zebrafish वयस्क गुर्दे गुर्दे उत्थान और रोग के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली है. इस तरह के अनुसंधान का एक अनिवार्य पहलू नेफ्रॉन संरचना और समारोह का आकलन है. इस प्रोटोकॉल नेफ्रॉन छोटी नली संरचना का आकलन करने के लिए और गुर्दे पुर्नअवशोषण मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कई तरीकों का वर्णन करता है.
zebrafish मॉडल गुर्दे विकास, उत्थान और बीमारी अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक प्रणाली के रूप में उभरा है. दोनों भ्रूण और वयस्क zebrafish गुर्दे अत्यधिक स्तनधारियों सहित अन्य रीढ़, साथ संरक्षित कर रहे हैं जो नेफ्रॉन के रूप में जाना कार्यात्मक इकाइयों से बना रहे हैं. Zebrafish में रिसर्च ने हाल ही में वयस्क नेफ्रॉन नुकसान उठाना बाद दो विशिष्ट घटना भाप बनकर दिखा दिया है कि: पहला, नष्ट छोटी नली उपकला कोशिकाओं की जगह है कि मौजूदा नेफ्रॉन के भीतर मजबूत उत्थान है; दूसरा, पूरी तरह से नया नेफ्रॉन neonephrogenesis रूप में जाना प्रक्रिया में गुर्दे progenitors से उत्पन्न होते हैं. इसके विपरीत, मानव और अन्य स्तनधारियों नेफ्रॉन उपकला उत्थान के लिए केवल एक सीमित क्षमता है लगता है. तिथि करने के लिए, इन गुर्दे उत्थान घटना के लिए जिम्मेदार तंत्र समझा खराब रहते हैं. वयस्क zebrafish गुर्दे दोनों नेफ्रॉन उपकला उत्थान और neonephrogenesis गुजरना है, वे एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक पैरा प्रदानइन घटनाओं का अध्ययन करने के digm. इसके अलावा, गुर्दे उत्थान को विनियमित कि सेलुलर और आणविक तंत्र को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि zebrafish मॉडल में उपलब्ध आनुवंशिक और औषधीय उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला है. इस तरह के अनुसंधान का एक अनिवार्य पहलू नेफ्रॉन संरचना और समारोह का मूल्यांकन है. इस प्रोटोकॉल वयस्क zebrafish गुर्दे में गुर्दे की रचना और परीक्षण नेफ्रॉन कार्यक्षमता गेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लेबलिंग तकनीकों का एक सेट का वर्णन है. इस प्रकार, इन तरीकों में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, जो वयस्क zebrafish गुर्दे की चोट लद, nephrotoxicant जोखिम शासनों या ऐसे nitroreductase मध्यस्थता सेल पृथक तकनीक के रूप में लक्षित सेल मौत की आनुवंशिक तरीकों का भविष्य प्ररूपी लक्षण वर्णन करने के लिए व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं. इसके अलावा, इन तरीकों वयस्क गुर्दा गठन में आनुवंशिक perturbations अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी जीर्ण रोग मॉडलिंग के दौरान गुर्दे की स्थिति का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
गुर्दे शरीर में शारीरिक कार्यों की एक भीड़ को पूरा कि एक जटिल अंग है. गुर्दे की सबसे महत्वपूर्ण समारोह चयापचय अपशिष्ट उत्सर्जन है, और इस कार्य को बारीकी से तरल पदार्थ homeostasis के रखरखाव के साथ intertwined है. गुर्दे समन्वित रूप से रक्तचाप, इलेक्ट्रोलाइट स्तर, और एसिड आधार संतुलन को विनियमित करते हैं, रक्त को छानने और मूत्र के गठन से इन नौकरियों करता है. नेफ्रॉन बुलाया अति विशिष्ट उपकला नलिकाओं गुर्दे 1,2 की बुनियादी कार्यात्मक इकाई के रूप में काम करते हैं. वयस्क रीढ़ में, नेफ्रॉन आम तौर पर कई नलिकाओं काफी छोटा अंग में पैक करने के लिए इस प्रकार की अनुमति, एक केंद्रीकृत जल निकासी व्यवस्था के आसपास के एक कसकर coiled व्यवस्था में आयोजित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, प्रत्येक मानव गुर्दे से अधिक 1 लाख नेफ्रॉन 3 शामिल कर सकते हैं. माउस की तरह अन्य स्तनधारियों गुर्दे 4 प्रति 8-10000 नेफ्रॉन के आदेश पर अधिकारी. गुर्दे की जटिलता की डिग्री इन स्तनधारी और अन्य हरा रंग के बीच अलग हैकुल नेफ्रॉन संख्या में विविधताओं और गुर्दे के भीतर उनके वास्तु लेआउट के कारण ebrates. Pronephros, mesonephros, और metanephros: हड्डीवाला प्रजातियों के रूप में कई के रूप में तीन लगातार विकास के दौरान गुर्दे संरचनाओं, और नेफ्रॉन बंदोबस्ती और व्यवस्था के संबंध में जटिलता बढ़ती प्रत्येक प्रपत्र प्रदर्शित करता है के रूप में. बनाए रखा जा करने के लिए पिछले गुर्दे संरचना वयस्क गुर्दे अंग आम तौर पर एक mesonephros या एक metanephros 2 के रूप में कार्य करता है. प्रत्येक गुर्दे रूप है, तथापि, एक नेफ्रॉन आधारित रचना 2 है.
नेफ्रॉन गुर्दे की workhorse है और metabolite स्राव और पुनः अवशोषण के साथ खून को छानने का काम के लिए जिम्मेदार है. नेफ्रॉन उपकला कोशिकाओं के शामिल सरल ट्यूबलर संरचना रहे हैं और भेदभाव epithelia के असतत, अति विशिष्ट डोमेन विशिष्ट कार्य जिसमें एक कमानी संगठन है. नेफ्रॉन के माध्यम से छानना प्रवाह के क्रम में, आम तौर पर तीन प्रमुख भागों compris कि वहाँ हैंई प्रत्येक इकाई: (1) वृक्क कणिका, समीपस्थ, मध्यवर्ती, और बाहर क्षेत्रों के साथ (2) एक छोटी नली, और (3) एक संग्रहण नलिका 1. समीपस्थ छोटी नली जैविक विलेय, सबसे विशेष रूप से ग्लूकोज और एमिनो एसिड 1 के पुनः अवशोषण के लिए जिम्मेदार है. मध्यवर्ती छोटी नली (या हेनले के लूप) नमक और पानी विनियमन 1 का एक प्रमुख स्थल है. अंत में, नमक और अन्य आयनों के ठीक ट्यूनिंग डिस्टल छोटी नली और संग्रहण नलिका में होता है और अत्यधिक अंत: स्रावी प्रणाली 1 द्वारा नियंत्रित किया जाता है. वहाँ से, छानना अंततः एक बेकार उत्पाद 1 के रूप में शरीर से बाहर निकलते, मूत्रवाहिनी और मूत्राशय के माध्यम से यात्रा करता है.
गुर्दे समारोह के नुकसान सामान्य नेफ्रॉन गतिविधि को रोकने कि कारणों में से एक भीड़ से स्टेम कर सकते हैं. इन कारणों में गुर्दे का विकास, जैसे, चोट के विभिन्न प्रकार से नेफ्रॉन 5, या कारणों की कुरूपता को जन्म दे कि जन्मजात दोषों (आनुवंशिक और वातावरण दोनों से stemming के दौरान हो सकता हैntal मूल). एक्वायर्ड चोटों मोटे तौर पर तीव्र गुर्दे चोट (अकी) या क्रोनिक किडनी चोट (सीकेडी) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. अकी अक्सर ischemia या विष जोखिम 6,7 से उत्पन्न गुर्दे समारोह के एक अचानक नुकसान शामिल है. स्तनधारियों में, नेफ्रॉन उपकला मरम्मत ऐसी चोटों 8 के बाद संभव है, और कई लोगों को अकी के बाद गुर्दे समारोह की पूर्ण बहाली दिखा रहे हैं. 70% घटना रेंज 6,7 – हालांकि, अकी भी एक व्यापक 30 के पार सूचित किया गया है कि उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है. सीकेडी, इसके विपरीत, आम तौर पर फाइब्रोसिस 8,9 के साथ जुड़े लंबे समय तक नुकसान के वर्षों का परिणाम है कि गुर्दे समारोह के प्रगतिशील हानि के साथ जुड़ा हुआ है. या तो एक अन्य 10-12 के लिए एक व्यक्ति संभावना अधिक होती है सकते हैं के रूप में आगे, एक परस्पर क्रिया, अकी और सीकेडी के बीच मौजूद है. उदाहरण के लिए, अकी से नुकसान उठाना पड़ा है जो उन सीकेडी और यहां तक कि मौत 13 को अतिसंवेदनशील होते हैं. गुर्दा रोग की घटनाओं, अमेरिका में और दुनिया भर में दोनों, epide तक पहुँच गया हैmic अनुपात और वृद्ध आबादी किडनी 14,15 के लिए पुनर्योजी चिकित्सा हस्तक्षेप की पहचान करने के लिए एक बढ़ती आवश्यकता है, इस प्रकार का विस्तार होने के रूप में वृद्धि की भविष्यवाणी की है.
अकी रोगियों को ठीक कर सकते हैं कि जानकारी होने के बावजूद, यह लंबे समय से गुर्दे की जन्मजात पुनर्योजी शक्तियों के बिना एक अंग है कि सोचा गया है. इस परंपरागत दृष्टिकोण नाटकीय रूप से हाल के वर्षों में 16 में संशोधित किया गया है. अकी के बाद चूहों और चूहों में गुर्दे की क्षति की जांच के अध्ययन नेफ्रॉन छोटी नली उपकला कोशिकाओं पैदा करना और कार्यात्मक नेफ्रॉन 17-20 पुनर्निर्माण कर सकते हैं कि पता चला है. स्तनधारियों नेफ्रॉन पुनर्जीवित करने के लिए इस अनुकूली क्षमता के अधिकारी हालांकि, गुर्दे फाइब्रोसिस और सीकेडी 21 के लिए नेतृत्व जो चालू किया जा सकता उल्लेखनीय सीमाओं और maladaptive प्रतिक्रिया कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, हाल ही में एक अध्ययन murine नेफ्रॉन में दोहराया उपकला सेल पृथक कम उत्थान और हवलदार गुर्दे फाइब्रोसिस का सुझाव नेफ्रॉन के साथ जुड़े थे कि प्रदर्शनईए उत्थान सीमा 22 सीमित. वयस्क स्तनधारी गुर्दे, खो दिया है या क्षतिग्रस्त लोगों की जगह नए नेफ्रॉन रूपों इस प्रकार उनके विनाश के लिए एक स्थायी नेफ्रॉन घाटा 8,9 की ओर जाता है कि कोई सबूत नहीं है. दिलचस्प है, कुछ रीढ़ नेफ्रॉन epithelia regenerating द्वारा और भी नए नेफ्रॉन का निर्माण करके अकी पर क्या प्रतिक्रिया है, एक प्रक्रिया neonephrogenesis या नेफ्रॉन neogenesis 23 के रूप में भेजा. Neonephrogenesis विष जोखिम या आंशिक लकीर के बाद मछली में पाया जाता है, और चोट मॉडल ऐतिहासिक और हाल ही में सुनहरी 24,25, tilapia 26, स्केट 27, medaka 28, और, zebrafish 29,30 शामिल है. इनमें से zebrafish गुर्दे उत्थान के लिए जिम्मेदार सेलुलर और आणविक रास्ते खोजने के लिए एक व्यवहार्य आनुवंशिक अनुसंधान मॉडल प्रदान करते हैं.
इस वीडियो लेख में, हम वयस्क zebrafish में नेफ्रॉन क्षेत्रों लेबल करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है. नेफ्रॉन शरीर रचना विज्ञान, आणविक सुविधाओं का ज्ञान,और कार्यात्मक विशेषताओं zebrafish का उपयोग सफल भविष्य गुर्दे की पढ़ाई के लिए आवश्यक हैं. वयस्क zebrafish गुर्दे एक mesonephros संरचना और वयस्क स्तनधारियों, avians, और सरीसृप 31 में पाया metanephros संरचना से नेफ्रॉन संख्या और संगठन के संदर्भ में स्वाभाविक रूप से कम जटिल है. हालांकि, zebrafish नेफ्रॉन खंड संगठन स्तनधारियों के अनुरूप है, और पहली बार जीन अभिव्यक्ति पढ़ाई 31-35 पर आधारित भ्रूण गुर्दे में दर्ज किया गया था. Zebrafish भ्रूण नेफ्रॉन समीपस्थ घुमावदार नलिका (पीसीटी) शामिल है कि रैखिक छोटी नली क्षेत्रों, समीपस्थ सीधे छोटी नली (पीएसटी), बाहर का प्रारंभिक (डे), और बाहर का देर से (डीएल) 31-35 (चित्रा 1) होते हैं. Zebrafish वयस्क नेफ्रॉन समान ट्यूबलर क्षेत्रों 30,31,36,37 (चित्रा 1) के पास है. पीसीटी भी एक कार्यात्मक फेनोटाइप से पहचाना जा सकता है: पीसीटी में उपकला कोशिकाओं में मौजूद fluorescently लेबल dextran यौगिकों (आकार में 10-70 केडीए) को शामिल करेंगेभ्रूण और वयस्क zebrafish गुर्दे दोनों में इस्तेमाल किया गया है जो परिसंचरण, इन समीपस्थ छोटी नली कोशिकाओं 38-41 (चित्रा 1) द्वारा endocytic तेज आकलन करने के लिए. Zebrafish और स्तनधारियों के बीच नेफ्रॉन क्षेत्रों में एक अंतर यह zebrafish एक मध्यवर्ती छोटी नली, या हेनले 30-37 के पाश की कमी है; स्तनधारियों में इस सेगमेंट कार्यों जल संरक्षण के लिए, और zebrafish उनके मूत्र ध्यान केंद्रित करने के लिए एक जरूरत के बिना एक मीठे पानी प्रजाति हैं, यह zebrafish इस सेगमेंट 32,33 कमी है कि आश्चर्य की बात नहीं है. इस प्रकार, कुल मिलाकर नेफ्रॉन संरचना काफी हद तक zebrafish और स्तनधारी गुर्दे 32,33 के बीच संरक्षित है. इन समानताओं विकास nephrogenesis 32-35,42 दौरान गुर्दे व्यक्त जीनों के कार्यों की जांच करने के लिए और इस तरह हो सकता है कि मानव की स्थिति की पर्याप्त सूची में जोड़ने, कई गुर्दा रोगों 43,44 मॉडल के लिए एक प्रभावी अनुसंधान उपकरण होना zebrafish सक्षम है का उपयोग जांचzebrafish 45,46.
आज, वयस्क zebrafish गुर्दे के कारण इसकी आनुवंशिक Tractability और इस प्रजाति में जीन समारोह और संकेत रास्ते से पूछताछ करने के लिए उपलब्ध तकनीकी संसाधनों का विस्तार तालू को गुर्दे उत्थान के तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल है. कई अध्ययनों से अकी 29,30,37 के बाद उत्थान के तंत्र की जांच के लिए zebrafish mesonephros का इस्तेमाल किया है. वयस्क zebrafish गुर्दे का उपयोग जारी रखा अकी अनुसंधान के लिए, यह नेफ्रॉन कार्यक्षमता सर्वेक्षण करने के लिए विभिन्न नेफ्रॉन क्षेत्रों और तरीकों लेबल करने के लिए उत्तम तरीकों के लिए आवश्यक है. वयस्क गुर्दे विश्लेषण के लिए कई तरीकों भ्रूण गुर्दे प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है. वयस्क zebrafish में fluorescently लेबल dextran के intraperitoneal इंजेक्शन zebrafish भ्रूण 38-41 (चित्रा 1) के रूप में, endocytosis 30 के माध्यम से mesonephros नेफ्रॉन में पीसीटी उपकला लेबल. इस विधि visualiz के लिए इस्तेमाल किया गया हैसमीपस्थ नलिकाओं बहाल शारीरिक समारोह 30 (चित्रा 1) के एक आकलन के लिए सक्षम बनाता है जो अकी, निम्न उनके reabsorbing संपत्ति हासिल जब ई. नेफ्रॉन समीपस्थ छोटी नली की एक और विशेषता यह खंड में उपकला कोशिकाओं अंतर्जात alkaline फॉस्फेट गतिविधि के उच्च स्तर से पता चलता है कि एक ब्रश सीमा 37 अधिकारी हैं. इस प्रकार, समीपस्थ उपकला ELF- (एनजाइम लेबल प्रतिदीप्ति) के रूप में जाना एक प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक -97 47 का उपयोग कर वयस्क zebrafish गुर्दे में नेत्रहीन स्थानीयकृत किया जा सकता है.
यहाँ, हम समीपस्थ छोटी नली का एक कार्यात्मक मूल्यांकन प्राप्त है और इस छोटी नली खंड के आकार और आकृति नक्शा करने के लिए इतनी के रूप में, वयस्क zebrafish गुर्दे में फ्लोरोसेंट dextran तेज assays 30,48 प्रदर्शन करने के लिए क्या करते हैं. अगला, हम फ्लोरोसेंट लेबल alkaline फॉस्फेट के साथ वयस्क नेफ्रॉन के समीपस्थ छोटी नली क्षेत्रों लेबल करने के लिए तकनीक का वर्णन. तीसरा, हम पहली बार है कि Rhod के लिए दिखानेamine टैग लेक्टिन Dolichos स्तनधारी गुर्दे 49 में एकत्रित नलिकाओं का एक सामान्य मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो agglutinin (यूके), biflorus, वयस्क zebrafish गुर्दे के बाहर नलिकाओं के निशान. डीबीए alkaline फॉस्फेट धुंधला करने के लिए परस्पर अनन्य है, इन लेबलों मोटे तौर पर वयस्क zebrafish नेफ्रॉन की अखिल बाहर फैला बनाम अखिल समीपस्थ भेद करने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. पूरे माउंट और cryostat ऊतकीय दोनों वर्गों में इन फ्लोरोसेंट दाग के कार्यान्वयन के दौरान, हम विशिष्ट प्रत्येक नेफ्रॉन खंड की पहचान है कि घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टर जीनों की अभिव्यक्ति डोमेन के साथ इन लेबलों सहसंबंधी. इसलिए इस प्रोटोकॉल भी हमारे भ्रूण इच्छा प्रोटोकॉल 50 के आधार पर सीटू संकरण (इच्छा) विश्लेषण में वयस्क ऊतक पूरे माउंट के लिए संशोधित ऊतक प्रसंस्करण प्रक्रिया के लिए एक गाइड शामिल हैं. इन प्रक्रियाओं ओ रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं दस्तावेज़ के लिए विभिन्न संयोजनों में (चित्रा 2) का उपयोग किया जा सकता हैच वयस्क zebrafish गुर्दे नेफ्रॉन. इस प्रकार, इन प्रोटोकॉल उत्थान पढ़ाई, अन्य गुर्दे की बीमारी मॉडल के प्ररूपी लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया जा सकता है, और यहां तक कि वयस्क गुर्दे के गठन का अध्ययन किया.
यहाँ, हम वयस्क zebrafish में नेफ्रॉन खंड घटकों के दृश्य है कि सक्षम तरीकों का वर्णन किया है. फ्लोरोसेंट dextran conjugates इंजेक्शन इन समीपस्थ छोटी नली कोशिकाओं 30,38 के endocytic गुणों के कारण तरजीही पीसीटी लेबलिंग सक्षम बनाता है. इस विधि के कारण अलग फ्लोरोसेंट conjugates के एक bevy के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि dextrans के अस्तित्व के महान लचीलेपन के साथ किया जा सकता है. माध्यमिक लेबलिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है के रूप में इसके अलावा, लाइसिन-फिक्स dextrans का उपयोग, पीसीटी क्षेत्रों लेबल करने के लिए एक विशेष रूप से सुविधाजनक तरीका है. यह अपेक्षाकृत सरल संकेत का पता लगाने में सक्षम बनाता है और कई अन्य फ्लोरोसेंट लेबल, immunolabeling, और ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों के उपयोग के साथ संगत है. Alkaline फॉस्फेट लेबलिंग भी पीएसटी में पीसीटी में मजबूत जेट और थोड़ा कमजोर जेट के साथ, समीपस्थ छोटी नली के निशान. अंत में, डीबीए धुंधला एक चर्चा प्रदर्शित जो बाहर का छोटी नली क्षेत्रों की लेबलिंग सक्षम बनाता हैaracteristic आकारिकी branched. Nonimmune मूल के चीनी बाध्यकारी प्रोटीन होते हैं जो विभिन्न लेक्टिन अणु, स्तनधारी नेफ्रॉन खंडों 47 भेद करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. यह स्तनधारी गुर्दे 47 में एकत्रित नलिकाओं चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में zebrafish में यूके, डिस्टल छोटी नली क्षेत्रों के साथ संबद्ध है कि दिलचस्प है.
साथ में ले ली, इन तरीकों गुर्दे की संरचना और समारोह दस्तावेज़ के लिए विभिन्न संयोजनों में उपयोग किया जा सकता है. इन तरीकों के सभी पूरे गुर्दे की तैयारी में इस्तेमाल किया जा सकता है, वे पूरी तरह से अधिक समय लेने वाली, कठिन तरीकों, जैसे, cryosection काम और immunolabeling के उपयोग पर निर्भर बिना अंग भर नेफ्रॉन संरचना और समारोह का मूल्यांकन करने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं. हालांकि, इस तरीके आलेख में वर्णित दाग cryosection में सक्षम हैं. Cryosection विश्लेषण immunohistochemistry विशिष्ट pepti का पता लगाने के लिए बेहतर अनुकूल हैं कि (पूरे माउंट की तुलना में) के नमूने उत्पन्नडेस, ज़ाहिर है, हालांकि विश्लेषण के इस प्रकार के उचित प्राथमिक एंटीबॉडी की उपलब्धता की आवश्यकता है. दुर्भाग्य से zebrafish पशु मॉडल के साथ काम करने में एक प्रमुख सीमा एंटीबॉडी की गरीब उपलब्धता बनी हुई है. इस प्रकार करना चाहते हैं, यानी, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल बनी हुई है 'जाने के लिए' जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए प्रक्रिया. बैंगनी या लाल अवक्षेप निर्माण करने के लिए BCIP, एनबीटी, और / या INT सब्सट्रेट प्रतिक्रियाओं उपयोग करते हुए इच्छा cryosections पर फ्लोरोसेंट धुंधला के साथ संगत नहीं है. एक विकल्प फ्लोरोसेंट इच्छा का पता लगाने, zebrafish भ्रूण के नमूने के लिए अनुकूलित किया गया है और वयस्क गुर्दे के साथ प्रयोग के लिए सिलवाया जा सकता है कि एक प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए आह्वान किया जाएगा. इस वीडियो लेख में विधियों का विवरण व्यक्तिगत खंडों ऐसे EGFP या mCherry के रूप में एक पत्रकार के साथ चिह्नित कर रहे हैं जिसमें ट्रांसजेनिक Zebrafish लाइनों के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट इच्छा की तरह तकनीक के साथ आगे प्रयोग के लिए अनुमति चाहिए. वैकल्पिक रूप से, तरीकों यहाँ coul वर्णितअन्य महत्वपूर्ण रंजक, जैसे, अन्य lectins साथ संयोजन में परीक्षण किया जाना चाहते हैं. इस प्रकार, आगे अनुकूलन और यहां वर्णित विधि का विस्तार पूरे माउंट गुर्दे की तैयारी और विश्लेषण के लिए अनुसंधानकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए लागू किया जा सकता है.
जैसे, इन तरीकों चल रही उत्थान के अध्ययन के लिए zebrafish मॉडल के साथ लागू करने के लिए और भी आनुवंशिक रोग मॉडलिंग में व्यापक क्षमता है. गुर्दे की वेदनाओं के लिए नवीन अनुसंधान और उपचार के लिए एक दबाने की जरूरत नहीं है. लाखों लोग, जन्मजात तीव्र, और / या पुरानी कारणों से यह परिणाम है कि हर साल गुर्दे की बीमारी के कुछ फार्म से पीड़ित हैं. इसके अलावा, गुर्दे की बीमारी की व्यापकता इन रोगों एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा 14,15, जिससे दुनिया भर में वृद्धि जारी है. एक बाहरी डायलिसिस मशीन उनके गुर्दे इस भूमिका को करने में सक्षम नहीं हैं, तो चयापचय अपशिष्ट का एक रोगी के रक्त से मुक्त करने में कार्य करता है जिससे इस तरह के हेमोडायलिसिस के रूप में उपचार उपलब्ध हैं. दुर्भाग्यचल रहे इलाज के अस्तित्व के लिए आवश्यक है, के रूप में इस हस्तक्षेप, सीमाएँ हैं. इसके अलावा, रोगियों अंततः एक मरीज को एक प्रतीक्षा सूची पर रखा गया है एक बार प्राप्त करने के लिए साल लग सकते हैं, जो एक गुर्दा प्रत्यारोपण की आवश्यकता होगी. यहां तक कि एक गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्त करने के बाद, कई रोगियों की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में प्रतिकूल प्रभाव पीड़ित हैं और अपने जीवन के आराम के लिए इन प्रभावों लड़ाई चाहिए. इन कठिनाइयों गुर्दे की बीमारी को रोकने या शायद ऊतक उत्थान 8,16,52,53 बढ़ाने के लिए मदद करने के लिए या तो उपन्यास उपचार के विकास के लिए गंभीर जरूरत प्रदर्शित करता है. जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में मानव परीक्षण विषयों के उपयोग की स्पष्ट नैतिक सीमाओं को देखते हुए, पशु मॉडल मानव रोग रोगजनन के अध्ययन के लिए और नए उपचार के परीक्षण के लिए आवश्यक हैं. इसकी संरचनात्मक समानता और विकासवादी निकटता का एक परिणाम के रूप में, माउस मानव रोग 45 की सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल बन गया है. हालांकि, इस जानवर के साथ कुछ सीमाएं समेत, कर रहे हैंअसमर्थता आईएनजी विवो और बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन को पूरा करने की व्यावहारिकता में अंग विकास की कल्पना करने के लिए. Zebrafish मानव रोग 45,46 के अंग विकास और मॉडलिंग के अध्ययन के लिए एक प्रासंगिक और उपयोगी मॉडल जीव हैं. मानव रोग के संबंध में, zebrafish में कार्यात्मक homologs सभी मानव जीन 54,55 का लगभग 70% के लिए मौजूद हैं.
हाल ही में काम गुर्दे अनुसंधान 31,37,56 के कई क्षेत्रों के लिए zebrafish की उपयोगिता पर प्रकाश डाला गया है. अकी के बाद zebrafish में उत्थान और मरम्मत का अध्ययन छोटी नली उपकला उत्थान और neonephrogenesis होते हैं और 30,37 timecourse उत्थान भर में ओवरलैप है कि दो प्रक्रियाओं हैं कि सुझाव. एक aminoglycoside एंटीबायोटिक बुलाया जेंटामाइसिन का उपयोग वयस्क zebrafish 29,30,37 में अकी के परिणामों का अध्ययन करना है जिसके माध्यम से एक चोट प्रतिमान के रूप में उपयोग किया गया है. जेंटामाइसिन से एक लगभग दो सप्ताह की अवधि निम्नलिखित चोट ओवर, समीपस्थ tubulतों पुनर्जन्म, और इस बीच नई नेफ्रॉन अंग 29,30,37 भर के रूप में. सामान्य तौर पर, उपकला उत्थान को विनियमित तंत्र है कि अत्यधिक विवादास्पद रहते हैं. मरम्मत की प्रक्रिया का एक प्रस्तावित तंत्र में, लुमेन में मृत कोशिकाओं के sloughing द्वारा पीछा प्रारंभिक गंभीर चोट घटना है. अगला, नई कोशिकाओं को अलग जिसके बाद de-भेदभाव, प्रसार, और प्रवास की घटनाओं की एक श्रृंखला, घायल तहखाने झिल्ली repopulating और घायल साइट के लिए समारोह बहाल है. वैकल्पिक रूप से, अन्य अध्ययनों प्रतिस्थापन कोशिकाओं नेफ्रॉन नलिकाओं के भीतर रहते हैं कि स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से पैदा होती है कि सुझाव दिया है. Zebrafish में neonephrogenesis की प्रक्रिया का संबंध है, सेलुलर समुच्चय जेंटामाइसिन इंजेक्शन 29,30 से निम्नलिखित अकी मनाया गया है. इन समुच्चय बाद में पहले से ही विद्यमान नलिकाओं 29,30 में साहुल कि नया नेफ्रॉन में परिपक्व. नेफ्रॉन उपकला उत्थान और neonephr एकजुट करती है कि आम धागाogenesis उनके सरासर रहस्य कारक है: वर्तमान में इन पुनर्योजी कारनामों उपलब्ध अंतर्दृष्टि वहाँ से पाए जाते हैं के बारे में कैसे तेजी से अधिक सवाल कर रहे हैं.
तिथि करने के लिए, हालांकि, सबूत के कई रोमांचक लाइनों zebrafish का उपयोग गुर्दे उत्थान अनुसंधान वास्तव में भी प्रत्यक्ष translational क्षमता 56-58 हो सकता है कि मानव अकी में प्रासंगिक तुलनात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि धारणा का समर्थन है. रासायनिक स्क्रीनिंग हाल ही में हिस्टोन deacetylase अवरोध मिथाइल-4 (phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56,57 की पहचान करने के लिए नेतृत्व zebrafish भ्रूण में गुर्दे पूर्वज कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ाने कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए. जेंटामाइसिन प्रेरित अकी के साथ zebrafish लार्वा को इस परिसर के प्रशासन लार्वा अस्तित्व में वृद्धि हुई है और यह कि गुर्दे ट्यूबलर प्रसार 56,58 बढ़ाया गया था कि पता चला. मध्यम ischemia प्रेरित अकी के साथ चूहों m4PTB साथ इलाज किया गया, उनकी वसूली Assoc में त्वरित किया गया थागुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं 58 proliferating के दोनों ट्यूबलर शोष और सेल चक्र गिरफ्तारी में कमी के साथ iation. इन निष्कर्षों को सामान्य zebrafish गुर्दे विकास और / या अकी पुनर्योजी प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार रास्ते स्तनधारियों 56 से संरक्षित किया जाएगा कि सुझाव.
इस प्रकार, आगे के अध्ययन को शामिल किया जाता है कि संकेत दे रास्ते की पहचान और उनकी बातचीत-zebrafish नेफ्रोलॉजी क्षेत्र में इस महत्वपूर्ण लक्ष्य का पीछा करने के लिए एक वादा अवसर प्रदान करता है समझने के उत्थान-अर्थात् के तंत्र अलग तंग करने की जरूरत है, जबकि. ऐसे में इस प्रोटोकॉल में वर्णित नेफ्रॉन सेल लेबल के रूप में उपकरण अकी मॉडल में गुर्दे की रचना और कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि assays के एक समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, वे गुर्दे की बीमारी के ट्रांसजेनिक मॉडल को चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है और गुर्दे बांध के बाद नेफ्रॉन संरचना की बहाली को बढ़ावा देने में सक्षम रसायन चिकित्सा विज्ञान की पहचान करने के लिए तरीके प्रदान कर सकता हैउम्र.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के बाद से रॉ को धन के द्वारा समर्थित किया गया था: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237 अनुदान; ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुदान पुरस्कार # 5 FY12-75 के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज विश्वविद्यालय से धन शुरू; और Gallagher परिवार की ओर से एलिजाबेथ और माइकल Gallagher से नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के एक उदार उपहार स्टेम सेल शोध को बढ़ावा. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारी धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके बकाया समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. अंत में, हम इस काम के बारे में उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और अंतर्दृष्टि के लिए हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद.
1X Pbs | Made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
1X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs. | ||
1X Pbs with 0.05 % Tween | 0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs. | ||
Tween 20 | American Bioanalytical | AB02038 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
Fine Forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
Glass Slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
Glass Coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
Modeling Clay | Hasbro | Playdoh | Other modeling clays can be substituted and work similarly |
Slide Holder | Thermo-Fisher | 12-587 | Optional: cardboard tray to store slides flat |
Bleaching solution | Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 mL with distilled water |
||
Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | |
Blocking solution | Blocking Solution (for a 10 mL solution): 8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 2 mL of fetal calf serum 150 μl of DMSO |
||
Alkaline phosphatase activity detection | Invitrogen | E6601 | We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit. To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. |
Alkaline phosphatase wash solution | Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 5 mL of 0.5M EDTA 120 mg of Levamisole 95 mL of 1X PBS |
||
Dextran, fluorescein, 40,000 MW | Invitrogen | D1844 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, cascade blue, 10,000 MW | Invitrogen | D1976 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW | Invitrogen | D1825 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW | Invitrogen | D1817 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine | Vector laboratories | RL-10-32 | DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS |
Propidium iodide | Invitrogen | E6601 | |
DAPI | Invitrogen | P1304MP | |
Vectashield Hard Set Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
Micro cover glass | VWR | 48393081 | |
Dimethyl Sulfoxide, DMSO | American Bioanalytical | 67-68-5 | |
Sucrose | Sigma | S0289 | |
EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502 | |
Levamisole | Sigma | L-9756 | |
Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TFM-C | |
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm | Sakura Finetek | 4565 | |
TruBond 380 Adhesive Microscope Slides | Tru Scientific | 0380W | |
Liquid Blocker – Super PAP Pen | Electron Microscopy Sciences | 71312 | |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen Scientific | 240-9020-Z10 | |
Cryostat | Therm | Microm™ HM 525 Cryostat | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |
Compound microscope | Nikon | 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |