und molekularen Mechanismen, die die Nierenregeneration regulieren abzugrenzen. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Auswertung von Nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt einen Satz von Markierungstechniken, die verwendet werden können, um Nieren Zusammensetzung und Test Nephron Funktion im adulten Zebrafisch Nieren messen. Somit sind diese Verfahren weithin für die Zukunft phänotypische Charakterisierung von erwachsenen Zebrafisch Nierenschädigung Paradigmen, die umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, nephrotoxicant Belichtungssysteme oder genetische Methoden der gezielten Zelltod wie Nitroreduktase vermittelte Zell Ablation Technik. Ferner könnte diese Methoden verwendet werden, um genetische Störungen in der Erwachsenenbildung Nieren studieren und könnte auch angewendet, um Nierenstatus während chronische Krankheit Modellierung zu bewerten.

Introduction

Die Niere ist ein komplexes Organ, das eine Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper erfüllt. Der vorderste Funktion der Niere Stoffwechselausscheidung, und diese Aufgabe ist eng mit der Aufrechterhaltung der Homöostase Fluid verflochten. Die Niere führt diese Arbeitsplätze durch Filterung des Blutes und bilden Urin, während gleichzeitig die Regulierung des Blutdrucks, Elektrolyt-Niveau, und Säure-Basen-Gleichgewicht. Hoch spezialisierte Epithelzellen Tubuli genannt Nephronen dienen als Grundfunktionseinheit der Niere 1,2. Bei erwachsenen Wirbeltieren, sind Nephrone typischerweise in einer eng gewickelten Anordnung rund um eine zentrale Entwässerungssystem organisiert, so dass für viele Tubuli in das ziemlich kleine Orgel zu packen. Zum Beispiel kann jeder menschliche Niere über 1 Million Nephronen 3 enthalten. Andere Säugetiere wie die Maus besitzen in der Größenordnung von 8 bis 10.000 Nephrone pro Niere 4. Der Grad der Nieren Komplexität unterscheidet zwischen diesen Säugetieren und anderen vertebrates aufgrund von Variationen der Gesamtzahl Nephrons und ihre architektonische Gestaltung in der Niere. Wirbeltierarten bilden so viele wie drei aufeinander Nieren Strukturen während der Entwicklung, und jeder Form zeigt zunehmende Komplexität in Bezug auf Ausstattung und Anordnung nephron: die Vorniere, Urniere und Nachniere. Die letzte Nierenstruktur beibehalten werden dient als der adulten Niere Organ-Regel ein Mesonephros oder Metanephros 2. Jede Niere Form hat jedoch eine Nephron basierende Zusammensetzung 2.

Das Nephron ist das Arbeitspferd der Niere und ist für die Blutfiltration mit Metaboliten Sekretion und Resorption verantwortlich. Nephrone sind einfache röhrenförmige Strukturen aus Epithelzellen besteht und eine segmentale Organisation, in der diskreten, hoch spezialisierten Bereichen von differenzierten Epithelien besondere Aufgaben. In der Reihenfolge der Filtrat Fluss durch das Nephron, gibt es in der Regel drei Hauptteile, die comprise jede Einheit: (1) die Nierenkörperchen, (2) ein Röhrchen mit proximalen, mittleren und distalen Segmenten, und (3) ein Sammelkanal 1. Der proximale Tubulus ist für die Resorption von gelösten organischen Stoffen, insbesondere Glucose und Aminosäuren 1 verantwortlich. Die Zwischenröhrchen (oder der Henle-Schleife) ist ein wichtiger Standort von Salz und Wasserregulierung 1. Schließlich erfolgt eine Feinabstimmung von Salz und anderen Ionen im distalen Tubulus und Sammelrohr und wird von endokrinen Systems 1 geregelt. Von dort wandert das Filtrat durch den Harnleiter und Blase letztlich Verlassen des Körpers als Abfallprodukt 1.

Der Verlust der Nierenfunktion kann aus einer Vielzahl von Ursachen, die normale Aktivität Nephron verhindern stammen. Diese Ursachen können während der Nierenentwicklung, zB angeborene Defekte, die zur Fehlbildung der Nephrone 5, oder die Ursachen von verschiedenen Arten von Verletzungen führen (die sich aus sowohl genetische als auch environme auftretenNTAL Herkunft). Erworben Verletzungen werden allgemein als akute Nierenschädigung (AKI) oder chronischen Nierenversagen (CKD) kategorisiert. AKI beinhaltet einen abrupten Verlust der Nierenfunktion, die oft aus Ischämie oder Toxin Exposition 6,7 resultieren. Bei Säugetieren ist nephron epithelialen Reparatur möglich nach solchen Verletzungen 8, und viele Menschen zeigen volle Wiederherstellung der Nierenfunktion nach AKI. 70% Inzidenz Bereich 6,7 - ist jedoch auch AKI mit hoher Morbidität und Mortalität, die in einem breiten 30 berichtet wurde, verbunden. CKD dagegen mit fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion, die von Jahren anhalt Schäden, typischerweise mit 8,9 Fibrose assoziiert Ergebnisse gelten. Ferner besteht ein Wechselspiel zwischen AKI und CKD, entweder kann man eine individuelle auf die andere 10-12 prädisponieren. Zum Beispiel diejenigen, die von AKI gelitten haben, sind anfälliger für CKD und sogar zum Tod 13. Das Auftreten von Nierenerkrankungen, sowohl in den USA und weltweit, hat epide erreichtmic Proportionen und wird sich voraussichtlich steigen, da die Bevölkerung im Alter erweitert-so gibt es einen wachsenden Bedarf an regenerativen Medizin Interventionen für die Niere 14,15 identifizieren.

Trotz der Erkenntnis, dass AKI Patienten erholen kann, ist es schon lange gedacht, dass die Niere ist ein Organ, ohne angeborene regenerativen Kräfte. Dieses traditionelle Ansicht wurde in den letzten Jahren 16 überarbeitet. Studien, die Nierenschäden bei Mäusen und Ratten nach AKI haben gezeigt, dass Nephron Tubuli Epithelzellen vermehren und wieder aufzubauen funktionellen Nephronen 17-20. Obwohl Säugetiere besitzen diese Fähigkeit, adaptive Nephrone regenerieren, gibt es bemerkenswerte Einschränkungen und maladaptive Reaktionen ausgelöst werden, die zu Nierenfibrose und CKD 21 führen. Zum Beispiel eine aktuelle Studie gezeigt, dass wiederholte Epithelzellen Ablation in murinen Nephrone wurde mit verminderter Regeneration und Nierenfibrose-was darauf hindeutet, Nephrone hav verbundenea begrenzt Regenerationsschwelle 22. Es gibt keine Beweise dafür, dass der erwachsene Säugetierniere bildet neue Nephrone, um verlorene oder beschädigte zu ersetzen und damit deren Zerstörung führt zu einem permanenten Defizit 8,9 Nephrons. Interessanterweise haben einige Wirbeltiere zu reagieren AKI durch Regeneration nephron Epithelien und auch die Herstellung neuer Nephrone, bezeichnet ein Verfahren, das als neonephrogenesis oder nephron Neogenese 23. Neonephrogenesis tritt in Fisch nach Toxin Exposition oder teilweise Resektion und Verletzungen Modelle haben in der Vergangenheit waren die Goldfische 24,25, Tilapia 26, Skate-27, Medaka 28, und in jüngerer Zeit, der Zebrafisch 29,30. Von diesen Zebrafisch einen lebensfähigen genetischen Forschung Modell, um die zellulären und molekularen Signalwege für Nierenregeneration verantwortlich zu entdecken.

In diesem Video-Artikel zeigen wir, wie man Nephronsegmenten in erwachsenen Zebrafisch zu kennzeichnen. Kenntnisse der Nephron Anatomie, molekularen Eigenschaften,und funktionellen Eigenschaften sind wesentlich für eine erfolgreiche Zukunft Nieren Studien mit Zebrafisch. Die erwachsenen Zebrafisch ist eine Niere Mesonephros Struktur und ist von Natur aus weniger komplex in Bezug auf die Anzahl und die Organisation Nephron als der Metanephros Struktur in der Erwachsenen Säugetieren, Vögeln und Reptilien 31 gefunden. Jedoch Zebrafisch Nephron Segment Organisation analog Säugetieren und wurde zuerst in der embryonalen Nieren basierend auf Genexpressionsstudien 31-35 dokumentiert. Zebrafischembryo Nephrone enthalten lineare Röhrchen Segmente, die den proximalen Konvolut (PCT) enthalten, proximalen Tubulus gerade (PST), distalen früh (DE), und distalen Ende (DL) 31-35 (Abbildung 1). Zebrafisch Erwachsenen Nephrone besitzen ähnliche Rohrsegmente 30,31,36,37 (Abbildung 1). Die PCT kann auch von einem funktionellen Phänotyps identifiziert werden: Epithelzellen in der PCT fluoreszierend markiertes Dextran-Verbindungen (10-70 kDa groß) in der vorliegenden integrierenKreislauf, der sowohl in der embryonalen und erwachsenen Zebrafisch Niere eingesetzt worden ist, um endozytischen Aufnahme durch diesen proximalen Tubuluszellen 38-41 (Abbildung 1) zu bewerten. Ein Unterschied in Nephronsegmenten zwischen Zebrafisch und Säugetiere ist, dass Zebrafisch fehlt ein Zwischenröhrchen oder der Henle-Schleife 30-37; Seit diesem Segment Funktionen bei Säugetieren, Wasser zu sparen, und Zebrafisch sind ein Süßwasserarten ohne Dringlichkeit, ihren Urin zu konzentrieren, ist es nicht verwunderlich, dass Zebrafisch fehlt dieses Segment 32,33. Somit wird die Gesamt Nephron Zusammensetzung weitgehend zwischen dem Zebrafisch und Säugetierniere 32,33 konserviert. Diese Ähnlichkeiten haben Zebrafisch ermöglicht, eine effektive Forschungswerkzeug, um die Funktionen der Nieren exprimierten Gene während der Entwicklungs Nephrogenese 32-35,42 untersuchen und zahlreiche Nierenerkrankungen 43,44 modelliert, wodurch zusätzlich zu den wesentlichen Liste menschlicher Bedingungen sein kann untersucht mitZebrafisch 45,46.

Heute ist die erwachsenen Zebrafisch Niere ist ein attraktives Modell für vergleichende Studien der Nierenregeneration aufgrund seiner genetischen Lenkbarkeit und der Ausbau der technologischen Gaumen Ressourcen zur Verfügung zu Gen-Funktion und Signalwege in dieser Art zu verhören. Mehrere Studien haben die Zebrafisch-Mesonephros verwendet werden, um die Mechanismen der Regeneration nach AKI 29,30,37 zu untersuchen. Für die weitere Verwendung der AKI-Forschungs erwachsenen Zebrafisch Niere, ist es wichtig, exquisite Methoden, um verschiedene nephron Regionen und Methoden zu kennzeichnen, um nephron Funktionalität überblicken können. Mehrere Methoden für erwachsene Niere Analysen wurden aus embryonalen Nieren Protokolle angepasst. Intraperitoneale Injektion von Fluoreszenz-markierten Dextran im erwachsenen Zebrafisch bezeichnet die PCT-Epithel in Mesonephros Nephrone über Endozytose 30, wie in Zebrafischembryonen 38-41 (Abbildung 1). Diese Methode wurde verwendet, um visualize, wenn proximalen Tubuli wieder ihre resorbierbaren Eigentum folgenden AKI, die eine Beurteilung der physiologischen Funktion wiederhergestellt 30 (Abbildung 1) ermöglicht. Ein weiteres Merkmal des Nephrons proximalen Tubulus ist, dass die Epithelzellen in diesem Bereich besitzen einen Bürsten Grenze 37, die hohe endogene alkalische Phosphatase-Aktivität zeigt. Somit ist die proximale Epithel visuell im erwachsenen Zebrafisch Niere mit einem Fluoreszenz-basierten Technik, die als ELF (Enzym-markierten Fluoreszenz) bekannt -97 47 lokalisiert werden.

Hier beschreiben wir, wie man fluoreszierenden Dextran-Aufnahme-Assays 30,48 im erwachsenen Zebrafisch Niere durchzuführen, um so eine funktionelle Beurteilung des proximalen Tubulus zu erhalten und ordnen Sie die Größe und Konturen dieses Röhrchen-Segment. Als nächstes beschreiben wir Verfahren zum proximalen Tubulus Regionen des adulten Nephron mit dem Fluoreszenzmarker alkalische Phosphatase zu markieren. Drittens zeigen wir zum ersten Mal, dass die rhodAmin-markiertem Lektin Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA), die als allgemeiner Marker für die Sammelkanäle in der Säugetierniere 49 verwendet wurde, kennzeichnet den distalen Tubuli der Niere erwachsenen Zebrafisch. Als DBA sich gegenseitig aus der alkalischen Phosphatase-Färbung, diese Etiketten bieten eine Möglichkeit, im Großen und Ganzen unterscheiden gesamt proximalen gegenüber gesamt distalen Strecken des erwachsenen Zebrafisch Nephrons. Im Laufe der Umsetzung dieser fluoreszierenden Flecken sowohl ganze Berg und Kryostat histologischen Schnitten, korrelieren wir diese Etiketten mit Expressionsdomänen von gelösten Transportergene, die jedes Nephron Segment eindeutig zu identifizieren. Daher enthält dieses Protokoll auch eine Anleitung zu den veränderten Gewebeverarbeitungsverfahren für erwachsene Gewebe ganze Berg in-situ-Hybridisierung (WISH) Analyse auf der Grundlage unserer Embryo WISH Protokoll 50. Diese Verfahren können in verschiedenen Kombinationen (2), die zur morphologischen und funktionellen Eigenschaften zu dokumentieren of erwachsenen Zebrafisch Niere Nephrone. Somit können diese Protokolle Regenerationsstudien der phänotypischen Charakterisierung andere Nierenerkrankungen Modelle angewendet werden, und sogar zur Bildung von erwachsenen Niere zu untersuchen.

Protocol

Die Verfahren für die Arbeit mit in diesem Protokoll beschriebenen Zebrafisch wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Universität von Notre Dame genehmigt. Hinweis: Eine Anleitung zur Niere und Nephron Anatomie im Zebrafisch wird (Abbildung 1). Eine Übersicht über die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ist als Flussdiagramm (2) zu veranschaulichen, wie mehrere Markierungsverfahren können auf der gleichen Nierenprobe durchgeführt werden kann. Für Teil 7 auf WISH Vorbereitung auf das Erwachsenennieren Studien, die Schritte zeigen, wie hier vorgesehen, um die Verarbeitung von Zebrafischembryonen zu ändern, wie kürzlich veröffentlichte 50, um eine technische Anleitung für erfolgreiche WISH-Analyse der Niere Organ zu schaffen.

1. erwachsenen Zebrafisch intraperitoneale Injektion mit Dextran Sehenswürdigkeit

  1. Bereiten Sie die gewünschte fluoreszenzmarkierten Dextran Lager (n) durch Auflösen des Dextran-Pulver in destilliertem Wasser in einer Konzentrationvon 50 mg / ml, dann speichern Aliquots in Mikrozentrifugenröhrchen bei -20 º C im Dunkeln. Anmerkung: verschiedene fluoreszenzmarkierte Dextrane sind im Handel erhältlich. Wählen Sie das Dextran für den Einsatz auf der Grundlage der Kombination von anderen Labels, die gewünscht sind, und sicherzustellen, dass die geeigneten Fluoreszenzfilter sind mit den Mikroskopen, die genutzt werden soll. Lysin-fixierbar Dextrane zeigen Fluoreszenz ohne weitere Kennzeichnung Schritte in Lebendproben, nicht fixierten Gewebeprobe von eingeschläfert Proben und fixierten Proben.
  2. Tauen die gewünschte Dextran Lager und Lagerung auf Eis im Dunkeln während der Durchführung Schritte 1,3-1,5. Wickeln Sie das Mikrozentrifugenröhrchen in Aluminiumfolie vor Licht zu schützen, während die Handhabung.
  3. Betäuben einen erwachsenen Zebrafisch zwischen 5-7 Monaten in Alter, indem Sie den Fisch in eine Schale, die entweder 0,02% oder 0,001% Tricaine 2-Phenoxyethanol für ca. 1-2 min. Hinweis: Es ist besser, erwachsenen Zebrafisch von dieser Altersgruppe zu verwenden, weil jüngere Fische haben small Nieren, die schwer zu sezieren sind, und Nierenproben aus alten Fisch können Massen von Narbengewebe, die nicht analysiert werden können, enthalten. Wenn sie richtig betäubt, wird der erwachsenen Zebrafisch eine Antwort auf die Stimulation nicht zeigen, die durch mit einem Löffel oder stumpfe Sonde sanft berühren Sie die Schwanzflosse des Fisches getestet werden können, berühren.
  4. Mit einem Kunststofflöffel, heben Sie den Fisch aus dem Gericht, dekantiert die Lösung und setzt vorsichtig das Tier auf einem nassen Schwamm Schimmel, Bauchseite nach oben.
  5. Mit Hilfe eines 31 G 1,0 cc Insulinspritze injizieren 20 ul aufgetaut Dextran-Stammlösung in die intraperitoneale Raum. Ausrichten der Nadel, so daß das Einsetzen in einem flachen Winkel an der ventralen Mittellinie des Bauches auftritt. Um Stechen Organen zu vermeiden, legen Sie die Nadel dann leicht hochziehen, um so die Körperwand des Fisch heben und schaffen einen Raum, in dem das Dextran-Lösung 48 zu injizieren. Hinweis: Alternativ kann das Dextran Vorrat verdünnt werden, beispielsweise in einem Verhältnis von 1: 2 oder 2: 1 (Dextran: disdestilliertem Wasser), um die Hintergrundfluoreszenz in der Probe zu reduzieren.
  6. Sie vorsichtig die Fische in den Tank zurück, um aus der Narkose zu ermöglichen. Anmerkung: Die Aufnahme von Dextran durch die proximalen Tubulus Segment tritt in 8 - 12 Stunden und kann mindestens bis zu 3 Tage nach der Injektion (dpi) detektiert werden. Analyse bei 3 dpi bietet starke Röhrchen Signal mit niedriger Hintergrundfluoreszenz im Nieren Stroma-Populationen. Fahren Sie mit Teil 2 für ganze Berg Prüfung von Dextran-Aufnahme allein, wenn zusätzliche Kennzeichnung nicht erwünscht ist. Für kombinatorische Kennzeichnung, Teil 3 gehen, um das Gewebe für ganze Berg Prüfung von Dextran-Aufnahme, dann Teil 4 Doppel-Etikett mit alkalischer Phosphatase und / oder Teil 5 vorzubereiten, DBA doppelt oder drei-Kennzeichnung durchzuführen. Für die Forschung mit histologischen Schnitten, Teil 6 gehen für Anweisungen darüber, wie die Feinschnitte der Niere mit Hilfe eines Kryostaten und wie man diese mit verschiedenen Etiketten und / oder Immunhistochemie mit primären und sekundären ANTIB FleckOdies.

2. Dissection und Flach Berge Vorbereitung des erwachsenen Zebrafisch Niere von einer nicht fixierten Tier Beispiel fluoreszierende Dextran Kennzeichnung des proximalen Tubulus Visualisieren

  1. Einschläfern das Dextran injiziert erwachsenen Zebrafisch, indem Sie es in eine Schale mit 0,2% Tricaine pH-Wert 7,0 für 4 - 5 min. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Fisch, bevor Sie fortfahren eingeschläfert worden, durch Überwachung sorgfältig, ob die Kiemen haben Bewegung aufgehört und das Herz hat aufgehört zu schlagen 36.
  2. Mit einem Kunststofflöffel, heben Sie den Fisch aus dem Tricaine Lösung, dekantiert die Lösung und legen Sie das Tier auf einem Gewebe oder Papiertuch.
  3. Verwenden Sie ein scharfes Paar Dissektion Schere, einen Schnitt hinter dem Kiemenkiemendeckel machen und entfernen Sie den Kopf.
  4. Den Körper des Fisches mit den Dissektion Schere sofort zu öffnen, indem sie einen langen Bauchschnitt aus dem Kopf an der Basis der Schwanzflosse.
  5. Entfernen der inneren Organe der Fische mit einer feinen Pinzette.
  6. Verwenden Sie superfeinen Nadeln Dissektion, die Körperwände Pin offen ist, um die Visualisierung der Niere Orgel, die Anhänger der Hinterwand des Tieres zu ermöglichen.
  7. Verwenden feinen Pinzette, um die Niere von der dorsalen Wand zu lösen.
  8. Legen Sie vorsichtig die Niere in einen 5-ml-Glasfläschchen aus 1x PBS waschen und 3-mal mit 3-5 ml frischem 1X PBS für jeweils 5 min. Anmerkung: Die Verwendung einer Glasampulle für die Handhabung von erwachsenen Nierenproben erleichtert die Visualisierung des Gewebes und ermöglicht die Waschungen mit großen Mengen (bezogen auf die Gewebemasse) von ca. 3 - 5 Werk ml. Alternativ kann eine 12-Well-Zellkulturschale verwendet werden. Während ein Kunststoffzentrifugenröhrchen verwendet werden könnte, könnte die Standardgröße Rohre (1,5 ml) des Wasch beschränken.
  9. Entfernen Sie die Niere mit einer Transferpipette und Ort auf eine saubere Glasobjektträger mit 1-2 Tropfen 1X PBS.
  10. Verwenden feinen Pinzette, um die Niere auf der Folie zu glätten, so dass Sie sicher, dass kein Gewebe hat gewellt oder anderweitig aufgehobenauf sich. Hinweis: Alternativ kann ein Wolframdraht-Tool verwendet werden, um kleine Schnitte in die Bindegewebe bilden flache Positionierung der Niere zu erleichtern.
  11. Legen Sie kleine Stücke von Modelliermasse an jeder Ecke einer 18 x 18 mm Deckglas und langsam das Deckglas auf der Niere festgelegt. Anmerkung: Etwas Winkel der Deck während der Platzierung, zu minimieren Luftblasen in der Lösung 50. Die Knetmasse Divots etwa 2 mm im Durchmesser (2A). Alternativ können Einschläge von Vakuumfett anstelle von Knetmasse ersetzt werden. Fügen Sie einen zusätzlichen Tropfen 1X PBS, um den Raum zwischen dem Deckglas und Objektträger bei Bedarf zu füllen.
  12. Beobachten und / oder Bild die Niere, indem die Glasobjektträger in das Blickfeld auf einem Stereomikroskop oder zusammengesetzte Mikroskop mit dem entsprechenden Filter. Hinweis: Siehe 2A für makroskopische Erscheinungsbild dieses Präparat Figur.

3. Fixation, Dissection, Permeabilisierung und Entfernung der Pigmentierung der erwachsenen Zebrafisch Nieren

  1. Eine frische Fixierungslösung von 4% Paraformaldehyd (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO oder auftauen eine gefrorene Aliquot von 4% PFA / 1 X PBS und mit 0,1% DMSO. Achtung: PFA ist giftig und PFA-Lösungen sollten in einem Chemieabzug behandelt werden, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhen und Kittel. Darüber hinaus sollten die PFA-Pulver mit Vorsicht bei der Stammlösung behandelt werden.
  2. Füllen Sie eine Dissektion Tablett mit genügend Fixierungslösung, um die gesamte Tier einzutauchen.
  3. Einschläfern und montieren Sie die ausgewählten Zebrafisch in Fixierungslösung (siehe Schritte 2.2-2.6). Hinweis: Die ausgewählte Fisch kann eine unbehandelte Probe Zebrafisch Niere oder eine Niere von einem Zebrafisch, die zuvor eine intraperitoneale Injektion Dextran (Teil 1) erhielt isoliert werden.
  4. Befestigen Sie die Probe O / N (12-16 h) bei 4 o C
  5. Am folgenden Tag nutzen feinen Pinzette zu kümmernvollständig lösen die Niere von der dorsalen Körperwand und legen Sie die Orgel in einen Glaskolben mit einer Transferpipette. Hinweis: Alternativ kann auch eine 12-Well-oder 24-Well-Kulturschale verwendet werden. Während ein Kunststoffzentrifugenröhrchen verwendet werden könnte, könnte die Standardgröße Rohre (1,5 ml) des Wasch beschränken.
  6. 5 ml 1 × PBS mit 0,05% Tween für jeweils 5 min - 3 mal mit 3 Wasch sezierten Niere.
  7. Entfernen Sie den 1X PBS mit 0,05% Tween und spülen die Nieren mit 3 ml einer 5% igen Saccharose-Lösung (in 1X PBS) für 30 min.
  8. Ersetzen mit 3 ml 30% Saccharose-Lösung (in 1x PBS) und speichern O / N (12-16 h) bei 4 o C Hinweis: Die Saccharoselösungen permeabilisieren die zellulären Membranen, so dass anschließend spezifische Markierung von Reagenzien, wie sie das Gewebe durchdringen.
  9. Am folgenden Tag, entfernen Sie die 30% Saccharose-Lösung und waschen die Niere 2 mal mit 5 ml 1X PBS mit 0,05% Tween für jeweils 5 min.
  10. Ersetzen Sie den 1X PBS mit 0,05% Tween mit 3 -5 ml Bleichlösung, um die Melanozyten Pigmentierung auf die Niere Organ vorhanden entfernen.
  11. Zeigen Glasfläschchen auf einem Rotator und beobachten Sie, Pigmentierung verschwindet. Hinweis: Depigmentierung dauert in der Regel etwa 20 Minuten, wenn die nach der Behandlung durchgeführt Saccharose, aber gelegentlich kann so lange wie 60 Minuten dauern. Wenn der Bleichlösung auf die Niere zu lange bleibt, kann Zersetzung des Organs auftreten; es wird empfohlen, um die Probe zu überwachen alle 10-15 min auf Gewebeintegrität zu überprüfen.
  12. Wenn die Pigmentierung aus der Niere entfernt wurde, zweimal Waschen mit 3 - 5 Werk ml 1X PBS mit 0,05% Tween.
  13. Ersetzen Sie den 1X PBS mit 0,05% Tween mit 3-5 ml 4% PFA-Lösung für 1 h bei RT.
  14. Entfernen Sie die 4% PFA-Lösung und waschen die Niere 3-mal mit 3-5 ml 1X PBS mit 0,05% Tween für jeweils 5 min. HINWEIS: Nach Fixierung abgeschlossen ist, der Niere kann auch auf einen Glasobjektträger montiert und Dextran Aufnahme sans die Melanozyten pigm ausgewertet werdensentation, indem Sie die Schritte 2,8 bis 2,12.
  15. Entfernen Sie den 1X PBS mit 0,05% Tween und ersetzen mit 3-5 ml Blockierlösung, dann bebrüten die Niere bei RT in den Block 2 Stunden.
  16. Beim Blockieren abgeschlossen ist, gehen Sie direkt zu dem ausgewählten Färbungsprotokoll. Anmerkung: Die Niere kann nun durch eine oder mehrere andere Verfahren, um die Markierungsstudien mit verschiedenen Reagenzien durchzuführen verarbeitet werden. Für ganze Berg Kennzeichnung des proximalen Tubulus mit nur alkalische Phosphatase, § 4. Fahren Sie für ganze Berg Kennzeichnung nur der distalen Tubuli gehen Sie zu Abschnitt 5. Alternativ Abschnitte 4 und 5 können in linearer Abfolge für Dual-Detektion in ganze Berg durchgeführt werden .

4. Kennzeichnung der adulten Niere proximalen Tubulus Segmente mit alkalischer Phosphatase Erkennung

  1. Entfernen Sie den Block und waschen die Niere 3-mal mit 3-5 ml 1X PBS mit 0,05% Tween für jeweils 5 min, und ersetzen Sie dann die 1X PBS mit 0,05% Tween mit 3-5 ml1X PBS. Lassen Sie die Niere einweichen für mindestens 10 min. Anmerkung: Während dieser Zeit übertragen die Niere zu einer 12-Well-oder 24-Well-Kulturplatte, wenn das Gewebe in ein Glasfläschchen zur vorherigen Bearbeitungsschritten gehalten.
  2. Ersetzen Sie den 1X PBS mit der ausreichenden Arbeitsalkalischen Phosphatase-Substrat-Lösung (siehe Nachweis-Kit in der Tabelle der Materialien befindet), um die Probe zu bedecken, dann die Probe auf einem Rotator für 30 min bei RT. Halten Sie die Probe vor Licht geschützt.
  3. Die Reaktion durch Waschen der Niere in der alkalischen Phosphatase Waschpufferlösung.
  4. Spülen Sie die Niere mit 3 Änderungen der Waschpufferlösung über 10 - 15 min. Hinweis: Nach diesem Schritt gehen Sie direkt zu Teil 5, Schritt 5.1 (also vorübergehend Weglassen Schritte 4,5-4,6) Wird die Kennzeichnung mit DBA ist auch erwünscht. Optionaler Schritt: Um zu kennzeichnen und zu visualisieren Zellkerne in dem Organ, genießen die Niere in Propidiumiodidlösung. Bereiten Sie eine Propidiumiodid Lager durch Auflösen des Pulvers bei einer Concentration von 1 mg / ml (1,5 mM) in destilliertem Wasser. Von der Stamm bis 500 nm in 2X SSC und Inkubation die Niere in dieser Lösung für 30 min. Spülen Sie mit 1X PBS und gehen Sie zu Schritt 4.5.
  5. Entfernen Sie den Waschpuffer und montieren die Niere auf einen sauberen Glasobjektträger in der in der Kennzeichnung Kit enthalten Phosphatase Eindeckmedium (Siehe Schritt 2,9-2,12). Hinweis: Die Montage Medium die 1X PBS aus Schritt 2.9 ersetzt.
  6. Visualisieren Sie die alkalische Phosphatase gefärbt Niere mit einem Stereomikroskop oder zusammengesetzte Mikroskop mit einem Hoechst / DAPI-Filtersatz. Hinweis: Optionaler Schritt: Visualisieren Sie die Propidiumiodid mit einem Tetramethyl-Rhodamin (TRITC) oder Texas Rot-Filter.

5. Abgrenzung der adulten Niere distalen Tubulus Segmente mit Rhodamin DBA

  1. Vorbereiten einer 200 ul Arbeits DBA-Lösung durch Verdünnen DBA (2 mg / ml), 1: 100 in PBS 1X.
  2. Ersetzen Sie den 1X PBS mit 0,05% Tween-Lösung mit dem 200 ul DBA Lösung.
  3. Legen Sie auf Rotator für1 h bei RT.
  4. Entfernen Sie die DBA-Lösung und waschen die Niere 3-mal mit 3-5 ml 1X PBS für jeweils 5 min. Hinweis: Optionale Schritt: Um zu kennzeichnen und zu visualisieren Zellkerne in der Orgel zusammen mit der DBA-Label, genießen die Niere in DAPI-Lösung mit einem Hoechst / DAPI-Filter (Rhodamin DBA Fleck kann mit einem TRITC oder Texas Rot-Filter erkannt werden) zu erkennen. Bereiten Sie eine DAPI Lager durch Auflösen von Pulver in einer Konzentration von 5 mg / ml (14,3 mm). Von der Stamm 300 nM in 2X SSC und Inkubation die Niere in dieser Lösung für 20 min. Spülen Sie mit 1X PBS und gehen Sie zu Schritt 5.5. Wenn Teil 4 Verarbeitung durchgeführt wurde, im Auge behalten, die DAPI und alkalische Phosphatase sind beide mit einem Hoechst / DAPI-Filter erkannt.
  5. Entfernen Sie den 1X PBS und montieren die Niere auf einer sauberen Glasobjektträger (siehe Schritte 2,9-2,12).
  6. Visualisieren die DBA-gefärbten distalen Segmente der Niere mit einem Standard-TRITC oder Texas Rot-Filter auf einem Fluoreszenzstereomikroskop oder zusammengesetzte Mikroskop eingestellt. Hinweis: Optionale sTEP: Visualisieren Sie die DAPI mit einem Hoechst / DAPI-Filter.

6. Embedding, Kryoschneiden und Färbung (Vitalfarbstoffe und Immunhistochemie Labeling) von erwachsenen Zebrafisch Nierengewebe

  1. Wählen Fische für die Analyse, dann einschläfern, zu beheben, und permeabilisieren wie beschrieben (Schritte 3,2-3,8). Hinweis: Befestigen erwachsene Fische in 9: 1 Ethanol: Formaldehyd / 0,1% DMSO anstelle von 4% Paraformaldehyd / 1X PBS / 0,1% DMSO zu der Kryoschnitt Verfahren Abschnitten Dextran, alkalische Phosphatase und DBA Visualisierung zu erzeugen. Doch bedenken Sie, dass Para-basierten Fixierungen kann für einige Immunhistochemie kompatibel sein. Ferner wird ein Ausbleichen der adulten Niere nicht für Kryoschnitt Analyse erforderlich, da die Melanozyten sind oberflächlich und haben keinen Einfluss auf die Visualisierung von Nephron Zellen, die die "Innere" der Niere Organ umfassen.
  2. Am folgenden Tag, entfernen Sie die 30% Saccharose-Lösung und ersetzen mit 1: 1 Gewebegefriermedium: 30% SUCROSe für 4 h bei RT.
  3. Entfernen Sie den 1: 1-Lösung einbinden und Nierenproben in 100% Gewebe Gefriermedium in cryomolds und Ort bei -80 o C für mindestens 1 Stunde.
  4. Quer geschnitten Serienschnitte, etwa 12 um dick, durch die gesamte erwachsene Niere.
  5. Montieren gefrorenen Gefrierschnitte auf Haftobjektträgern und an der Luft trocknen für 1 h bei 50 ° C.
  6. Objektträger bei -80 o C bis zur Verwendung.
  7. Wenn Gefrierschnitte sind bereit, gekennzeichnet werden, entfernen Sie die Objektträger von -80 o C und auf Objektträger wärmer bei 50 o C für 45 min.
  8. Verwendung eines flüssigen Blocker Stift, ziehen Sie einen Kreis um die Gefrierschnitte und lassen für 15 Minuten auf der Folie trocken wärmer bei 50 o C.
  9. Objektträger aus der Folie wärmer und legen Wohnung in einer Feuchtkammer bei RT.
  10. Rehydrierung der Gefrierschnitten durch Zugabe von 1X PBS mit 0,05% Tween in die eingekreisten Teils der Objektträger 20 min. Anmerkung: Etwa 200 bis 300 &# 956, L benötigt, um jedes eingekreisten Abschnitts auf einer Folie zu bedecken.
  11. Ersetzen Sie den 1X PBS mit 0,05% Tween-Lösung mit frischem 1X PBS und Inkubation für 10 min.
  12. 1X PBS zu entfernen und Inkubation Gefrierschnitte in einer Blockierungslösung für 2 Stunden. Hinweis: Für einen 10-ml Blockierlösung, verbinden 8 ml 1X PBS mit 0,05% Tween, 2 ml fetales Kälberserum und 150 ul DMSO. Um Immunhistochemie nach dem Blockierungsschritt durchzuführen, bebrüten die Folie mit dem gewünschten primären Antikörper in frischen Block O verdünnt / N bei 4 ° C, einmal zu waschen mit 1X PBS mit 0,05% Tween, Inkubation für 2 h bei RT mit sekundärem Antikörperlösung verdünnt 1X PBS mit 0,05% Tween, einmal zu waschen mit 1X PBS mit 0,05% Tween, und montieren Sie ein Deckglas auf dem Objektträger mit Montagemedium. Die erforderlichen Antikörperverdünnungen variieren und Studien sollten durchgeführt, um die optimalen Verdünnungen zu wählen. Antigen-Retrieval können auch erleichtern Immunomarkierung und ist vor der Blockade durchgeführt. Unmittelbar nach Folien werden bei 50 o C aufgetaut(Schritt 6.8) brüten die Gefrierschnitten zwischen 95 o C-100 o C für 40 min im vorgeheizten 10 mM Natriumcitrat-Puffer. Kühlen Sie die Folien für 30 Minuten, dann waschen zweimal in 1X PBS mit 0,05% Tween, und fahren Sie mit Schritt 6.11.
  13. Entfernen Sie die Blockierungslösung und waschen Gefrierschnitte 3 mal mit 1X PBS für jeweils 5 min.
  14. Ersetzen 1X PBS mit DBA-Farblösung und Inkubation für 1 Stunde. Hinweis: Verdünnen Sie 1 ul DBA in 99 ul 1X PBS, um eine 100 ul Farblösung zu machen.
  15. Entfernen Sie die DBA-Färbelösung und waschen Gefrierschnitte 3 mal mit 1X PBS für jeweils 5 min.
  16. Gelten alkalische Phosphatase-Label und Inkubation auf Gefrierschnitte für 10 min.
  17. Waschen mit alkalischer Phosphatase aus dem Gefrierschnitte mit einer Reihe von 3 Wäschen mit Waschpuffer für jeweils 10 min. Hinweis: Eine 100 ml-Lösung von Waschpuffer, kombiniert mit 5 ml 0,5 M EDTA und 120 mg Levamisol in 95 ml 1X PBS. Um Kerne zu kennzeichnen, brüten die Abschnitte mit Propidiumiodid oder DAPI an der disungen zuvor erwähnt (Schritte 4.4, 5.4, jeweils) für 30 min bei RT. Wählen Sie eine Kernfärbung mit der Kombination von anderen fluoreszierenden Flecken, die ausgewählt wurden, kompatibel.
  18. Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus den Gefrierschnitten und Platz 2 Tropfen Eindeckmedium auf Objektträger.
  19. Vorsichtig Mikrodeckglas auf den Objektträger. Gefrierschnitte sind nun bereit, Bild mit dem entsprechenden Filter (n).

7. WISH Verarbeitung für erwachsenen Zebrafisch Nierenproben

  1. Wählen Sie die gewünschten Zebrafisch Probe (n), einschläfern, zu fixieren und zu sezieren die Niere wie beschrieben (Schritte 3.1-3.5). Hinweis: Es ist wichtig, eine Fixierungslösung von 4% Paraformaldehyd (PFA) verwenden / 1X PBS mit 0,1% DMSO die Niere zu permeabilisieren. Legen Sie die Niere in einen Glaskolben für eine einfache Visualisierung bei nachfolgenden Verarbeitungsschritten.
  2. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen zweimal die Niere mit 5 ml 1X PBST.
  3. Entfernen Sie den 1X PBS waschen und die Niere zweimal with von 100% Methanol, dann Inkubieren der Niere bei -20 ° C für mindestens 20 min permeabilisiert. Hinweis: Dissected Nieren können auf unbestimmte Zeit gespeichert werden -20 o C
  4. Rehydrieren der Niere durch Ausführen einer Serie von 5 min Waschen mit 3 - 5 Werk ml 50% Methanol / 1 × PBST, 30% Methanol / 1 × PBST und zweimal mit 1X PBST.
  5. Bleichen die Niere zu entfernen, Pigmentierung, wie beschrieben (Schritte 3,10-3,14).
  6. Behandeln Sie die Niere mit 10 ug / ml Proteinase K / 1X PBST mit 0,1% DMSO für 20 Minuten, dann zweimal gründlich mit 1X PBST und Post-fix in 4% PFA / 1X PBST für 20 min auf O / N. Hinweis: Immer bereiten die Proteinase K-Arbeitslösung unmittelbar vor Probenaufschluss durch die Kombination von 50 ul frisch aufgetaut Proteinase K stock (10 mg / ml), 50 ml 1X PBST, und 50 ul DMSO.
  7. Verarbeiten die Niere für Einzel-oder Doppel WISH folgenden Schritte für Riboprobe Synthese Prähybridisierung, Hybridisierung, anti-Digoxygenin / anti-Fluorescein Antikörper-Inkubation und UVEKtion wie kürzlich beschrieben 49. Hinweis: Ganze Berge Bildgebung von Nieren Flecken sollte innerhalb von einigen Tagen der Durchführung der Farbreaktion durchgeführt werden. Nephron Flecken neigen dazu, sehr schnell verblassen, vor allem rot Substrat Etiketten. Für nephron Fotografie, Flach montieren Nierenprobe, wie oben in den Schritten von 2,10 bis 2,12 beschrieben und Bild unter Verwendung eines Stereomikroskops oder Verbindung. Differential-Interferenz-Kontrast-Filter eingesetzt werden, um die zellulären Umrisse der Nephrone besser zu visualisieren, um Probenanalyse zu erleichtern.

Representative Results

Jedes der Protokolle wurde am Wildtyp-Zebrafisch durchgeführt. Beispiele für die Daten erhalten Dokument die normale strukturelle Zusammensetzung und Eigenschaften der Nephrone im gesunden erwachsenen Zebrafisch Niere. Der erwachsene Zebrafisch besitzt eine mesonephros oder zweiten Nierenform, die auf der dorsalen Körperwand (1A) befindet. Der erwachsene Niere ist relativ flach und enthält eine so genannte Kopf, Rumpf und Heckbereich mit oberflächlichen Melanozyten in diesen Regionen (Abbildung 1A) verstreut. Das Nierengewebe enthält verzweigte Arrays von Nephronen, die in den zentralen und Sammelkanäle (Abbildung 1A) verbinden abtropfen lassen. Jedes Nephron entlang ihrer Länge polarisiert sind, mit einem Blutfilter (oder Nierenkörperchens) an einem Ende, gefolgt von einer Reihe von Tubulus-Segmente, und schließlich endet an einem Kanal, der die Lösung, die ausgeschieden werden (1A) sammelt. Jeder Erwachsene nephron Röhrchen enthält proximalen und distalen SegmentierungTs-Zellen durch die Expression von spezifischen gelösten Transport 30,31,36,37, welche mit der Segmentmuster von embryonalen Nephronen 31-35 (1B) zeigte konserviert ist begrenzt. Zum Beispiel Cubilin Transkripte markieren den proximalen Tubulus 39 (PCT und PST) und clcnk Transkripte markieren den distalen Tubuli 32 (DE und DL) (Abbildung 1B). Ferner ist die PCT-Segment durch Expression slc20a1a unterscheiden, ist die PST unterschieden durch Expression slc13a1 wird die DE durch Expression von SLC12A1 unterscheiden, und die DL wird durch Expression von SLC12A3 32 unterschieden   (1B). Unterschiede zwischen Erwachsenen Nephron Tubuli im Vergleich zu embryonalen diejenigen sind, dass das distale Segmente anzuzeigen Windungen (DE, DL) und die DL-Segment Niederlassungen ausführlich in der Erwachsenen, die sich von der linearen, nicht-verzweigte Anatomie dieser Regionen in der embr istyo 30,31,36,37 (Abbildung 1A). In beiden Erwachsene 30 und embryonalen 38-41 Nephron Tubuli kann das PCT Epithel aufgrund seiner endocytic Eigenschaften aus und kann visualisiert und für reabsorptive Funktion basierend auf der Fähigkeit, fluoreszierenden Dextran-Konjugate (1B-Aufnahme) beurteilt werden. Ferner ist, wie in den nachfolgenden Figuren, die Erwachsenen proximalen Tubulus (PCT und PST oder pan-proximalen Region) nachgewiesen wird durch alkalische Phosphatase markiert ist, während die distalen Tubulus (DE und DL oder gesamt distalen Bereich) durch DBA markierten (1B). Die Verwendung von Dextran-Aufnahme, alkalische Phosphatase, DBA, Immunhistochemie oder WISH hierin Label erwachsenen Zebrafisch Nephronsegmenten verwendeten Methoden können in verschiedenen Kombinationen durchgeführt werden, oder ganze Berg mit histologischen Schnitten von Nierengewebe (Abbildung 2). Dies ermöglicht eine hohe Flexibilität und Vielfalt bei der Zusammensetzung auf nephron beurteilt werden (Abbildung 2).

Der erwachsene Niere kann flach auf einem Glasobjektträger für die Analyse montiert werden, mit Einschläge von Modelliermasse (oder alternativ, Vakuumfett) verwendet werden, um das Deckglas über das Gewebe (3A) auszusetzen. Wie der typische Nierenlänge ist ungefähr 5-7 mm, hat es eine Größe förderlich Abbildung auf eine Stereoanlage oder zusammengesetzte Mikroskop (Abbildung 3A). Unter Hellfeldbeleuchtung kann eine oberflächliche Population von Melanozyten schwarz pigmentiert in Verbindung mit dem Nierengewebe und Gefäße sichtbar gemacht werden, wie der Aorta, kann gesehen werden, da die zirkulierenden Erythrozyten mit einem roten Farbton (3B). Nach intraperitoneale Injektion von Dextran-FITC wurden PCT-Domänen in den Mesonephros liegt noch 3 Tage später beschriftet und bebildert mit einem FITC-Filter auf einem Fluoreszenzmikroskop (3C). Während Melanozyten teilweise verdecken die Visualisierung einzelner Nierentubuli (FiguWieder 3c '), werden die Melanozyten nicht verhindern Quantifizierung Nephron Nummer oder die Bewertung der Tubulus Durchmesser und Länge. Nach intraperitonealer Injektion von Dextran Fluor-Rubin, Bleichen der festen Probe entfernt die Melanozyten Pigmentierung und PCT-Segmente wurden mit Hellfeld-Beleuchtung alleine (3D) beobachtet. Lipidtröpfchen aus der Bauchhöhle Körper kann manchmal in Verbindung mit Niere ganze Organpräparaten (3A) .Individuelle PCT Segmente gesehen zeigen Windungen Spulen (3D), sondern auch durch relativ lineare Abschnitte (3D ") charakterisiert werden.

Dextran-Konjugate bereitgestellt verschiedenen Ebenen der Übersichtlichkeit in proximalen Tubulus Kennzeichnung. Insbesondere, Dextran-FITC oder Dextran Fluor-Rubin führte zu nephron Etiketten mit minimalen Hintergrund (3C-D ") knackig. Sowohl das Dextran Kaskade blue und Lucifer Yellow Konjugate zeigten proximalen Tubulus-Aufnahme in der adulten Niere (4A, 4B). Interessant ist, dass Nieren, Dextran Kaskade blau ausgesetzt waren, zeigten relativ spezifisch PCT Fluoreszenz mit etwas Hintergrund (4A, 4A '), während Nieren Dextran Lucifer Yellow ausgesetzt hatte PCT Segmente ganz in beschrifteten, zeigte aber spürbar Hintergrundsignal, mit nicht-spezifischen Fluoreszenzfärbung vorhanden Die renale Stroma oder der Raum zwischen den Nephronen (4B, 4B '). Schließlich ist die Verwendung von Dextran-Fluor Rubin überlegene proximalen Tubulus Kennzeichnung, mit minimalen oder keinen Hintergrund, auch wenn bei einer Reihe von unterschiedlichen Vergrößerungen (4C, 4C ') angesehen. In allen Fällen, die markante Rohr Muster von Dextran-Konjugat-Aufnahme mit dem Wunsch Ausdruck von Transkripten slc20a1a, eine etablierte PCT-spezifischer Marker 30-32 (4D) kodiert, korreliert. NephrPCT-Segmente mit slc20a1a Antisense-Ribosonde gefärbten angezeigt S-förmigen PCT Spulen sowie weniger stark aufgewickelt PCT Segmente (4D), während markiertes Dextran-Konjugat-Assays (3D beobachtet "3D").

Andere Nieren Zubereitungen, wie Detektion des proximalen Tubulus der alkalischen Phosphatase-Aktivität (5A, 5B, 5C) wurden in ähnlicher Weise nach der Entfernung der Pigmentierung Melanocyten durchgeführt. Dies ermöglichte proximalen Tubulus nephron Abbildung und Analyse ohne Behinderung. Endogene alkalische Phosphatase Reaktivität im Nephron ist eine Hauptmerkmal des proximalen Tubulus 1,47. Alkalische Phosphatase-Färbung ist hochspezifisch für proximale Nephron Regionen im Vergleich zu dem gesamt proximalen WISH Expressionsmuster des Gens Cubilin 39 (5D, 5D). Alkalische Phosphatase Reaktivität war am intensivsten in der Tannest Abschnitt des proximalen Tubulus, der dem PCT (5B) ähnlich dem Muster der Cubilin Ausdruck (5D, 5D), die sich auch höchste relative Transkriptionsniveaus in der PCT entspricht. Der PCT wurde durch seine geringfügig größeren Durchmesser, spezifische Expression des Transkriptionsfaktors mafba (5E, 5E), und spezifische Expression des gelösten Transportergens slc20a1a (4D, 4D ') unterschieden. Alkalische Phosphatase Reaktivität ebenfalls markiert eine Strecke von proximalen Tubulus mit einem dünneren Durchmesser, der dem PST-Segment (5B) basierend auf dem Vergleich mit dem Segment-spezifische Transkript die Expression des Transportergens gelösten slc13a1 (5F, 5F ') entspricht. Der Wunsch Ausdruck Domänen des PCT Marker slc20a1a und PST Marker slc13a1 sich gegenseitig aus (5G Cubilin (schwarz Pfeilspitzen in. 5G ", 5G", 5G "' ).

Um das Verhältnis der alkalischen Phosphatase-Reaktivität mit proximalen Tubulus Identität bestätigen weiterhin, whole mount Co-Kennzeichnung der alkalischen Phosphatase-Färbung wurde auf Nieren von Zebrafischen, die eine intraperitoneale Injektion von Dextran Fluor-rubin 3 Tage vor (6A-C) empfangen geführt. Dextran Fluor-Rubin zeigte Überlappung mit alkalischer Phosphatase in nur dem Abschnitt des proximalen Tubulus-Domäne, die auf die PCT (Beispiele in 6D-I) entspricht breiteren Durchmesser. Das Dextran-positive Domäne abrupt an der Stelle, wo der Durchmesser des proximalen Tubulus ausgedünnt, das heißt, wo der PCT und PST erfüllt (weißer Pfeil gestopptKöpfe in Figur 6) und nur die Reaktivität der alkalischen Phosphatase wurde in der nachfolgenden PST Segment (Beispiele in 6D-I) beobachtet. Hintergrundfluoreszenz von der alkalischen Phosphatase-Reaktion auch schwach das Paar von parallelen Hauptsammelkanal Spuren im erwachsenen Niere umrissen 29,30 -ducts, die sich durch den breitesten Durchmesser von jedem assoziierten Nierenrohr (Sternchen in 6A, 6D auszeichnen, 6E, 6G, 6H). Als nächstes wurde die Co-Kennzeichnung Nephron Tubuli mit alkalischer Phosphatase und Dextran-Aufnahme in Kryoschnittes Analyse beobachtet (6J Tubulus Umfänge mit weißen Punkten beschrieben). Im Querschnitt, wurde die alkalische Phosphatase-Reaktivität in einem dicken Band an der apikalen Oberfläche der röhrenförmigen Epithels, die mit Bürstensaum Ultra erwähnt, während die entsprechenden rohrförmigen Zelle cytosolischen Raum zeigte Dextran Fluor-Rubin Reaktivität (6J). Bemerkenswert ist, Stained Tubuli waren entweder doppelt positiv für alkalische Phosphatase und Dextran, die zu ihrer Identifizierung als PCT Segmente oder einzeln positiv für alkalische Phosphatase (6J, Röhrchen Umfang in gelben Punkten umrissen), was zu einer Identifikation als PST-Segment (Anmerkung: Andere Tubuli vorhanden waren negativ für beide Flecken, Daten nicht gezeigt) (6J). Ferner wurde die alkalische Phosphatase-Färbung (6K) erfolgreich mit einem Kern Etikett, Propidiumiodid (Abbildung 6L), die Erleichterung Zellzählung (Überlagerung in Abbildung 6 M) kombiniert.

Die distalen Tubulus der erwachsenen Zebrafisch Nephron wurde mit Rhodamin-konjugiertem DBA (7) gekennzeichnet. Ganze Berge Doppelmarkierung mit DBA und alkalischen Phosphatase wurde auf die Nieren aus Wildtyp-Zebrafisch (7A-C) durchgeführt. DBA und alkalische Phosphatase Reaktivität zeigte keine Überschneidungen in Nephron Tubuli ( 7G, 7H, 7J), wohingegen Verzweigung wurde nie in Röhrchen Segmente mit alkalischer Phosphatase gefärbt beobachtet. (: Enpep: eGFP Tg) sowohl den proximalen und distalen Tubuli Nephron 51 (Figur 7I), wie GFP Etiketten Nierengefrierschnitte wurden aus Wildtyp-Zebrafisch, die ein Transgen, in der der Promotor die enpep eGFP tragen gesammelt. Die Immunhistochemie wurde durchgeführt, um GFP erkennen, so wie alle von den Nierentubuli (grün, 7I) LABEL zu, gefolgt von Fluoreszenzmarkierung mit alkalischer Phosphatase und DBA (türkis und rot, jeweils 7I). Analyse Tubulus Abschnitte zeigten, dass Tubuli entweder positiv für alkalische Phosphatase oder DBA, aber nicht beide Etiketten (7I). Nur selten BadewanneModule zeigten Reaktivität weder mit der alkalischen Phosphatase-Färbung noch DBA, möglicherweise aufgrund des Winkels des Röhrchens Abschnitt (weißer Pfeil, 7I). Ferner wurde erfolgreich in DBA-Färbung gesamte Niere Färbung mit dem Kern Label DAPI (7J) montieren kombiniert, betont wieder die charakteristische verzweigte Natur der distalen Tubulus Segmente (weiße Pfeilspitzen, 7J).

Weiter, weiter Vergleichen der Muster von Dextran-FITC-Aufnahme, alkalische Phosphatase und DBA wurde dreifach Markierung durch intraperitoneale Injektion von erwachsenen Zebrafisch mit Dextran-FITC sucht, gefolgt von Nieren Trennung 3 Tage später gefolgt von Kryoschneiden und Färbung für alkalische Phosphatase und DBA (Beispiele in 8A-E zur Verfügung gestellt). Nierentubuli zeigten drei Kategorien von Label-Kombinationen: Tubuli, die für die alkalische Phosphatase und Dextran bezeichnet PCT Segmente (weiß gepunktete Linien), Tubul Doppel positiv warenes positiv für alkalische Phosphatase allein bezeichnet PST Segmente (gelb gestrichelte Linien) und distalen Tubuli wurden von DBA nur markiert (rot gestrichelten Konturen 8A-E). Ferner zeigte nur DBA positive Tubuli Verzweigungspunkte (8E). Von WISH-Analyse, dieses markante Verzweigungsmuster des distalen, DBA positive Tubuli mit den Gen-Expressionsmuster des gelösten Stoffes Transporter Transkripte, die spezifisch für distalen Tubuli Segmente (8F-I) sind korreliert. Transkripte clcnk, die den gesamten distalen Tubuli (DE und DL) markiert kodiert waren dünn im Durchmesser, reichlich in der Niere, und enthielt Verzweigungspunkte (schwarze Pfeilspitze 8F, 8F). Im Vergleich Röhrchen Segmente, die die Expression von SLC12A1 oder SLC12A3, die Marker der DE und DL sind zeigten jeweils insgesamt im Vergleich zum Ausdruck clcnk (vergleiche Abbildung 8 waren weniger reichlich in Nierenproben G und 8F, 8H). Ferner Röhrchen Segmente, die SLC12A1 ausgedrückt waren selten, wenn überhaupt, verzweigte (8G, 8G '), während Röhrchen Regionen, die SLC12A3 ausgedrückt wurden häufig in charakteristischen Windrad artige Anordnungen (8H, 8H verzweigt ", 8H", 8H "' , schwarz Pfeilspitzen). Schließlich Doppel Wunsch für die PCT-Marker slc20a1a und der distalen Marker clcnk zeigten, dass diese Flecken nicht überlappend (8i). Bemerkenswert ist, wurden die Strecken von slc20a1a exprimierenden PCT Segmente nicht angebracht zu exprimierenden Tubuli, die erwartet wurde, da die PST wird zwischen diesen Regionen (Abbildung 8I) gelegen clcnk. Zusammengenommen zeigen die Tests der Kennzeichnung Nierentubuli mit Dextran-Aufnahme, alkalische Phosphatase Reaktivität, DBA, und wünschen für das spezifische Gen-Transkripte, ermöglicht die Unterscheidung der proximalen gegenüber distalen Segmenten.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Abbildung 1. Nephron Anatomie im erwachsenen Zebrafisch Niere. Schematische Zeichnungen der (A) erwachsenen Zebrafisch Nieren-und (B) eine Vergleichstabelle der Segment molekularen Eigenschaften von adulten und embryonalen Zebrafisch Nephrone ausgestellt. (A) (links oben) der adulten Niere ist eine flache Orgel auf der dorsalen Körperwand. (Oben rechts), wenn von einer ventralen Perspektive betrachtet, die Niere hat eine charakteristische geschwungene Morphologie, bestehend aus Kopf, Rumpf und Schwanz Regionen und hat auch eine Oberfläche Bevölkerung von assoziierten Melanozyten. Erweiterung (unten links) zeigt eine schematische Darstellung eines typischen Nephron Baum im erwachsenen Zebrafisch Niere, in der jede einzelne Nephron besitzt einen Blutfilter (Nierenkörperchens) an einem Ende, gefolgt von einem proximalen Tubulus distalen Tubulus und Kanal. Farbige schematische (bottom rechts) zeigt einen linearen Schaltbild einer erwachsenen nephron Baum Segment Merkmale mit denen von embryonalen Nephrone (B) zu vergleichen. Die Zebrafischembryo Nephrone enthalten Röhrchen Segmente, die den proximalen Tubulus (PCT), proximalen Tubulus gerade (PST), distalen früh (DE), und distalen Ende (DL) sind, mit entsprechenden Genexpression Domains aufgelistet. Nephronen im erwachsenen Zebrafisch eine ähnliche Segmentzusammensetzung und analoge molekulare Signatur basierend auf der Expression von Genen, die Domänen gelösten Transporter codieren, wobei ein bemerkenswerter Unterschied im Vergleich zu der Embryo ist, dass mehrere Nephronen durch eine verzweigte DL Segment vereint werden. Hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2 Abbildung 2. Schema der Karte, die die Beziehung zwischen den in diesem Protokoll dargestellten Verfahren, die angeben, wie die Verfahren können einzeln oder in verschiedenen Kombinationen durchgeführt werden. Nach intraperitonealer Injektion von markiertem Lysin fixierbar Dextran in den erwachsenen Zebrafisch kann die Niere in ein visualisiert whole mount Zubereitung, entweder allein oder in Kombination mit alkalischer Phosphatase und / oder DBA Flecken. Alternativ kann die ausgewählte Zebrafisch Niere nach histologischen Gewebeschneide mit einem Kryostat untersucht werden. Die Abschnitte können gefärbt werden, um zahlreiche Kombinationen von Merkmalen kennzeichnen, unter Verwendung von Immunhistochemie Kernfärbung, DBA-Färbung und / oder alkalischer Phosphatase Reaktivität. Darüber hinaus kann die Nierenschnitte direkt auf das Vorhandensein von Lysin fixierbar Dextran-Aufnahme in PCT Segmente dargestellt werden. Schließlich kann ausgewählt Nieren für die Raum-Zeit-Ausdruck der Genexpression mit WISH verarbeitet werden. Zahlen in Klammern beziehen sich auf korrespnden Protokollteile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. erwachsenen Zebrafisch Nierenflachmontage Herstellung und Anwendung von konjugierten Dextran-Aufnahme in der PCT-Segment der Niere Nephrone visualisieren. (A) Hell Bild einer Nierenprobe Flachmontage Vorbereitung, in der die Orgel wurde flach auf einem Glasobjektträger positioniert, mit einem Deckglas auf der Oberseite des Gewebes, die auf vier Einschläge von Modelliermasse (hot pink Farbe) ruht platziert ist. Hier ist die Nieren Zubereitung ist neben einem Lineal abgebildet, um eine skalierte Vergleich bieten. Die typischen erwachsenen Niere ist etwa 5-7 Millimeter (mm) von Kopf bis Schwanz. (B) Hellfeldaufnahme eines ungebleichtenNiere. Die schwarze Pigmentierung entspricht der Streu Population von Melanozyten in Verbindung mit der Niere und der Aorta verläuft entlang der Mittellinie der Niere. (C) Darstellung von Nephron PCT Segmente 3 Tage nach intraperitonealer Injektion von 40 kDa-Dextran-Fluorescein (FITC) , ohne Bleich der erwachsenen Niere. PCT-Segmente werden in der Niere folgende intraperitoneale Injektion von 10 kDa zu sehen, sind aber teilweise auf die Melanozyten verdeckt. (C ') Digital-Zoom einer einzelnen Nephrons mit Melanozyten (weißer Pfeil). (D) Bild von einem Erwachsenen Nieren 3 Tage Dextran Fluor-Rubin, Fixierung der Niere und Bleichen. Die Melanozyten Pigmentierung wurde entfernt und die PCT-Regionen wurden hier anhand ihrer endocytischen Aufnahme von Dextran, das unter Hellfeld-Beleuchtung sichtbar gemacht. Lipidtropfen (Pfeil) aus dem Bauchraum kann manchmal in Verbindung mit Nierengewebeproben zu erkennen. (D ', D ") Representative Bilder zeigen leichte morphologische Unterschiede zwischen den PCT-Segmenten. Während viele nephron PCT sind eng gewickelten (D '), andere Nephronen enthalten PCT Regionen, die minimalen Wickel (D ") haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
. Abbildung 4. Erwachsene Niere Nephron PCT Röhrchen Segment Kennzeichnung Wildtyp Zebrafisch wurden intraperitoneal mit einem einzigen fluoreszierenden Dextran-Konjugat injiziert; dann wurde die Nieren 3 Tage nach der Injektion für PCT Visualisierung untersucht. (A, A ') Dextran Kaskade blau, 10 kDa (B, B') Dextran Lucifer Yellow, 10 kDa und (C, C ') Dextran f luoro-ruby, 10 kDa alle bevorzugt beschriften Sie die PCT-Segmenten in Nieren Nephronen. Sowohl Dextran Kaskade Blau und Lucifer Yellow zeigen einige nicht-spezifische Markierung von Stroma-Zellpopulationen zwischen Nephrone gelegen, mit viel höher in Lucifer Yellow behandelt Nieren beobachtet Hintergrund. Im Gegensatz dazu zeigte Dextran Fluor-ruby drastisch reduziert Hintergrund mit intensiven PCT-Kennzeichnung. (D, D ') Ein Erwachsener Niere durch WISH gefärbt, um die Lage der Transkripte slc20a1a, ein spezifischer Marker des PCT-Transporter codiert, Zelltyp zu erkennen. Die Expressionsdomäne von slc20a1a passt das charakteristische Muster in der Niere beobachtet Dextran-Aufnahme, mit einer Verteilung von verschiedenen eng gewickelten / geschleift PCT Domains sowie mehreren länglichen PCT Strecken, die eine konsistente breiten Durchmesser zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Figur.

NHALT "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 5
Abbildung 5. repräsentatives Ergebnis der Färbung für alkalische Phosphatase, ein pan-proximalen Tubulus Marker, in der erwachsenen Zebrafisch Niere im Vergleich zu anderen proximalen Tubulus Marker mit WISH bewertet. (AC) Alkalische Phosphatase-Färbung (türkis) beleuchtet das Nephron proximalen Tubulus und beleuchtet sowohl die PCT und PST. (DF) einzigen Wunsch für die aufgeführten Gene (jeweils in lila Färbung). (D, D ') das Expressionsmuster von Cubilin , ein pan-proximalen (PCT-PST) Marker korreliert mit alkalischer Phosphatase (D, D '). Im Vergleich, wünschen für mafba markiert den PCT (E, E ') und slc13a1 markiert den PST (F, F'). In (GG "') Doppel Wunsch für die PCT-Marker slc20a1a </ Em> (rot) und die PST-Marker slc13a1 (lila) zeigt, dass die Segmente von diesen Markern markiert nicht überlappen, und eher, dass ihre Expressionsdomänen besetzen benachbarten Positionen, wenn einzelne Nephrone werden genau untersucht (G'-G "'). Schwarz Pfeilspitzen zeigen den Übergang zwischen PCT und PST-Segmente, die in der Regel mit einer Änderung in Röhrchen Durchmesser von groß bis klein verbunden ist, auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Die alkalische Phosphatase und Dextran-Aufnahme zeigen Überlappung in der PCT-Segment der erwachsenen Niere Nephrone und alkalische Phosphatase-Färbung ist mit der Kern Co-Kennzeichnung mit Propidiumiodid kompatibel. (AI) (AC) zusammengefügten Bildes und getrennten Bildern des Sattelbereich eines einzelnen Niere. (DF) und (GI) Zwei Sätze von zusammengeführten Bilder und separate Bilder von beispielsweise Nephronen. (I) Kryoschnitt Analyse bestätigt Co-Kennzeichnung von alkalischer Phosphatase und Dextran Fluor-Rubin in der PCT-Segmenten (in weiße Punkte umrissen), während der alkalischen Phosphatase allein bezeichnet die PST Segment (in gelben Punkten umrissen). (KM) Eine Niere warmit (K) der alkalischen Phosphatase (türkis) und (L) Propidiumiodid (lila), so dass die (M) gekennzeichnet verschmolzen Visualisierung der proximalen Tubuluszellen und ihre Kerne sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7. Die alkalische Phosphatase und DBA sich gegenseitig aus-Segment Labels, die den pan-proximalen und distalen Regionen gesamt, markieren Sie jeweils in erwachsenen Zebrafisch Niere Nephrone vorhanden. (AH) ganze Berg Zubereitungen der Zebrafisch-Niere mit alkalischer Phosphatase und Rhodamin-DBA gefärbt. Alkalischer Phosphatase (Türkis) und DBA (rot) überlappen sich nicht in der Niere zu zeigen. Hintergrundwerte der alkalischen Phosphatase beleuchten das Paar von Hauptsammelkanäle in jeder Niere (Sternchen, *), die Unterscheidungskraft aufgrund ihres großen Durchmessers. DBA positive Tubuli sind dünner im Durchmesser und häufig durch das Vorhandensein von Verzweigungspunkten (weiße Pfeilspitzen) gekennzeichnet. (AC) zusammengefügten Bildes und getrennten Bildern des Sattelbereich eines einzelnen Niere. (DF) Ein Satz von fusionierten Bildern und getrennte Abbildungen Beispiel Nephronen. (G, H) Weitere Beispiele, mit verzweigten DBA Tubuli neben der alkalischen Phosphatase positive Tubuli fusionierte Bilder. (I) Kryoschnitt Analyse bestätigt, dass die alkalische Phosphatase und DBA-Label verschiedene Röhrchen Abschnitte und nur selten Tubuli weder Etikett vorzeigen (weißer Pfeil ), wahrscheinlich aufgrund des Winkels der Abschnitt für die Röhrchen. Für diese Analyse wurden Wildtyp transgene Fische, Tg: enpep: eGFP, wurden verwendet, und alle der Nierentubuli in diesem Niere wurden mit einem primären Antikörper auf GFP erkennen immun (J). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 8
Abbildung 8. Triple-Kennzeichnung von Erwachsenen Nierengefrierschnitte mit Dextran-Aufnahme, alkalische Phosphatase und DBA im Vergleich zum distalen Segment WISH-Analyse. (AE) Erwachsene Nieren wurden intraperitoneal mit Dextran-FITC (grün) eingespritzt, und die Nieren nach 3 Tagen für die Einbettung und Kryoschneiden gesammelt. Färbung mit alkalischer Phosphatase (Türkis) und DBA (rot) wurden drei Populationen von Tubuli: PCT-Segmente, die positiv für alkalische Phosphatase Reaktivität und dext warenlief (in weiße Punkte umrissen), PST-Segmente, die nur für die alkalische Phosphatase Reaktivität (in gelben Punkten umrissen) und distalen Tubuli Segmente, die positiv für DBA nur (in roten Punkte umrissen), die auch zeigte charakteristische distale Verzweigungspunkte waren positiv waren. ( AD) zusammengefügte Bild und separate Bilder eines Beispiels Abschnitt. (E) zusammengefügte Bild eines anderen Beispiels Abschnitt. (FI) Vergleich der distalen Tubuli Genexpressionsmuster von einzelnen (FH '") und Doppel (I) Merk. Das (FH) einzigen Wunsch für die aufgeführten Gene (jeweils in lila Färbung). (F, F ') Das Expressionsmuster von clcnk, ein pan-distalen (DE-DL)-Marker wurde in dünnen Röhrchen, die Verzweigungspunkte enthalten erkannt (schwarze Pfeilspitze). (G, G ') Im Vergleich, wünschen für SLC12A1 markiert den DE ohne Verzweigungspunkte erkannt und (HH' ") <em> SLC12A3 markiert den DL, ein Segment gekennzeichnet durch zahlreiche Verzweigungspunkte in der ganzen Niere Orgel (schwarz Pfeilspitzen). (I) Doppel Wunsch für die PCT-Marker slc20a1a (rot) und der pan-distalen clcnk (lila). Die von diesen Markern versehen Segmente überlappen sich nicht, und vielmehr ihre Expressionsdomänen besetzen, nicht benachbarte Positionen, so dass die einzelnen PCT Spulen (unten rechts) nicht anstoßen distalen Tubuli, und die letzteren besetzen diskreten Orten und besitzen Markenzeichen Verzweigungspunkte (schwarze Pfeilspitze ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Hier haben wir Methoden, die die Visualisierung von Nephron Segment Komponenten im erwachsenen Zebrafisch ermöglichen beschrieben. Die Injektion von fluoreszierenden Dextran-Konjugate ermöglicht Vorzugs PCT Kennzeichnung aufgrund der Eigenschaften dieser endozytischen proximalen Tubuluszellen 30,38. Dieses Verfahren kann sehr flexibel auf die Existenz von Dextranen, die mit einer Schar von unterschiedlichen Fluoreszenz-Konjugate erhalten werden können, durchgeführt werden. Darüber hinaus ist die Verwendung von Lysin fixierbar Dextrane eine besonders bequeme Weise, PCT Segmente kennzeichnen, als sekundäre Markierungsverfahren sind nicht erforderlich. Dies ermöglicht relativ einfache Signalerfassung und ist mit vielen anderen fluoreszierenden Markern, Immunmarkierung, und die Verwendung von transgenen Reporteranschlüsse. Alkalische Phosphatase Kennzeichnung markiert auch den proximalen Tubuli, mit starken Reaktivität in der PCT und etwas schwächer Reaktivität im PST. Schließlich ist die DBA-Färbung ermöglicht die Kennzeichnung von distalen Tubuli Segmente, die eine CH anzeigenaracteristic verzweigte Morphologie. Verschiedene Lektin-Moleküle, die Zucker-bindende Proteine ​​von nicht-immunen Ursprungs sind, wurden ausgiebig genutzt, um Säugetier Nephronsegmenten 47 unterscheiden. Es ist interessant, dass DBA im Zebrafisch korreliert mit distalen Tubuli Segmente, wie es verwendet wird, um Sammelkanäle in Säuger Nieren 47 zu kennzeichnen.

Zusammengenommen können diese Methoden in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um die Nierenfunktion Zusammensetzung und zu dokumentieren. Da alle diese Verfahren können in ganzen Nieren Zubereitungen verwendet werden, bieten sie Werkzeuge Nephron Struktur und Funktion im gesamten Organ zu bewerten, ohne vollständig die sich auf die Verwendung von mehr zeitaufwendig, mühsam Verfahren, zB Kryoschnittes Arbeit und Immunmarkierung. Jedoch sind die in diesem Artikel beschriebene Verfahren Flecken tragfähige Kryoschnittes. Kryoschnitt Analyse erzeugt (im Vergleich zu ganze Berg), die besser geeignet für die Immunhistochemie auf spezifische Pepti erkennen sinddes, obwohl natürlich diese Art der Analyse erfordert die Verfügbarkeit von entsprechenden primären Antikörper. Leider eine große Einschränkung in der Arbeit mit dem Zebrafisch Tiermodell bleibt die schlechte Verfügbarkeit von Antikörpern. So bleibt der Wunsch der am weitesten verbreitete, dh "go-to" Verfahren zur Analyse der Genexpression. WÜNSCHEN mit BCIP, NBT, und / oder INT-Substrat-Reaktionen bis violett oder rot Niederschläge zu produzieren ist nicht mit Fluoreszenzfärbung auf Gefrierschnitten kompatibel. Eine Möglichkeit wäre die Verwendung von Fluoreszenzdetektion WISH, ein Verfahren, bei Zebrafisch embryonalen Proben optimiert wurde und könnte zur Verwendung mit der erwachsenen Niere zugeschnitten werden aufzurufen. Die Beschreibung der Methoden in diesem Video-Artikel sollte für weitere Experimente mit Techniken wie Fluoreszenz WISH in Kombination mit transgenen Zebrafischlinien, in denen einzelnen Segmente werden mit einem Reporter, wie eGFP oder mCherry markierten ermöglichen. Alternativ die hier beschriebenen Methoden could in Kombination mit anderen Vitalfarbstoffe, zB andere Lektine getestet werden. So könnte eine weitere Anpassung und Erweiterung der hier beschriebenen Methoden aufgerufen werden, um die Bedürfnisse der Forscher für ganze Berg Nierenpräparate und Analyse gerecht zu werden.

Als solche haben diese Methoden breite Potenzial für die Umsetzung mit dem Zebrafisch-Modell für die laufende Regeneration Studien und auch in der genetischen Krankheit Modellierung. Es besteht ein dringender Bedarf für innovative Forschung und Behandlungen für Nieren Beschwerden. Millionen von Menschen leiden an irgendeiner Form von Nierenerkrankungen pro Jahr, die von angeborenen, akute und / oder chronische Ursachen führt. Ferner ist die Prävalenz von Nierenerkrankungen weiterhin weltweit steigen, was diese Krankheiten ein globales Problem der öffentlichen Gesundheit 14,15. Behandlungen, wie Hämodialyse sind, wodurch eine externe Dialysegerät dient, Blut von Stoffwechsel eines Patienten zu befreien, wenn die Nieren nicht in der Lage, diese Aufgabe durchzuführen. Leider, Hat dieser Eingriff Einschränkungen, die laufende Behandlung für das Überleben notwendig ist. Darüber hinaus werden Patienten schließlich erfordern eine Nierentransplantation, die Jahre in Anspruch nehmen können, um zu erhalten, sobald ein Patient auf eine Warteliste gesetzt. Selbst nach Erhalt einer Nierentransplantation, leiden viele Patienten Nebenwirkungen als Folge des Verfahrens und muß diese Effekte für den Rest ihres Lebens zu kämpfen. Diese Schwierigkeiten zeigen, die schwere Notwendigkeit für die Entwicklung von neuartigen Behandlungen, um entweder zu verhindern, Nierenerkrankungen oder vielleicht ergänzen Geweberegeneration 8,16,52,53. Angesichts der offensichtlichen ethischen Einschränkungen der Verwendung von menschlichen Probanden in biomedizinischen Laboratorien sind Tiermodelle wichtig für die Untersuchung der menschlichen Krankheitsentstehung und zum Testen von neuen Therapien. Als Ergebnis ihrer anatomischen Ähnlichkeit und evolutionäre Nähe hat der Maus werden die am häufigsten verwendete Modell der menschlichen Krankheit 45. Es gibt jedoch gewisse Beschränkungen für dieses Tier, including Unfähigkeit Organentwicklung in vivo und Praktikabilität der Vollendung großen genetischen Screens zu visualisieren. Zebrafische sind eine wichtige und nützliche Modellorganismus zur Untersuchung der Organentwicklung und Modellierung der menschlichen Krankheit 45,46. In Bezug auf die menschliche Krankheit, funktionale Homologen im Zebrafisch gibt es für fast 70% aller menschlichen Gene 54,55.

Neuere Arbeiten haben den Nutzen der Zebrafisch für viele Bereiche der Nierenforschung 31,37,56 hervorgehoben. Studium der Regeneration und Reparatur im Zebrafisch nach AKI legen nahe, dass Röhrchen epithelialen Regeneration und neonephrogenesis sind zwei Prozesse, die auftreten und überlappen in der gesamten Regenerationszeitverlauf 30,37. Die Verwendung von einem Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin genannt wurde als Schadens Paradigma, durch die die Ergebnisse des AKI bei erwachsenen Zebrafisch 29,30,37 studieren eingesetzt. Über einen etwa zwei Wochen nach der Verletzung von Gentamicin, der proximale Tubules regenerieren, und in der Zwischenzeit neue Nephrone bilden in der gesamten Orgel 29,30,37. Im Allgemeinen sind die Mechanismen, die Epithelregeneration regulieren weiterhin sehr umstritten. Bei einem vorgeschlagenen Mechanismus des Reparaturprozesses, da die anfängliche akute Verletzungsanlaß gefolgt von einer Ablösung von toten Zellen in das Lumen. Weiter gibt es eine Reihe von de-Differenzierung, Proliferation und Migration Ereignisse, nach denen neue Zellen zu differenzieren, repopulating den verletzten Basalmembran und Wiederherstellung der Funktion zu der verletzten Stelle. Alternativ können andere Studien haben vorgeschlagen, dass der Ersatz-Zellen von Stammzellen / Vorläuferzellen, die in Nephron Tubuli liegen kommen. Im Hinblick auf den Prozess der neonephrogenesis im Zebrafisch, haben Zellaggregaten wurde von Gentamicin Injektion 29,30 beobachtet folgende AKI. Diese Aggregate später reifen in neuen Nephrone, die in bereits bestehende Tubuli 29,30 auszuloten. Der rote Faden, der nephron epithelialen Regeneration und neonephr vereintogenesis ist ihre schiere Geheimnis Faktor: derzeit gibt es mehr Fragen exponentiell zu, wie diese regenerativen Leistungen auftreten, als es verfügbar Einsichten.

Bis heute ist jedoch, mehrere spannende Beweislinien unterstützen die Vorstellung, dass die Nierenregeneration Forschung mit Zebrafisch kann in der Tat relevante Vergleichs Einblicke in die menschliche AKI, die auch haben können direkte translationale Potenzial 56-58. Chemisches Screening nach kleinen Molekülen, die die Proliferation von Nierenvorläuferzellen im Zebrafischembryo kürzlich zur Identifizierung der Histon-Deacetylase-Inhibitor Methyl-4-(phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56,57 geführt erhöhen identifizieren. Verabreichung dieser Verbindung zu Zebrafisch-Larven mit Gentamicin-induzierte AKI ergab, dass Überlebens von Larven erhöht und dass die renale tubuläre Proliferation wurde verbessert 56,58. Wenn Mäuse mit moderaten Ischämie-induzierten AKI wurden mit m4PTB behandelt, ihre Erholung beschleunigt association mit einer Reduktion sowohl tubuläre Atrophie und Zellzyklusarrest proliferierender Nierenröhrenzellen 58. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wege für die normalen Zebrafisch Nierenentwicklung und / oder die regenerative Reaktion auf AKI verantwortlich ist, wird mit 56 Säugetieren konserviert werden.

So, während weitere Studien erforderlich sind, um necken neben die Mechanismen der Regeneration, nämlich um die Signalwege, die beteiligt sind, zu identifizieren und zu verstehen, ihre Wechselwirkungen der Zebrafisch-bietet ein vielversprechender Weg, um dieses wichtige Ziel in der Nephrologie Feld zu verfolgen. Werkzeuge wie die in diesem Protokoll beschrieben Nephron Zelle Etiketten stellen eine Gruppe von Assays, die verwendet werden können, Nieren Zusammensetzung und Funktionalität AKI Modelle zu evaluieren. Ferner können sie verwendet, um transgene Modelle von Nierenerkrankungen zu charakterisieren und möglicherweise Wege zur chemischen Therapeutika fördern kann Restaurierung Nephron Struktur nach Nierentransplantation Damm identifizieren bereitzustellenAlter.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von RAW aus der folgenden unterstützt: National Institutes of Health gewährt K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Finanzhilfe # 5-FY12-75; Start-up-Fonds von der University of Notre Dame College of Science und Department of Biological Sciences; und ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame von Elizabeth und Michael Gallagher im Namen der Familie Gallagher zu fördern Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Forschung an Zebrafisch-Notre-Dame für ihre herausragenden Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Schließlich danken wir den Mitgliedern unserer Forschungslabor für ihre Kommentare, Diskussionen und Erkenntnisse über diese Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20 American Bioanalytical AB02038
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. 
Fine Forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55 
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost 
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder Thermo-Fisher 12-587 Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution Bleach mix formula (for a 20 ml solution):
1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution
0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution
100 μl of 20% Tween
Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide Sigma 221473
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Blocking solution Blocking Solution (for a 10 ml solution):
8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween
2 ml of fetal calf serum
150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection Invitrogen E6601 We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. 
Alkaline phosphatase wash solution Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):
5 ml of 0.5 M EDTA
120 mg of Levamisole
95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW Invitrogen D1844 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW Invitrogen D1976 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW Invitrogen D1825 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW Invitrogen D1817 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine Vector laboratories RL-10-32 DBA Staining Solution (for a 100 μl solution):
1 μl of DBA
99 μl of 1X PBS
Propidium iodide Invitrogen E6601
DAPI Invitrogen P1304MP
Vectashield hard set mounting medium Vector laboratories H-1400
Micro cover glass VWR 48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO American Bioanalytical 67-68-5
Sucrose Sigma S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502
Levamisole Sigma L-9756
Tissue freezing medium Triangle Biomedical Sciences, Inc. TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm Sakura Finetek 4565
TruBond 380 adhesive microscope slides Tru Scientific 0380W
Liquid blocker – super PAP pen Electron Microscopy Sciences 71312
Immuno stain moisture chamber Evergreen Scientific 240-9020-Z10
Cryostat Therm Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope Nikon SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. 
Compound microscope Nikon 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.  

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Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren
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McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).More

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