Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

वयस्क zebrafish गुर्दे में नेफ्रॉन संरचना और समारोह के विश्लेषण

doi: 10.3791/51644 Published: August 9, 2014

Summary

zebrafish वयस्क गुर्दे गुर्दे उत्थान और रोग के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली है. इस तरह के अनुसंधान का एक अनिवार्य पहलू नेफ्रॉन संरचना और समारोह का आकलन है. इस प्रोटोकॉल नेफ्रॉन छोटी नली संरचना का आकलन करने के लिए और गुर्दे पुर्नअवशोषण मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कई तरीकों का वर्णन करता है.

Abstract

zebrafish मॉडल गुर्दे विकास, उत्थान और बीमारी अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक प्रणाली के रूप में उभरा है. दोनों भ्रूण और वयस्क zebrafish गुर्दे अत्यधिक स्तनधारियों सहित अन्य रीढ़, साथ संरक्षित कर रहे हैं जो नेफ्रॉन के रूप में जाना कार्यात्मक इकाइयों से बना रहे हैं. Zebrafish में रिसर्च ने हाल ही में वयस्क नेफ्रॉन नुकसान उठाना बाद दो विशिष्ट घटना भाप बनकर दिखा दिया है कि: पहला, नष्ट छोटी नली उपकला कोशिकाओं की जगह है कि मौजूदा नेफ्रॉन के भीतर मजबूत उत्थान है; दूसरा, पूरी तरह से नया नेफ्रॉन neonephrogenesis रूप में जाना प्रक्रिया में गुर्दे progenitors से उत्पन्न होते हैं. इसके विपरीत, मानव और अन्य स्तनधारियों नेफ्रॉन उपकला उत्थान के लिए केवल एक सीमित क्षमता है लगता है. तिथि करने के लिए, इन गुर्दे उत्थान घटना के लिए जिम्मेदार तंत्र समझा खराब रहते हैं. वयस्क zebrafish गुर्दे दोनों नेफ्रॉन उपकला उत्थान और neonephrogenesis गुजरना है, वे एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक पैरा प्रदानइन घटनाओं का अध्ययन करने के digm. इसके अलावा, गुर्दे उत्थान को विनियमित कि सेलुलर और आणविक तंत्र को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि zebrafish मॉडल में उपलब्ध आनुवंशिक और औषधीय उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला है. इस तरह के अनुसंधान का एक अनिवार्य पहलू नेफ्रॉन संरचना और समारोह का मूल्यांकन है. इस प्रोटोकॉल वयस्क zebrafish गुर्दे में गुर्दे की रचना और परीक्षण नेफ्रॉन कार्यक्षमता गेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लेबलिंग तकनीकों का एक सेट का वर्णन है. इस प्रकार, इन तरीकों में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, जो वयस्क zebrafish गुर्दे की चोट लद, nephrotoxicant जोखिम शासनों या ऐसे nitroreductase मध्यस्थता सेल पृथक तकनीक के रूप में लक्षित सेल मौत की आनुवंशिक तरीकों का भविष्य प्ररूपी लक्षण वर्णन करने के लिए व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं. इसके अलावा, इन तरीकों वयस्क गुर्दा गठन में आनुवंशिक perturbations अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी जीर्ण रोग मॉडलिंग के दौरान गुर्दे की स्थिति का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

गुर्दे शरीर में शारीरिक कार्यों की एक भीड़ को पूरा कि एक जटिल अंग है. गुर्दे की सबसे महत्वपूर्ण समारोह चयापचय अपशिष्ट उत्सर्जन है, और इस कार्य को बारीकी से तरल पदार्थ homeostasis के रखरखाव के साथ intertwined है. गुर्दे समन्वित रूप से रक्तचाप, इलेक्ट्रोलाइट स्तर, और एसिड आधार संतुलन को विनियमित करते हैं, रक्त को छानने और मूत्र के गठन से इन नौकरियों करता है. नेफ्रॉन बुलाया अति विशिष्ट उपकला नलिकाओं गुर्दे 1,2 की बुनियादी कार्यात्मक इकाई के रूप में काम करते हैं. वयस्क रीढ़ में, नेफ्रॉन आम तौर पर कई नलिकाओं काफी छोटा अंग में पैक करने के लिए इस प्रकार की अनुमति, एक केंद्रीकृत जल निकासी व्यवस्था के आसपास के एक कसकर coiled व्यवस्था में आयोजित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, प्रत्येक मानव गुर्दे से अधिक 1 लाख नेफ्रॉन 3 शामिल कर सकते हैं. माउस की तरह अन्य स्तनधारियों गुर्दे 4 प्रति 8-10000 नेफ्रॉन के आदेश पर अधिकारी. गुर्दे की जटिलता की डिग्री इन स्तनधारी और अन्य हरा रंग के बीच अलग हैकुल नेफ्रॉन संख्या में विविधताओं और गुर्दे के भीतर उनके वास्तु लेआउट के कारण ebrates. Pronephros, mesonephros, और metanephros: हड्डीवाला प्रजातियों के रूप में कई के रूप में तीन लगातार विकास के दौरान गुर्दे संरचनाओं, और नेफ्रॉन बंदोबस्ती और व्यवस्था के संबंध में जटिलता बढ़ती प्रत्येक प्रपत्र प्रदर्शित करता है के रूप में. बनाए रखा जा करने के लिए पिछले गुर्दे संरचना वयस्क गुर्दे अंग आम तौर पर एक mesonephros या एक metanephros 2 के रूप में कार्य करता है. प्रत्येक गुर्दे रूप है, तथापि, एक नेफ्रॉन आधारित रचना 2 है.

नेफ्रॉन गुर्दे की workhorse है और metabolite स्राव और पुनः अवशोषण के साथ खून को छानने का काम के लिए जिम्मेदार है. नेफ्रॉन उपकला कोशिकाओं के शामिल सरल ट्यूबलर संरचना रहे हैं और भेदभाव epithelia के असतत, अति विशिष्ट डोमेन विशिष्ट कार्य जिसमें एक कमानी संगठन है. नेफ्रॉन के माध्यम से छानना प्रवाह के क्रम में, आम तौर पर तीन प्रमुख भागों compris कि वहाँ हैंई प्रत्येक इकाई: (1) वृक्क कणिका, समीपस्थ, मध्यवर्ती, और बाहर क्षेत्रों के साथ (2) एक छोटी नली, और (3) एक संग्रहण नलिका 1. समीपस्थ छोटी नली जैविक विलेय, सबसे विशेष रूप से ग्लूकोज और एमिनो एसिड 1 के पुनः अवशोषण के लिए जिम्मेदार है. मध्यवर्ती छोटी नली (या हेनले के लूप) नमक और पानी विनियमन 1 का एक प्रमुख स्थल है. अंत में, नमक और अन्य आयनों के ठीक ट्यूनिंग डिस्टल छोटी नली और संग्रहण नलिका में होता है और अत्यधिक अंत: स्रावी प्रणाली 1 द्वारा नियंत्रित किया जाता है. वहाँ से, छानना अंततः एक बेकार उत्पाद 1 के रूप में शरीर से बाहर निकलते, मूत्रवाहिनी और मूत्राशय के माध्यम से यात्रा करता है.

गुर्दे समारोह के नुकसान सामान्य नेफ्रॉन गतिविधि को रोकने कि कारणों में से एक भीड़ से स्टेम कर सकते हैं. इन कारणों में गुर्दे का विकास, जैसे, चोट के विभिन्न प्रकार से नेफ्रॉन 5, या कारणों की कुरूपता को जन्म दे कि जन्मजात दोषों (आनुवंशिक और वातावरण दोनों से stemming के दौरान हो सकता हैntal मूल). एक्वायर्ड चोटों मोटे तौर पर तीव्र गुर्दे चोट (अकी) या क्रोनिक किडनी चोट (सीकेडी) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. अकी अक्सर ischemia या विष जोखिम 6,7 से उत्पन्न गुर्दे समारोह के एक अचानक नुकसान शामिल है. स्तनधारियों में, नेफ्रॉन उपकला मरम्मत ऐसी चोटों 8 के बाद संभव है, और कई लोगों को अकी के बाद गुर्दे समारोह की पूर्ण बहाली दिखा रहे हैं. 70% घटना रेंज 6,7 - हालांकि, अकी भी एक व्यापक 30 के पार सूचित किया गया है कि उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है. सीकेडी, इसके विपरीत, आम तौर पर फाइब्रोसिस 8,9 के साथ जुड़े लंबे समय तक नुकसान के वर्षों का परिणाम है कि गुर्दे समारोह के प्रगतिशील हानि के साथ जुड़ा हुआ है. या तो एक अन्य 10-12 के लिए एक व्यक्ति संभावना अधिक होती है सकते हैं के रूप में आगे, एक परस्पर क्रिया, अकी और सीकेडी के बीच मौजूद है. उदाहरण के लिए, अकी से नुकसान उठाना पड़ा है जो उन सीकेडी और यहां तक कि मौत 13 को अतिसंवेदनशील होते हैं. गुर्दा रोग की घटनाओं, अमेरिका में और दुनिया भर में दोनों, epide तक पहुँच गया हैmic अनुपात और वृद्ध आबादी किडनी 14,15 के लिए पुनर्योजी चिकित्सा हस्तक्षेप की पहचान करने के लिए एक बढ़ती आवश्यकता है, इस प्रकार का विस्तार होने के रूप में वृद्धि की भविष्यवाणी की है.

अकी रोगियों को ठीक कर सकते हैं कि जानकारी होने के बावजूद, यह लंबे समय से गुर्दे की जन्मजात पुनर्योजी शक्तियों के बिना एक अंग है कि सोचा गया है. इस परंपरागत दृष्टिकोण नाटकीय रूप से हाल के वर्षों में 16 में संशोधित किया गया है. अकी के बाद चूहों और चूहों में गुर्दे की क्षति की जांच के अध्ययन नेफ्रॉन छोटी नली उपकला कोशिकाओं पैदा करना और कार्यात्मक नेफ्रॉन 17-20 पुनर्निर्माण कर सकते हैं कि पता चला है. स्तनधारियों नेफ्रॉन पुनर्जीवित करने के लिए इस अनुकूली क्षमता के अधिकारी हालांकि, गुर्दे फाइब्रोसिस और सीकेडी 21 के लिए नेतृत्व जो चालू किया जा सकता उल्लेखनीय सीमाओं और maladaptive प्रतिक्रिया कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, हाल ही में एक अध्ययन murine नेफ्रॉन में दोहराया उपकला सेल पृथक कम उत्थान और हवलदार गुर्दे फाइब्रोसिस का सुझाव नेफ्रॉन के साथ जुड़े थे कि प्रदर्शनईए उत्थान सीमा 22 सीमित. वयस्क स्तनधारी गुर्दे, खो दिया है या क्षतिग्रस्त लोगों की जगह नए नेफ्रॉन रूपों इस प्रकार उनके विनाश के लिए एक स्थायी नेफ्रॉन घाटा 8,9 की ओर जाता है कि कोई सबूत नहीं है. दिलचस्प है, कुछ रीढ़ नेफ्रॉन epithelia regenerating द्वारा और भी नए नेफ्रॉन का निर्माण करके अकी पर क्या प्रतिक्रिया है, एक प्रक्रिया neonephrogenesis या नेफ्रॉन neogenesis 23 के रूप में भेजा. Neonephrogenesis विष जोखिम या आंशिक लकीर के बाद मछली में पाया जाता है, और चोट मॉडल ऐतिहासिक और हाल ही में सुनहरी 24,25, tilapia 26, स्केट 27, medaka 28, और, zebrafish 29,30 शामिल है. इनमें से zebrafish गुर्दे उत्थान के लिए जिम्मेदार सेलुलर और आणविक रास्ते खोजने के लिए एक व्यवहार्य आनुवंशिक अनुसंधान मॉडल प्रदान करते हैं.

इस वीडियो लेख में, हम वयस्क zebrafish में नेफ्रॉन क्षेत्रों लेबल करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है. नेफ्रॉन शरीर रचना विज्ञान, आणविक सुविधाओं का ज्ञान,और कार्यात्मक विशेषताओं zebrafish का उपयोग सफल भविष्य गुर्दे की पढ़ाई के लिए आवश्यक हैं. वयस्क zebrafish गुर्दे एक mesonephros संरचना और वयस्क स्तनधारियों, avians, और सरीसृप 31 में पाया metanephros संरचना से नेफ्रॉन संख्या और संगठन के संदर्भ में स्वाभाविक रूप से कम जटिल है. हालांकि, zebrafish नेफ्रॉन खंड संगठन स्तनधारियों के अनुरूप है, और पहली बार जीन अभिव्यक्ति पढ़ाई 31-35 पर आधारित भ्रूण गुर्दे में दर्ज किया गया था. Zebrafish भ्रूण नेफ्रॉन समीपस्थ घुमावदार नलिका (पीसीटी) शामिल है कि रैखिक छोटी नली क्षेत्रों, समीपस्थ सीधे छोटी नली (पीएसटी), बाहर का प्रारंभिक (डे), और बाहर का देर से (डीएल) 31-35 (चित्रा 1) होते हैं. Zebrafish वयस्क नेफ्रॉन समान ट्यूबलर क्षेत्रों 30,31,36,37 (चित्रा 1) के पास है. पीसीटी भी एक कार्यात्मक फेनोटाइप से पहचाना जा सकता है: पीसीटी में उपकला कोशिकाओं में मौजूद fluorescently लेबल dextran यौगिकों (आकार में 10-70 केडीए) को शामिल करेंगेभ्रूण और वयस्क zebrafish गुर्दे दोनों में इस्तेमाल किया गया है जो परिसंचरण, इन समीपस्थ छोटी नली कोशिकाओं 38-41 (चित्रा 1) द्वारा endocytic तेज आकलन करने के लिए. Zebrafish और स्तनधारियों के बीच नेफ्रॉन क्षेत्रों में एक अंतर यह zebrafish एक मध्यवर्ती छोटी नली, या हेनले 30-37 के पाश की कमी है; स्तनधारियों में इस सेगमेंट कार्यों जल संरक्षण के लिए, और zebrafish उनके मूत्र ध्यान केंद्रित करने के लिए एक जरूरत के बिना एक मीठे पानी प्रजाति हैं, यह zebrafish इस सेगमेंट 32,33 कमी है कि आश्चर्य की बात नहीं है. इस प्रकार, कुल मिलाकर नेफ्रॉन संरचना काफी हद तक zebrafish और स्तनधारी गुर्दे 32,33 के बीच संरक्षित है. इन समानताओं विकास nephrogenesis 32-35,42 दौरान गुर्दे व्यक्त जीनों के कार्यों की जांच करने के लिए और इस तरह हो सकता है कि मानव की स्थिति की पर्याप्त सूची में जोड़ने, कई गुर्दा रोगों 43,44 मॉडल के लिए एक प्रभावी अनुसंधान उपकरण होना zebrafish सक्षम है का उपयोग जांचzebrafish 45,46.

आज, वयस्क zebrafish गुर्दे के कारण इसकी आनुवंशिक Tractability और इस प्रजाति में जीन समारोह और संकेत रास्ते से पूछताछ करने के लिए उपलब्ध तकनीकी संसाधनों का विस्तार तालू को गुर्दे उत्थान के तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल है. कई अध्ययनों से अकी 29,30,37 के बाद उत्थान के तंत्र की जांच के लिए zebrafish mesonephros का इस्तेमाल किया है. वयस्क zebrafish गुर्दे का उपयोग जारी रखा अकी अनुसंधान के लिए, यह नेफ्रॉन कार्यक्षमता सर्वेक्षण करने के लिए विभिन्न नेफ्रॉन क्षेत्रों और तरीकों लेबल करने के लिए उत्तम तरीकों के लिए आवश्यक है. वयस्क गुर्दे विश्लेषण के लिए कई तरीकों भ्रूण गुर्दे प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है. वयस्क zebrafish में fluorescently लेबल dextran के intraperitoneal इंजेक्शन zebrafish भ्रूण 38-41 (चित्रा 1) के रूप में, endocytosis 30 के माध्यम से mesonephros नेफ्रॉन में पीसीटी उपकला लेबल. इस विधि visualiz के लिए इस्तेमाल किया गया हैसमीपस्थ नलिकाओं बहाल शारीरिक समारोह 30 (चित्रा 1) के एक आकलन के लिए सक्षम बनाता है जो अकी, निम्न उनके reabsorbing संपत्ति हासिल जब ई. नेफ्रॉन समीपस्थ छोटी नली की एक और विशेषता यह खंड में उपकला कोशिकाओं अंतर्जात alkaline फॉस्फेट गतिविधि के उच्च स्तर से पता चलता है कि एक ब्रश सीमा 37 अधिकारी हैं. इस प्रकार, समीपस्थ उपकला ELF- (एनजाइम लेबल प्रतिदीप्ति) के रूप में जाना एक प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक -97 47 का उपयोग कर वयस्क zebrafish गुर्दे में नेत्रहीन स्थानीयकृत किया जा सकता है.

यहाँ, हम समीपस्थ छोटी नली का एक कार्यात्मक मूल्यांकन प्राप्त है और इस छोटी नली खंड के आकार और आकृति नक्शा करने के लिए इतनी के रूप में, वयस्क zebrafish गुर्दे में फ्लोरोसेंट dextran तेज assays 30,48 प्रदर्शन करने के लिए क्या करते हैं. अगला, हम फ्लोरोसेंट लेबल alkaline फॉस्फेट के साथ वयस्क नेफ्रॉन के समीपस्थ छोटी नली क्षेत्रों लेबल करने के लिए तकनीक का वर्णन. तीसरा, हम पहली बार है कि Rhod के लिए दिखानेamine टैग लेक्टिन Dolichos स्तनधारी गुर्दे 49 में एकत्रित नलिकाओं का एक सामान्य मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो agglutinin (यूके), biflorus, वयस्क zebrafish गुर्दे के बाहर नलिकाओं के निशान. डीबीए alkaline फॉस्फेट धुंधला करने के लिए परस्पर अनन्य है, इन लेबलों मोटे तौर पर वयस्क zebrafish नेफ्रॉन की अखिल बाहर फैला बनाम अखिल समीपस्थ भेद करने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. पूरे माउंट और cryostat ऊतकीय दोनों वर्गों में इन फ्लोरोसेंट दाग के कार्यान्वयन के दौरान, हम विशिष्ट प्रत्येक नेफ्रॉन खंड की पहचान है कि घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टर जीनों की अभिव्यक्ति डोमेन के साथ इन लेबलों सहसंबंधी. इसलिए इस प्रोटोकॉल भी हमारे भ्रूण इच्छा प्रोटोकॉल 50 के आधार पर सीटू संकरण (इच्छा) विश्लेषण में वयस्क ऊतक पूरे माउंट के लिए संशोधित ऊतक प्रसंस्करण प्रक्रिया के लिए एक गाइड शामिल हैं. इन प्रक्रियाओं ओ रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं दस्तावेज़ के लिए विभिन्न संयोजनों में (चित्रा 2) का उपयोग किया जा सकता हैच वयस्क zebrafish गुर्दे नेफ्रॉन. इस प्रकार, इन प्रोटोकॉल उत्थान पढ़ाई, अन्य गुर्दे की बीमारी मॉडल के प्ररूपी लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया जा सकता है, और यहां तक ​​कि वयस्क गुर्दे के गठन का अध्ययन किया.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित zebrafish के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. नोट: zebrafish में गुर्दे और नेफ्रॉन शरीर रचना विज्ञान के लिए एक गाइड (चित्रा 1) प्रदान की जाती है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित के तरीके का अवलोकन एक ही गुर्दा नमूना पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि कैसे कई लेबलिंग प्रक्रियाओं को वर्णन करने के लिए एक प्रवाह चार्ट (चित्रा 2) के रूप में प्रदान की जाती है. वयस्क गुर्दे की पढ़ाई के लिए इच्छा तैयारी पर भाग 7 के लिए, यहाँ प्रदान कदम हाल ही में गुर्दे अंग के सफल इच्छा विश्लेषण के लिए एक तकनीकी मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए, 50 प्रकाशित के रूप में, zebrafish भ्रूण के प्रसंस्करण को संशोधित करने के लिए कैसे संकेत मिलता है.

ब्याज की dextran के साथ 1 वयस्क zebrafish intraperitoneal इंजेक्शन

  1. एकाग्रता में आसुत जल में dextran पाउडर भंग करके वांछित fluorescently लेबल dextran शेयर (ओं) तैयार करें50 मिलीग्राम की / एमएल, तो अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर microcentrifuge ट्यूबों में aliquots दुकान. नोट: विभिन्न fluorescently लेबल dextrans व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. वांछित हैं कि अन्य लेबल के संयोजन पर आधारित उपयोग के लिए dextran का चयन करें, और उपयुक्त फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग किया जाएगा कि सूक्ष्मदर्शी के साथ उपलब्ध हैं सुनिश्चित करें. लाइसिन-फिक्स dextrans रहने वाले नमूनों में किसी भी आगे की लेबलिंग कदम बिना प्रतिदीप्ति, euthanized नमूनों से unfixed ऊतक के नमूने, और तय नमूनों को दिखाते हैं.
  2. वांछित dextran शेयर पिघलना और प्रदर्शन करते हुए 1.3-1.5 कदम अंधेरे में बर्फ पर दुकान. हैंडलिंग, जबकि प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में microcentrifuge ट्यूब लपेटें.
  3. 2 मिनट - लगभग 1 के लिए 0.02% tricaine या 0.001% 2 Phenoxyethanol या तो युक्त एक डिश में मछली रखकर उम्र में 5-7 महीने के बीच एक वयस्क zebrafish anesthetize. नोट: यह SMA छोटी मछली हो सकता है क्योंकि इस उम्र सीमा के वयस्क zebrafish का उपयोग करने के लिए बेहतर हैडालूँगा काटना मुश्किल हो जाता है कि गुर्दे, और पुरानी मछली से गुर्दे के नमूनों का विश्लेषण किया नहीं जा सकता कि निशान ऊतक की जनता को शामिल कर सकते हैं. ठीक से anesthetized जब, वयस्क zebrafish धीरे मछली की दुम फिन को छूने के लिए एक चम्मच या कुंद जांच का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है, जो उत्तेजना, स्पर्श करने के लिए एक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन नहीं होगा.
  4. एक प्लास्टिक के चम्मच का प्रयोग, पकवान से मछली लिफ्ट समाधान छानना और ध्यान से एक गीला स्पंज मिट्टी, उदर पक्ष पर जानवरों की जगह.
  5. एक 31 जी 1.0 सीसी इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, intraperitoneal अंतरिक्ष में thawed dextran शेयर समाधान के 20 μl इंजेक्षन. उस प्रविष्टि पेट के उदर midline पर एक उथले कोण पर होती है तो सुई पूरबी. अंगों puncturing से बचने के लिए, थोड़ा तो सुई डालने dextran समाधान 48 इंजेक्षन जिसमें एक अंतरिक्ष मछली के शरीर दीवार उठा और बनाने के रूप में तो यह बढ़ा. नोट: 2 या 2: 1 (dextran: वैकल्पिक रूप से, dextran शेयर 1 के अनुपात में, जैसे, पतला किया जा सकता जिले) पानी tilled, नमूने में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए.
  6. धीरे संज्ञाहरण से वसूली अनुमति देने के लिए टैंक के लिए मछली वापसी. नोट: समीपस्थ छोटी नली खंड द्वारा dextran के तेज 8 के भीतर होता है - 12 घंटे और कम से कम 3 अप करने के लिए दिन के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) के लिए पता लगाया जा सकता है. 3 डीपीआई पर विश्लेषण गुर्दे स्ट्रोमल आबादी में कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के साथ मजबूत छोटी नली संकेत प्रदान करता है. अतिरिक्त लेबलिंग वांछित नहीं है, तो अकेले dextran तेज की पूरी माउंट परीक्षा के लिए भाग 2 के लिए आगे बढ़ें. मिश्रित लेबलिंग के लिए, dextran तेज, alkaline फॉस्फेट और / या भाग 5 के साथ डबल लेबल से तो भाग 4 के पूरे माउंट परीक्षा के लिए ऊतक तैयार करने के लिए डी बी डबल या ट्रिपल लेबलिंग प्रदर्शन करने के भाग 3 के लिए आगे बढ़ें. ऊतकीय वर्गों का उपयोग कर अनुसंधान के लिए, एक cryostat का उपयोग गुर्दे के ठीक वर्गों बनाने के लिए और प्राथमिक और माध्यमिक antib साथ विभिन्न लेबल और / या immunohistochemistry साथ इन दाग कैसे संबंध में निर्देश के लिए भाग 6 के लिए आगे बढ़ेंodies.

2 विच्छेदन और एक unfixed जानवर नमूना से वयस्क zebrafish गुर्दे के फ्लैट माउंट तैयारी समीपस्थ छोटी नली की फ्लोरोसेंट dextran लेबल कल्पना करने के लिए

  1. 5 मिनट - 4 के लिए 0.2% Tricaine पीएच 7.0 के साथ एक डिश में रखकर dextran इंजेक्शन वयस्क zebrafish euthanize. नोट: मछली गहरे नाले आंदोलन बंद है और दिल 36 धड़कन बंद कर दिया गया है कि क्या सावधानी से निगरानी के द्वारा, आगे बढ़ने से पहले euthanized किया गया है कि यह सुनिश्चित करें.
  2. एक प्लास्टिक के चम्मच का प्रयोग, Tricaine समाधान से मछली लिफ्ट समाधान छानना और एक ऊतक या कागज तौलिया पर पशु जगह.
  3. गिल operculum के पीछे एक काट कर और सिर को दूर करने के लिए विच्छेदन कैंची की एक तेज जोड़ी का प्रयोग करें.
  4. तुरंत दुम फिन के आधार करने के लिए सिर से एक लंबे उदर चीरा द्वारा विच्छेदन कैंची के साथ मछली के शरीर खुला.
  5. ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग मछली के आंतरिक अंगों निकालें.
  6. जानवर के पृष्ठीय दीवार के अनुयायी है जो गुर्दे अंग के दृश्य की अनुमति के रूप में तो शरीर दीवारों खुला पिन करने के लिए सुपर ठीक विच्छेदन सुई का प्रयोग करें.
  7. पृष्ठीय दीवार से गुर्दे से अलग करने के ठीक संदंश का प्रयोग करें.
  8. धीरे 1X पीबीएस युक्त एक 5 मिलीलीटर कांच की शीशी में गुर्दे की जगह है और 3 के साथ 3 बार धो - 5 मिनट प्रत्येक के लिए ताजा 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर. नोट: वयस्क गुर्दे के नमूने से निपटने के लिए एक कांच की शीशी का उपयोग ऊतक के दृश्य की सुविधा और लगभग 3 में से (ऊतक जन के सापेक्ष) बड़ी मात्रा के साथ washes के लिए अनुमति देता है - 5 मिलीलीटर. वैकल्पिक रूप से, एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति डिश में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूब में इस्तेमाल किया जा सकता है, मानक आकार ट्यूब (1.5 मिलीग्राम) धोने को प्रतिबंधित कर सकता है.
  9. 1X पीबीएस के 1-2 बूंदों के साथ एक साफ ग्लास स्लाइड पर एक हस्तांतरण pipet और जगह के साथ गुर्दे निकालें.
  10. सुनिश्चित करें कि कोई ऊतक कर्ल करवाने या अन्यथा पलट गया है, जिससे स्लाइड पर गुर्दे समतल करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करेंखुद पर. नोट: वैकल्पिक रूप से, एक टंगस्टन तार उपकरण गुर्दे के फ्लैट स्थिति की सुविधा के लिए संयोजी ऊतक में छोटे चीरों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  11. एक 18 x 18 मिमी कांच coverslip के प्रत्येक कोने पर मॉडलिंग मिट्टी के छोटे टुकड़े प्लेस और धीरे धीरे किडनी पर coverslip निर्धारित किया है. नोट: प्लेसमेंट के दौरान थोड़ा कोण coverslip समाधान 50 में हवाई बुलबुले को फँसाने कम करने के लिए. क्ले मॉडलिंग divots लगभग व्यास (2A चित्रा) में 2 मिमी हैं. वैकल्पिक रूप से, वैक्यूम तेल की divots क्ले मॉडलिंग के एवज में प्रतिस्थापित किया जा सकता है. यदि आवश्यक हो तो coverslip और गिलास स्लाइड के बीच की जगह को भरने के लिए 1X पीबीएस के एक अतिरिक्त बूंद जोड़ें.
  12. उपयुक्त फिल्टर के साथ एक stereomicroscope या यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर देखने के क्षेत्र में कांच स्लाइड रखकर गुर्दे का निरीक्षण करें और / या छवि. नोट: इस स्लाइड तैयार करने की स्थूल उपस्थिति के लिए 2A चित्रा का संदर्भ लें.

3 Fixation, विच्छेदन, Permeabilization और वयस्क zebrafish गुर्दे के pigmentation का हटाया

  1. 4% paraformaldehyde (पीएफए) / 1X पीबीएस / 0.1% DMSO के एक ताजा लगानेवाला समाधान तैयार या 4% पीएफए ​​/ 1 एक्स पीबीएस के एक जमे हुए विभाज्य पिघलना और 0.1% DMSO जोड़ें. सावधानी: पीएफए ​​विषैला होता है और दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट सहित, उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने जबकि पीएफए ​​समाधान एक रासायनिक हुड पर नियंत्रित किया जाना चाहिए. शेयर समाधान करते समय इसके अलावा, पीएफए ​​पाउडर देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए.
  2. पूरे पशु डूब पर्याप्त लगानेवाला समाधान के साथ एक विच्छेदन ट्रे भरें.
  3. (कदम 2.2-2.6 देखें) Euthanize और निर्धारण समाधान में चयनित zebrafish माउंट. नोट: चयनित मछली एक अनुपचारित zebrafish गुर्दे नमूना, या पहले से एक intraperitoneal dextran इंजेक्शन (पार्ट 1) प्राप्त है कि एक zebrafish से अलग एक गुर्दा हो सकता है.
  4. 4 सी पर - (16 घंटा 12) नमूना ओ / एन फिक्स
  5. अगले दिन, देखभाल करने के लिए ठीक संदंश का उपयोगपूरी तरह से पृष्ठीय शरीर दीवार से गुर्दे को अलग कर एक हस्तांतरण pipet का उपयोग एक कांच की शीशी में अंग जगह है. नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 12 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूब में इस्तेमाल किया जा सकता है, मानक आकार ट्यूब (1.5 मिलीग्राम) धोने को प्रतिबंधित कर सकता है.
  6. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर - 3 के साथ विच्छेदित गुर्दे 3 बार धोएं.
  7. 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस निकालें और 30 मिनट के लिए (1X पीबीएस में) एक 5% sucrose के समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ गुर्दे कुल्ला.
  8. 4 सी पर - (16 घंटा 12) (1X पीबीएस में) 30% sucrose के समाधान और दुकान ओ / एन के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें नोट: सुक्रोज समाधान वे ऊतक घुसना के रूप में बाद में अभिकर्मकों की विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति, सेलुलर झिल्ली permeabilize.
  9. अगले दिन, 30% sucrose के समाधान निकालने और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ गुर्दे की 2 बार धो लो.
  10. 3 से 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस बदलें -विरंजन समाधान के 5 मिलीलीटर गुर्दे अंग पर मौजूद मेलानोसाईट रंजकता हटाने के लिए.
  11. एक रोटेटर पर कांच की शीशी प्लेस और रंजकता गायब हो जाता है के रूप में ध्यान से देखो. के रूप में लंबे समय के रूप में 60 मिनट लग सकते हैं कभी कभी सूक्रोज उपचार के बाद प्रदर्शन किया जब depigmentation आम तौर पर लगभग 20 मिनट लगते हैं, लेकिन ध्यान दें:. विरंजन समाधान भी लंबे समय के लिए गुर्दे पर छोड़ दिया है, अंग का विघटन हो सकता है; यह ऊतक अखंडता की जांच के लिए नमूना हर 10-15 मिनट पर नजर रखने की सलाह दी है.
  12. 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर - रंजकता गुर्दे से निकाल दिया गया है, 3 के साथ दो बार धो लें.
  13. आरटी पर 1 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​समाधान के 5 मिलीलीटर - 3 के साथ 0.05% बीच साथ 1X पीबीएस बदलें.
  14. 4% पीएफए ​​समाधान निकालें और 3 के साथ गुर्दे की 3 बार धो - 5 मिनट प्रत्येक के लिए 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर. नोट: निर्धारण पूरा हो गया है एक बार, गुर्दे भी एक गिलास स्लाइड पर घुड़सवार और dextran तेज सेन्स मेलानोसाईट Pigm के लिए मूल्यांकन किया जा सकता हैentation, द्वारा कदम 2.8-2.12 प्रदर्शन.
  15. 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस निकालें और 3 के साथ जगह - अवरुद्ध समाधान के 5 मिलीलीटर, तो 2 घंटे के लिए ब्लॉक में आरटी पर गुर्दे सेते हैं.
  16. अवरुद्ध पूरा होने पर, चयनित धुंधला प्रोटोकॉल के लिए सीधे आगे बढ़ना. नोट: गुर्दे अब विभिन्न अभिकर्मकों के साथ लेबलिंग के अध्ययन का संचालन करने के क्रम में एक या एक से अधिक अन्य प्रक्रियाओं के माध्यम से कार्रवाई की जा सकती है. केवल alkaline फॉस्फेट के साथ समीपस्थ छोटी नली के पूरे माउंट लेबलिंग के लिए, वैकल्पिक रूप से, धारा 4 और 5 पूरे माउंट में दोहरी पता लगाने के लिए रेखीय उत्तराधिकार में किया जा सकता धारा 5 के लिए जाना ही बाहर का छोटी नली के पूरे माउंट लेबलिंग के लिए धारा 4 के लिए आगे बढ़ें .

4 alkaline फॉस्फेट पता लगाने के साथ वयस्क गुर्दे समीपस्थ छोटी नली अनुभाग लेबल

  1. ब्लॉक निकालें और गुर्दे 3 के साथ 3 बार धो - 5 मिनट प्रत्येक के लिए 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर, और फिर 3 से 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस की जगह - 5 मिलीलीटर1X पीबीएस की. गुर्दे की कम से कम 10 मिनट के लिए लेना. नोट: ऊतक पिछले प्रसंस्करण कदम के लिए एक कांच की शीशी में रखा गया है, इस समय के दौरान, एक 12 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश गुर्दे हस्तांतरण.
  2. पर्याप्त कार्यशील alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट समाधान तो, नमूना कवर आरटी पर 30 मिनट के लिए एक रोटेटर पर नमूना स्थान के लिए (सामग्री की तालिका में स्थित जांच किट को देखें) के साथ 1X पीबीएस बदलें. प्रकाश से सुरक्षित नमूना रखें.
  3. Alkaline फॉस्फेट धोने बफर समाधान में गुर्दे धोने से प्रतिक्रिया बंद करो.
  4. 15 मिनट - 10 से अधिक धोने बफर समाधान के 3 परिवर्तन के साथ गुर्दे कुल्ला. नोट: डीबीए के साथ लेबलिंग भी वांछित है अगर इस कदम के बाद, (इस प्रकार अस्थायी रूप से कदम 4.5-4.6 omitting), भाग 5 के लिए सीधे आगे बढ़ना 5.1 कदम. वैकल्पिक कदम: लेबल और अंग में सेल नाभिक कल्पना, propidium आयोडाइड समाधान में गुर्दे सोख करने के लिए. एक concentra पर पाउडर भंग करके एक propidium आयोडाइड स्टॉक तैयारआसुत पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल (1.5 मिमी) की tion. 2X एसएससी में 500 एनएम शेयर पतला और 30 मिनट के लिए इस समाधान में गुर्दे सेते हैं. 1X पीबीएस के साथ कुल्ला और 4.5 कदम आगे बढ़ना.
  5. (कदम 2.9-2.12 को देखें) धोने बफर समाधान निकालें और लेबलिंग किट में शामिल फॉस्फेट बढ़ते मध्यम में एक स्वच्छ गिलास स्लाइड पर गुर्दे माउंट. नोट: बढ़ते मध्यम कदम 2.9 से 1X पीबीएस बदल दिया गया है.
  6. एक Hoechst / DAPI फिल्टर सेट के साथ एक stereomicroscope या यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग गुर्दे दाग alkaline फॉस्फेट कल्पना. वैकल्पिक कदम: नोट एक tetramethyl-rhodamine (TRITC) या टेक्सास लाल फिल्टर का उपयोग propidium आयोडाइड कल्पना.

5 Rhodamine डीबीए के साथ वयस्क गुर्दे दूरस्थ छोटी नली सेगमेंट Demarcating

  1. 1X पीबीएस में 100 (2 मिलीग्राम / एमएल) 1 डी बी गिराए द्वारा एक 200 μl काम कर डीबीए समाधान तैयार है.
  2. 200 μl यूके समाधान के साथ 0.05% बीच समाधान के साथ 1X पीबीएस बदलें.
  3. के लिए रोटेटर पर रखेंआरटी पर 1 घंटा.
  4. डीबीए समाधान निकालें और 3 के साथ गुर्दे की 3 बार धो - 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर. नोट: वैकल्पिक कदम: लेबल और डी बी लेबल के साथ अंग में सेल नाभिक कल्पना, (rhodamine डीबीए दाग एक TRITC या टेक्सास लाल फिल्टर के साथ पाया जा सकता है) एक Hoechst / DAPI फिल्टर के साथ पता लगाने के लिए DAPI समाधान में गुर्दे सोख करने के लिए. 5 मिलीग्राम / एमएल (14.3 मिमी) के एक एकाग्रता में पाउडर भंग करके एक DAPI स्टॉक तैयार करें. 2X एसएससी में 300 एनएम शेयर पतला और 20 मिनट के लिए इस समाधान में गुर्दे सेते हैं. 1X पीबीएस के साथ कुल्ला और 5.5 कदम आगे बढ़ना. भाग 4 प्रसंस्करण प्रदर्शन किया गया है, तो DAPI और alkaline फॉस्फेट दोनों एक Hoechst / DAPI फिल्टर के साथ पता चला रहे हैं कि मन में रखो.
  5. (कदम 2.9-2.12 को देखें) 1X पीबीएस निकालें और एक साफ ग्लास स्लाइड पर गुर्दे माउंट.
  6. एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope या यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर सेट एक मानक TRITC या टेक्सास लाल फिल्टर का उपयोग गुर्दे की डीबीए से सना हुआ बाहर का खंडों कल्पना. नोट: वैकल्पिक हैTEP: एक Hoechst / DAPI फिल्टर का उपयोग DAPI कल्पना.

6 एम्बेडिंग, Cryosectioning और धुंधला वयस्क zebrafish गुर्दे ऊतक के (महत्वपूर्ण रंगों और Immunohistochemistry लेबल)

  1. , विश्लेषण के लिए मछली का चयन करें तो euthanize, ठीक है, और (कदम 3.2-3.8) के रूप में वर्णित permeabilize. नोट: 1 इथेनॉल: 9 में वयस्क मछली फिक्स 4% paraformaldehyde के एवज में formaldehyde / 0.1% DMSO / 1X पीबीएस / dextran, alkaline फॉस्फेट, और डीबीए दृश्य के लिए वर्गों का उत्पादन करने के लिए cryosection प्रक्रिया के लिए 0.1% DMSO. हालांकि, paraformaldehyde आधारित fixations कुछ immunohistochemistry प्रक्रियाओं के लिए संगत हो सकता है कि मन में रखो. Melanocytes सतही हैं और गुर्दे अंग की "अंदर" शामिल है कि नेफ्रॉन कोशिकाओं के दृश्य को प्रभावित नहीं करते क्योंकि इसके अलावा, वयस्क गुर्दे की विरंजन, cryosection विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है.
  2. अगले दिन, 30% sucrose के समाधान निकालने और 1 के साथ की जगह: 1 ऊतक ठंड मध्यम: 30% sucrosआरटी पर 4 घंटे के लिए ई.
  3. 1 समाधान और कम से कम 1 घंटे के लिए -80 सी पर cryomolds में मध्यम और जगह ठंड 100% ऊतक में गुर्दे के नमूने शामिल करें: 1 निकालें.
  4. Transversely पूरे वयस्क गुर्दे के माध्यम से, लगभग 12 माइक्रोन मोटी, धारावाहिक वर्गों में कटौती.
  5. चिपकने वाला खुर्दबीन स्लाइड पर जमे हुए cryosections माउंट और 50 सी पर 1 घंटे के लिए हवा शुष्क करने की अनुमति
  6. दुकान का उपयोग जब तक -80 सी पर स्लाइड.
  7. Cryosections लेबल बनने के लिए तैयार कर रहे हैं, माइक्रोस्कोप 45 मिनट के लिए 50 सी पर गर्म स्लाइड पर -80 सी और जगह से स्लाइड्स निकालें.
  8. एक तरल अवरोधक कलम का प्रयोग, cryosections के आसपास एक वृत्त खींचना और स्लाइड पर 15 मिनट के लिए सूखी 50 सी पर गरम
  9. गर्म स्लाइड से स्लाइड निकालें और आरटी पर एक आर्द्रता चैम्बर में फ्लैट जगह है.
  10. 20 मिनट के लिए स्लाइड के घेर लिया भाग को 0.05% बीच साथ 1X पीबीएस जोड़कर cryosections rehydrate. नोट: लगभग 200-300 और# 956; एल एक स्लाइड पर प्रत्येक घेर लिया हिस्से को कवर करने की जरूरत है.
  11. ताजा 1X पीबीएस के साथ 0.05% बीच समाधान के साथ 1X पीबीएस बदलें और 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  12. 1X पीबीएस निकालें और 2 घंटे के लिए एक अवरुद्ध समाधान में cryosections सेते हैं. नोट: अवरुद्ध समाधान एक 10 मिलीलीटर के लिए, 0.05% बीच, 2 मिलीलीटर भ्रूण बछड़ा सीरम और 150 μl DMSO के साथ 8 मिलीलीटर 1X पीबीएस गठबंधन. अवरुद्ध कदम के बाद immunohistochemistry को करने के लिए, 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस एक बार धोने का उपयोग, 4 सी पर / एन ताजा ब्लॉक हे में पतला वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइड सेते में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते 1X पीबीएस 0.05% बीच से, 0.05% के बीच के साथ 1X पीबीएस का उपयोग कर एक बार धोने, और मध्यम बढ़ते के साथ स्लाइड पर एक coverslip माउंट. आवश्यक प्रतिरक्षी dilutions अलग अलग होंगे और परीक्षणों के इष्टतम dilutions चयन करने के लिए किया जाना चाहिए. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति भी immunolabeling सुविधा कर सकते हैं, और अवरुद्ध होने से पहले किया जाता है. स्लाइड 50 सी पर thawed हैं तुरंत बादPreheated 10 मिमी सोडियम साइट्रेट बफर में 40 मिनट के लिए 95 सी -100 सी के बीच cryosections सेते (6.8 चरण). फिर 0.05% बीच साथ 1X पीबीएस में दो बार धोने, और 6.11 कदम आगे बढ़ना, 30 मिनट के लिए स्लाइड कूल.
  13. अवरुद्ध समाधान निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1X पीबीएस के साथ cryosections 3 बार धोएं.
  14. डीबीए धुंधला समाधान के साथ 1X पीबीएस बदलें और 1 घंटे के लिए सेते हैं. नोट: एक 100 μl धुंधला समाधान बनाने के लिए 1X पीबीएस के 99 μl में 1 μl डीबीए पतला.
  15. डीबीए धुंधला समाधान निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1X पीबीएस के साथ cryosections 3 बार धोएं.
  16. Alkaline फॉस्फेट लेबल लागू करें और 10 मिनट के लिए cryosections पर सेते हैं.
  17. 10 मिनट के लिए प्रत्येक धोने बफर के 3 washes की एक श्रृंखला के साथ cryosections बंद alkaline फॉस्फेट धो लें. , धोने बफर के 100 मिलीलीटर समाधान के लिए 1X पीबीएस के 95 मिलीलीटर में levamisole के 5 0.5 एम EDTA के मिलीग्राम और 120 मिलीग्राम गठबंधन: ध्यान दें. डि पर propidium आयोडाइड या DAPI के साथ वर्गों सेते हैं, नाभिक लेबल करने के लिएlutions पहले आरटी पर 30 मिनट के लिए (क्रमशः कदम 4.4, 5.4,) का उल्लेख किया. चुना गया है कि अन्य फ्लोरोसेंट दाग के संयोजन के साथ संगत एक परमाणु दाग ​​का चयन करें.
  18. Cryosections से सभी तरल निकालें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मध्यम बढ़ते के 2 बूँदें जगह है.
  19. ध्यान खुर्दबीन स्लाइड पर सूक्ष्म कांच कवर जगह है. Cryosections उपयुक्त फिल्टर (एस) के साथ छवि के लिए अब तैयार हैं.

वयस्क zebrafish गुर्दे नमूने के लिए 7 इच्छा प्रसंस्करण

  1. वांछित zebrafish नमूना (ओं) का चयन करें euthanize, ठीक है और (कदम 3.1-3.5) के रूप में वर्णित गुर्दे काटना. नोट: यह 4% paraformaldehyde (पीएफए) के एक लगानेवाला समाधान का उपयोग करने के लिए आवश्यक है / 1X पीबीएस 0.1% DMSO के साथ गुर्दे permeabilize करने के लिए. बाद के प्रसंस्करण कदम के दौरान आसान दृश्य के लिए एक कांच की शीशी में गुर्दे रखें.
  2. लगानेवाला निकालें और 1X PBST के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार गुर्दे धो लो.
  3. 1X पीबीएस निकालें और गुर्दे दो बार वाई धोने100% मेथनॉल वें, तो permeabilize करने के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए -20 सी पर गुर्दे सेते हैं. नोट: विच्छेदित गुर्दे अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता -20 सी
  4. 1X PBST के साथ 5 से 50% मेथनॉल / 1X PBST, 30% मेथनॉल / 1X PBST की मिलीलीटर, और दो बार - 3 के साथ 5 मिनट washes की एक श्रृंखला के प्रदर्शन से गुर्दे rehydrate.
  5. (कदम 3.10-3.14) के रूप में वर्णित रंजकता हटाने के लिए गुर्दे ब्लीच.
  6. तो हे / एन को 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​/ 1X PBST में 1X PBST और बाद तय साथ दो बार कुल्ला, 20 मिनट के लिए 0.1% DMSO के साथ 10 माइक्रोग्राम / एमएल proteinase कश्मीर / 1X PBST के साथ गुर्दे का इलाज. नोट: हमेशा हौसले thawed proteinase कश्मीर स्टॉक के 50 μl (10 मिलीग्राम / एमएल), 1X PBST के 50 एमएल, और DMSO के 50 μl संयोजन से नमूना पाचन से पहले तुरंत समाधान काम कर proteinase कश्मीर तैयार करते हैं.
  7. Riboprobe संश्लेषण, prehybridization, संकरण, विरोधी digoxygenin / विरोधी fluoroscein एंटीबॉडी ऊष्मायन और detec के लिए कदम निम्नलिखित एक या दो इच्छा के लिए गुर्दे की प्रक्रियाtion के रूप में हाल ही में 49 में वर्णित है. नोट: पूरे गुर्दे दाग की इमेजिंग धुंधला प्रतिक्रिया प्रदर्शन के कई दिनों के भीतर किया जाना चाहिए माउंट. नेफ्रॉन दाग, बहुत जल्दी से विशेष रूप से लाल सब्सट्रेट लेबल फीका करने के लिए करते हैं. नेफ्रॉन फोटोग्राफी के लिए, एक फ्लैट stereo- या यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग गुर्दे 2.12 करने के लिए कदम 2.10 में ऊपर वर्णित के रूप में नमूना, और छवि माउंट. अंतर हस्तक्षेप विपरीत फिल्टर बेहतर नमूना विश्लेषण की सुविधा नेफ्रॉन के सेलुलर रूपरेखा कल्पना करने के लिए नियोजित किया जा सकता.

Representative Results

प्रोटोकॉल के प्रत्येक जंगली प्रकार zebrafish पर प्रदर्शन किया गया था. डेटा के उदाहरण दस्तावेज़ स्वस्थ वयस्क zebrafish गुर्दे के भीतर सामान्य संरचनात्मक संरचना और नेफ्रॉन के गुण प्राप्त की. वयस्क zebrafish पृष्ठीय शरीर दीवार (चित्रा 1 ए) पर स्थित है जो एक mesonephros, या दूसरा गुर्दा फार्म के पास. वयस्क गुर्दे अपेक्षाकृत सपाट है और इन क्षेत्रों (चित्रा 1 ए) में फैले हुए सतही melanocytes के साथ एक तथाकथित सिर, ट्रंक, और पूंछ क्षेत्र में शामिल है. गुर्दे ऊतक केंद्रीय संग्रहण नलिकाएं (चित्रा 1 ए) में कनेक्ट और नाली कि नेफ्रॉन की सरणियों branched होता. प्रत्येक नेफ्रॉन उत्सर्जित किया जाएगा कि समाधान (चित्रा 1 ए) एकत्र कि एक वाहिनी में एक छोटी नली खंडों की श्रृंखला है, और अंत में समाप्त द्वारा पीछा एक छोर पर एक रक्त फिल्टर (या गुर्दे कणिका), के साथ, इसकी लंबाई के साथ polarized है. प्रत्येक वयस्क नेफ्रॉन छोटी नली प्रॉक्सिमल और बाहर segmen शामिलकोशिकाओं के टीएस, भ्रूण नेफ्रॉन 31-35 (चित्रा 1 बी) द्वारा प्रदर्शित कमानी पैटर्न के साथ संरक्षित है जो विशिष्ट घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टरों 30,31,36,37 की अभिव्यक्ति, द्वारा सीमांकन. उदाहरण के लिए, cubilin देखिए समीपस्थ छोटी नली 39 (पीसीटी और पीएसटी) निशान और clcnk टेप बाहर का छोटी नली 32 (डे और डीएल) (चित्रा 1 बी) के निशान. इसके अलावा, पीसीटी खंड slc20a1a की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित है, पीएसटी slc13a1 की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित है, डे slc12a1 की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित है, और डीएल slc12a3 32 की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित है   (चित्रा 1 बी). भ्रूण वालों की तुलना में वयस्क नेफ्रॉन नलिकाओं के बीच मतभेद बाहर खंडों embr में रेखीय, इन क्षेत्रों के गैर branched शरीर रचना से भिन्न है जो वयस्क, में बड़े पैमाने पर convolutions (डे, डीएल) और डीएल खंड शाखाएं है कि प्रदर्शन कर रहे हैंयो 30,31,36,37 (चित्रा 1 ए). दोनों वयस्क 30 और भ्रूण 38-41 नेफ्रॉन नलिकाओं में, पीसीटी उपकला अपने endocytic गुण की वजह से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और कल्पना और फ्लोरोसेंट dextran conjugates (चित्रा 1 बी) तेज करने की क्षमता के आधार पर reabsorptive समारोह के लिए मूल्यांकन किया जा सकता. बाद के आंकड़े, वयस्क समीपस्थ छोटी नली (पीसीटी और पीएसटी, या अखिल समीपस्थ क्षेत्र) में प्रदर्शन के रूप में बाहर का छोटी नली (डे और डीएल, या अखिल बाहर का क्षेत्र) डी बी ए द्वारा लेबल है, जबकि इसके अलावा, alkaline फॉस्फेट द्वारा लेबल है (चित्रा 1 बी). dextran तेज, alkaline फॉस्फेट, यूके, immunohistochemistry या इच्छा का उपयोग लेबल वयस्क zebrafish नेफ्रॉन क्षेत्रों के साथ साथ इस्तेमाल किया तरीकों पूरे माउंट में या गुर्दे ऊतक (चित्रा 2) के ऊतकीय वर्गों के साथ, विभिन्न संयोजनों में किया जा सकता है. नेफ्रॉन रचना का मूल्यांकन किया जा रहा है जब इस महान लचीलापन और विविधता के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2).

वयस्क गुर्दे क्ले मॉडलिंग की divots के साथ, विश्लेषण के लिए एक गिलास स्लाइड पर फ्लैट रखा जा सकता है (या वैकल्पिक रूप से, वैक्यूम तेल) ऊतक (चित्रा 3 ए) से अधिक coverslip निलंबित करने के लिए इस्तेमाल किया. ठेठ गुर्दे की लंबाई लगभग 5-7 मिमी है, यह एक स्टीरियो या यौगिक सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 3A) पर इमेजिंग के लिए अनुकूल एक आकार है. Brightfield प्रकाश व्यवस्था के तहत, काला रंजकता के साथ melanocytes की एक सतही आबादी घूम एरिथ्रोसाइट्स एक लाल रंग (चित्रा 3 बी) है क्योंकि देखा जा सकता है इस तरह के महाधमनी के रूप में गुर्दे ऊतक के सहयोग से, और vasculature में देखे जा सकते हैं. Dextran-FITC की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद, mesonephros भर में स्थित पीसीटी डोमेन अभी भी 3 दिन बाद लेबल, और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा -3 सी) पर एक FITC फिल्टर का उपयोग imaged थे. Melanocytes आंशिक (Figu व्यक्ति गुर्दे tubules के दृश्य अस्पष्ट जबकि-3 सी ') फिर से, melanocytes नेफ्रॉन संख्या या छोटी नली व्यास और लंबाई के मूल्यांकन की मात्रा का ठहराव रोकने के लिए नहीं है. Dextran फ्लोरो रूबी की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद तय नमूना के विरंजन मेलानोसाईट रंजकता का सफाया, और पीसीटी क्षेत्रों अकेले उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश (चित्रा 3 डी) के साथ मनाया गया. पेट शरीर गुहा से लिपिड बूंदों कभी कभी convolutions, coils (चित्रा 3 डी ') दिखाने पूरे गुर्दे अंग तैयारी (चित्रा 3A) .Individual पीसीटी क्षेत्रों के सहयोग में देखा जा सकता है लेकिन यह भी अपेक्षाकृत रेखीय हिस्सों (चित्रा 3 डी ") द्वारा लक्षण वर्णन किया जा सकता है.

विभिन्न dextran conjugates समीपस्थ छोटी नली लेबलिंग में समग्र स्पष्टता के विभिन्न स्तरों प्रदान की. विशेष रूप से, dextran-FITC या dextran फ्लोरो रूबी न्यूनतम पृष्ठभूमि (आंकड़े -3 सी डी ") के साथ नेफ्रॉन लेबल कुरकुरा का नेतृत्व किया. Dextran झरना दोनों Bluई और लूसिफ़ेर पीला conjugates वयस्क गुर्दे (चित्रा -4 ए, 4 बी) में समीपस्थ छोटी नली तेज दिखाया. Dextran लूसिफ़ेर पीले उजागर करने के गुर्दे में भर गैर विशिष्ट फ्लोरोसेंट धुंधला वर्तमान के साथ, पीसीटी क्षेत्रों लेबल लेकिन ध्यान देने योग्य पृष्ठभूमि संकेत दिखाया था, जबकि दिलचस्प बात dextran झरना नीले उजागर करने के लिए गुर्दे, कुछ पृष्ठभूमि (चित्रा -4 ए, 4 ए ') के साथ अपेक्षाकृत विशिष्ट पीसीटी प्रतिदीप्ति दिखाया गुर्दे स्ट्रोमा, या नेफ्रॉन (चित्रा 4 बी, 4 बी ') के बीच अंतरिक्ष. अंत में, dextran फ्लोरो रूबी का उपयोग विभिन्न आवर्धन (चित्रा 4C, 4C ') की एक श्रृंखला में देखा भी है जब कम से कम या कोई पृष्ठभूमि के साथ, बेहतर समीपस्थ छोटी नली लेबलिंग प्रदान की. सभी मामलों में, dextran संयुग्म तेज की विशिष्ट ट्यूबलर पैटर्न slc20a1a, एक स्थापित पीसीटी विशिष्ट मार्कर 30-32 (चित्रा 4D) एन्कोडिंग टेप की इच्छा की अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध. Nephr'(, 3 डी "लेबल dextran एकत्रित assays चित्रा 3 डी) के दौरान मनाया के रूप में, slc20a1a antisense riboprobe के साथ दाग पीसीटी खंडों पर एस के आकार पीसीटी coils, साथ ही कम तेजी coiled पीसीटी क्षेत्रों (चित्रा 4D)' का प्रदर्शन किया.

इस तरह के समीपस्थ छोटी नली alkaline फॉस्फेट गतिविधि (चित्रा 5A, 5 ब, 5C) का पता लगाने के रूप में अन्य गुर्दे की तैयारी, इसी प्रकार मेलानोसाईट रंजकता को हटाने के बाद प्रदर्शन किया गया. यह किसी भी रुकावट के बिना समीपस्थ छोटी नली नेफ्रॉन इमेजिंग और विश्लेषण के लिए अनुमति दी. नेफ्रॉन में अंतर्जात alkaline फॉस्फेट जेट समीपस्थ छोटी नली 1,47 की एक प्रमुख पहचान है. 39 (चित्रा 5D, 5D ') cubilin जीन की अखिल समीपस्थ इच्छा अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना में alkaline फॉस्फेट धुंधला, समीपस्थ नेफ्रॉन क्षेत्रों के लिए अत्यधिक विशिष्ट है. Alkaline फॉस्फेट जेट प्राथमिकी में सबसे तीव्र थाभी पीसीटी में उच्चतम रिश्तेदार प्रतिलेख स्तर पर था जो cubilin अभिव्यक्ति के पैटर्न (चित्रा 5D, 5D '), के समान पीसीटी (चित्रा 5 ब), से मेल खाती है कि समीपस्थ छोटी नली के सेंट अनुभाग. पीसीटी इसके थोड़ा व्यापक व्यास, प्रतिलेखन कारक mafba (चित्रा 5E, 5E ') के विशिष्ट अभिव्यक्ति, और घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टर जीन slc20a1a (चित्रा 4D, 4D की विशिष्ट अभिव्यक्ति') द्वारा प्रतिष्ठित किया गया था. Alkaline फॉस्फेट जेट भी घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टर जीन slc13a1 (चित्रा 5F, 5F ') के खंड विशिष्ट प्रतिलेख अभिव्यक्ति की तुलना के आधार पर पीएसटी खंड (चित्रा 5 ब) से मेल खाती है कि एक पतली व्यास के साथ समीपस्थ छोटी नली का एक खंड लेबल. पीसीटी मार्कर slc20a1a और पीएसटी मार्कर slc13a1 की इच्छा की अभिव्यक्ति डोमेन परस्पर अनन्य (चित्रा 5G हैं cubilin की अभिव्यक्ति डोमेन पुनरावृत्ति दिखाया. चित्रा 5G ', 5G ", 5G"' ).

आगे समीपस्थ छोटी नली पहचान के साथ alkaline फॉस्फेट जेट के संबंध की पुष्टि करने के लिए, पूरे dextran फ्लोरो रूबी 3 दिन पहले (चित्रा 6A सी) की intraperitoneal इंजेक्शन प्राप्त है कि zebrafish से गुर्दे पर प्रदर्शन किया गया था alkaline फॉस्फेट धुंधला सह लेबलिंग माउंट. Dextran फ्लोरो रूबी पीसीटी (चित्रा 6D-मैं में उदाहरण) से मेल खाती है कि समीपस्थ छोटी नली डोमेन के सिर्फ व्यापक व्यास हिस्से में alkaline फॉस्फेट के साथ ओवरलैप दिखाया. dextran पॉजिटिव डोमेन अचानक पीसीटी और पीएसटी मिले जहां समीपस्थ छोटी नली का व्यास पतला साइट है जहाँ, यानी, (सफेद तीर पर रोकाचित्रा 6) और केवल alkaline फॉस्फेट जेट में सिर बाद पीएसटी खंड चित्रा 6D-मैं में (उदाहरण) में मनाया गया. Alkaline फॉस्फेट प्रतिक्रिया से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति भी dimly वयस्क गुर्दे में पाया समानांतर प्रमुख संग्रहण नलिका पटरियों की जोड़ी उल्लिखित चित्रा 6A, 6D में व्यापक किसी भी गुर्दे से जुड़े ट्यूब का व्यास (तारक होने से विशिष्ट हैं जो 29,30 -ducts, 6E, 6G, 6H). अगला, alkaline फॉस्फेट और dextran तेज साथ नेफ्रॉन नलिकाओं के सह लेबलिंग cryosection विश्लेषण में मनाया गया (चित्रा 6J, छोटी नली perimeters सफेद डॉट्स के साथ उल्लिखित). इसी ट्यूबलर सेल साइटोसोलिक अंतरिक्ष dextran फ्लोरो रूबी जेट (चित्रा 6J) से पता चला है, जबकि पार अनुभाग में, alkaline फॉस्फेट जेट, ब्रश सीमा फैटी के साथ संगत ट्यूबलर उपकला, के शिखर सतह पर एक मोटी बैंड में नोट किया गया था. विशेष रूप से, staineडी नलिकाओं पीसीटी क्षेत्रों, या alkaline फॉस्फेट के लिए अकेले सकारात्मक (चित्रा 6J, पीले डॉट्स में उल्लिखित परिधि छोटी नली) एक पीएसटी खंड के रूप में एक पहचान करने के लिए अग्रणी (नोट के रूप में उनकी पहचान करने के लिए अग्रणी, alkaline फॉस्फेट और dextran के लिए डबल सकारात्मक या तो थे: अन्य वर्तमान नलिकाओं, डेटा)) (चित्रा 6J नहीं दिखाया दोनों दाग के लिए नकारात्मक रहे थे. इसके अलावा, alkaline फॉस्फेट धुंधला (चित्रा 6K) सफलतापूर्वक एक परमाणु लेबल, propidium आयोडाइड (चित्रा 6L), को सुविधाजनक बनाने के सेल गिनती (चित्रा 6M में ओवरले) के साथ जोड़ दिया गया था.

वयस्क zebrafish नेफ्रॉन के दूरस्थ छोटी नली rhodamine संयुग्मित डी बी ए (चित्रा 7) के साथ चिह्नित किया गया. पूरे wildtype zebrafish (चित्रा 7A-C) से गुर्दे पर प्रदर्शन किया गया था यूके और alkaline फॉस्फेट के साथ डबल लेबलिंग माउंट. यूके और alkaline फॉस्फेट जेट नेफ्रॉन नलिकाओं में कोई ओवरलैप (दिखाया चित्रा 7G, 7, 7J) branched गया. GFP लेबल के रूप में, प्रॉक्सिमल और बाहर नेफ्रॉन नलिकाओं 51 (चित्रा 7I) दोनों (EGFP: enpep टीजी) गुर्दे cryosections enpep प्रमोटर EGFP जो ड्राइव में एक transgene ले कि wildtype zebrafish से एकत्र किए गए थे. Immunohistochemistry गुर्दे tubules (हरा, चित्रा 7I) के सभी लेबल के रूप में तो alkaline फॉस्फेट और यूके (क्रमशः फ़िरोज़ा और लाल, चित्रा 7I) के साथ फ्लोरोसेंट लेबलिंग, उसके बाद, GFP का पता लगाने के लिए किया गया था. छोटी नली वर्गों का विश्लेषण नलिकाओं दोनों लेबल (चित्रा 7I) alkaline फॉस्फेट या डीबीए के लिए सकारात्मक है, लेकिन या तो नहीं थे कि पता चला. केवल दुर्लभ टबules संभवतः कारण छोटी नली खंड के कोण (सफेद तीर, चित्रा 7I) के लिए, alkaline फॉस्फेट और न ही डीबीए दाग न तो साथ जेट दिखाया. इसके अलावा, यूके धुंधला सफलतापूर्वक फिर से बाहर का छोटी नली क्षेत्रों की विशेषता branched प्रकृति (सफेद तीर, चित्रा 7J) बल, परमाणु लेबल DAPI (चित्रा 7J) के साथ पूरा पर्वत गुर्दे धुंधला में जोड़ दिया गया था.

इसके बाद, आगे dextran-FITC तेज, alkaline फॉस्फेट, और यूके के पैटर्न की तुलना करने, ट्रिपल लेबलिंग, dextran-FITC साथ intraperitoneally इंजेक्शन वयस्क zebrafish द्वारा जांच alkaline फॉस्फेट और डीबीए के लिए cryosectioning और धुंधला द्वारा 3 दिन बाद गुर्दे अलगाव के द्वारा पीछा किया गया (चित्रा 8A ई में दिए गए उदाहरणों). Alkaline फॉस्फेट और dextran चिह्नित पीसीटी क्षेत्रों (सफेद बिंदीदार लाइनों), tubul के लिए डबल सकारात्मक थे कि नलिकाओं: गुर्दे tubules लेबल संयोजन की तीन श्रेणियों से पता चलाalkaline फॉस्फेट के लिए सकारात्मक तों अकेले पीएसटी खंडों (पीले बिंदीदार रेखा) चिह्नित है, और बाहर का नलिकाओं बस यूके द्वारा लेबल थे (लाल बिंदीदार चित्रा 8A ई रूपरेखा). इसके अलावा, केवल डीबीए सकारात्मक नलिकाओं का प्रदर्शन शाखा अंक (चित्रा 8E). काश विश्लेषण करके, बाहर का इस विशिष्ट शाखाओं में बंटी पैटर्न, डीबीए सकारात्मक नलिकाओं डिस्टल छोटी नली क्षेत्रों (चित्रा 8F I) के लिए विशिष्ट हैं कि घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टर टेप के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ सहसंबद्ध. पूरे डिस्टल छोटी नली (डे और डीएल) के निशान जो clcnk, एन्कोडिंग देखिए गुर्दे में, व्यास में भरपूर मात्रा में पतले थे, और निहित शाखा अंक (काला नोक चित्रा 8F, 8F '). इसकी तुलना में, छोटी नली क्षेत्रों, क्रमशः, गुर्दे के नमूने में समग्र (8 चित्रा तुलना अभिव्यक्ति clcnk की तुलना में कम भरपूर मात्रा में थे डे और डीएल की मार्करों हैं जो slc12a1 या slc12a3, की अभिव्यक्ति से पता चला है कि जी और 8F, 8H). कभी, चित्रा (8G, 8G ') branched अगर', 8H ", 8H" slc12a3 व्यक्त कि छोटी नली क्षेत्रों में अक्सर विशिष्ट पिनव्हील की तरह व्यवस्था (चित्रा 8H, 8H में branched गया जबकि, 'इसके अलावा, slc12a1 व्यक्त कि छोटी नली क्षेत्रों, शायद ही कभी थे , काला तीर). अंत में, पीसीटी मार्कर slc20a1a और बाहर मार्कर clcnk के लिए डबल काश ये दाग (चित्रा 8i) अतिव्यापी नहीं थे कि पता चला है. विशेष रूप से, slc20a1a -expressing पीसीटी क्षेत्रों के हिस्सों पीएसटी इन क्षेत्रों (चित्रा 8i) के बीच स्थित है के बाद से उम्मीद थी जो -expressing नलिकाओं, clcnk से जुड़ी नहीं थे. साथ में ले ली, विशिष्ट जीन टेप के लिए dextran तेज, alkaline फॉस्फेट जेट, यूके, और इच्छा के साथ गुर्दे tubules लेबलिंग की assays, बाहर का खंडों बनाम समीपस्थ के प्रभेद सक्षम बनाता है.

हमेशा ">:" रखने together.within पृष्ठ = के लिए "टी चित्रा 1
वयस्क zebrafish गुर्दे में चित्रा 1 नेफ्रॉन शरीर रचना. (ए) वयस्क zebrafish गुर्दे और (बी) वयस्क और भ्रूण zebrafish नेफ्रॉन द्वारा प्रदर्शित खंड आणविक विशेषताओं की तुलना चार्ट के योजनाबद्ध चित्र. (ए) (ऊपर बाएं) वयस्क गुर्दा पृष्ठीय शरीर दीवार पर स्थित एक फ्लैट अंग है. एक उदर नजरिए से देखा (ऊपर दाएं), गुर्दे सिर, धड़ और पूंछ क्षेत्रों से मिलकर, एक विशिष्ट घुमावदार आकृति विज्ञान है, और भी संबद्ध melanocytes की एक सतह आबादी है. (नीचे बाएं) इज़ाफ़ा एक समीपस्थ छोटी नली, बाहर का छोटी नली, और वाहिनी द्वारा पीछा प्रत्येक एकल नेफ्रॉन एक छोर पर एक रक्त फिल्टर (वृक्क कणिका) के पास है जिसमें वयस्क zebrafish गुर्दे, में एक ठेठ नेफ्रॉन पेड़, का एक योजनाबद्ध दिखाता है. रंग योजनाबद्ध (बोttom सही) भ्रूण नेफ्रॉन (बी) के उन लोगों के साथ खंड विशेषताओं की तुलना करने के लिए एक वयस्क नेफ्रॉन पेड़ की एक रेखीय चित्र से पता चलता है. zebrafish भ्रूण नेफ्रॉन नीचे सूचीबद्ध संबंधित जीन की अभिव्यक्ति के साथ डोमेन समीपस्थ घुमावदार नलिका (पीसीटी), समीपस्थ सीधे छोटी नली (पीएसटी), बाहर का प्रारंभिक (डे), और बाहर का देर से (डीएल) शामिल है कि छोटी नली क्षेत्रों में होते हैं. भ्रूण की तुलना में एक उल्लेखनीय भेद कई नेफ्रॉन एक branched डीएल खंड के माध्यम से एकजुट किया जा सकता है, हालांकि वयस्क zebrafish में नेफ्रॉन, कमानी संरचना और घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टरों सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि जीन की अभिव्यक्ति डोमेन पर आधारित अनुरूप आणविक हस्ताक्षर एक समान है. यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

चित्रा 2 तरीकों अकेले या मिश्रित संयोजन में किया जा सकता है कि कैसे संकेत है इस प्रोटोकॉल में दर्शाया तरीकों के बीच संबंध का संकेत चित्रा 2 फ़्लोचार्ट मानचित्र. वयस्क zebrafish में लेबल लाइसिन-फिक्स dextran के intraperitoneal इंजेक्शन के बाद, गुर्दे एक में देखे जा सकते हैं पूरे अकेले या alkaline फॉस्फेट और / या यूके दाग के साथ संयोजन में, या तो तैयारी माउंट. वैकल्पिक रूप से, चयनित zebrafish गुर्दे ऊतकीय ऊतक एक cryostat साथ सेक्शनिंग के बाद जांच की जा सकती. वर्गों immunohistochemistry, परमाणु धुंधला हो जाना, डीबीए धुंधला का उपयोग, विशेषताओं के कई संयोजनों लेबल करने के लिए दाग, और / या alkaline फॉस्फेट जेट किया जा सकता है. इसके अलावा, गुर्दे वर्गों पीसीटी क्षेत्रों में लाइसिन-फिक्स dextran तेज की उपस्थिति के लिए सीधे देखे जा सकते हैं. अंत में, चयनित गुर्दे इच्छा का उपयोग जीन अभिव्यक्ति के spatiotemporal अभिव्यक्ति के लिए कार्रवाई की जा सकती है. Bracketed संख्या correspo का संदर्भ लेंप्रोटोकॉल भागों nding. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3 वयस्क zebrafish गुर्दे फ्लैट गुर्दे नेफ्रॉन की पीसीटी खंड में संयुग्मित dextran तेज कल्पना करने के लिए तैयार करने और आवेदन माउंट. अंग क्ले मॉडलिंग (गर्म गुलाबी रंग) के चार divots पर आराम कर रहा है कि ऊतक के शीर्ष पर रखा एक coverslip के साथ, एक गिलास स्लाइड पर फ्लैट तैनात किया गया है, जिसमें तैयारी माउंट फ्लैट एक गुर्दे नमूना, (ए) Brightfield छवि. यहाँ गुर्दे की तैयारी एक छोटा तुलना प्रदान करने के लिए एक मीट्रिक शासक के साथ imaged है. ठेठ वयस्क गुर्दे की पूंछ को सिर से लगभग 5-7 मिलीमीटर (मिमी) है. (बी) एक सख़्त की Brightfield छविगुर्दे की. काला रंजकता गुर्दे के सहयोग से पाया melanocytes के बिखरे आबादी से मेल खाती है, और महाधमनी गुर्दे के midline के साथ चलता है. नेफ्रॉन पीसीटी खंडों (सी) दृश्य 3 दिन 40 केडीए की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद dextran-fluorescein (FITC) , वयस्क गुर्दे की विरंजन के बिना. पीसीटी क्षेत्रों गुर्दे भर में देखा जाता है, लेकिन आंशिक रूप से melanocytes की वजह से छिप कर रहे हैं. (सी ') एक एकल नेफ्रॉन की डिजिटल जूम, melanocytes (सफेद तीर) के साथ. एक वयस्क गुर्दे (डी) छवि 3 दिन 10 केडीए की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद dextran फ्लोरो रूबी, गुर्दे, और विरंजन का निर्धारण. मेलानोसाईट रंजकता हटा दिया गया था और पीसीटी क्षेत्रों brightfield प्रकाश व्यवस्था के तहत dextran के उनके endocytic तेज पर आधारित यहां कल्पना थे. पेट से लिपिड बूंदों (तीर) कभी कभी गुर्दे ऊतक के नमूने के सहयोग से देखा जा सकता है. (डी ',' डी) प्रतिनिधिसरीखे छवियों पीसीटी क्षेत्रों के बीच मामूली रूपात्मक रूपांतरों को दर्शाती है. कई नेफ्रॉन PCTs कसकर (डी ') coiled कर रहे हैं, अन्य नेफ्रॉन (डी ") coiling न्यूनतम है कि पीसीटी क्षेत्रों में होते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
. चित्रा 4 वयस्क गुर्दे नेफ्रॉन पीसीटी छोटी नली खंड लेबलिंग wildtype zebrafish intraperitoneally एक एकल फ्लोरोसेंट dextran संयुग्म साथ इंजेक्शन थे; तो उनके गुर्दे 3 दिन पीसीटी दृश्य के लिए इंजेक्शन के बाद जांच की गई थी. (ए, ए ') Dextran झरना नीले, 10 केडीए (बी, बी') पीले dextran लूसिफ़ेर, 10 केडीए और (सी, सी ') dextran च luoro माणिक, 10 केडीए सभी preferentially गुर्दे नेफ्रॉन में पीसीटी क्षेत्रों लेबल. दोनों dextran झरना नीले और लूसिफ़ेर पीला शो लूसिफ़ेर पीला इलाज गुर्दे में मनाया काफी ज्यादा पृष्ठभूमि के साथ, नेफ्रॉन के बीच स्थित stromal सेल आबादी के कुछ गैर विशिष्ट लेबलिंग. इसके विपरीत, dextran फ्लोरो रूबी तीव्र पीसीटी लेबलिंग के साथ नाटकीय रूप से कम पृष्ठभूमि दिखाया. (डी, डी ') slc20a1a, पीसीटी ट्रांसपोर्टर सेल प्रकार की एक विशिष्ट मार्कर एन्कोडिंग टेप के स्थान का पता लगाने के लिए इच्छा से सना हुआ एक वयस्क गुर्दे. slc20a1a की अभिव्यक्ति डोमेन एक विभिन्न कसकर coiled / looped पीसीटी डोमेन के वितरण के साथ ही एक सुसंगत विस्तृत व्यास बताते हैं कि अधिक लम्बी पीसीटी हिस्सों के साथ, गुर्दे में मनाया dextran तेज की विशेषता पैटर्न से मेल खाता है. एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की.

ontent "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 5
चित्रा alkaline फॉस्फेट के लिए धुंधला के 5 प्रतिनिधि परिणाम, वयस्क zebrafish गुर्दे में एक अखिल समीपस्थ छोटी नली मार्कर, काश के साथ मूल्यांकन अन्य समीपस्थ छोटी नली मार्कर की तुलना में. (एसी) alkaline फॉस्फेट धुंधला (मरकत) पीसीटी और पीएसटी. (लोमो ') दोनों पर प्रकाश डाला, नेफ्रॉन समीपस्थ छोटी नली illuminates सूचीबद्ध जीन (बैंगनी धुंधला में प्रत्येक) के लिए एकल कामना करते हैं. (डी, डी') cubilin की अभिव्यक्ति पैटर्न एक अखिल समीपस्थ (पीसीटी-पीएसटी) मार्कर, ('डी, डी) alkaline फॉस्फेट के साथ संबद्ध करता है. इसकी तुलना में, mafba लिए इच्छा पीसीटी (ई, ई ') के निशान और slc13a1 पीएसटी (एफ, एफ निशान'). (सीजी "') slc20a1a <पीसीटी मार्कर के लिए दोहरे इच्छा में/ उन्हें> (लाल) और (बैंगनी) पीएसटी मार्कर slc13a1 इन मार्करों द्वारा चिह्नित क्षेत्रों ओवरलैप नहीं है कि पता चलता है, और एक नेफ्रॉन निकट (G'जी "') जांच कर रहे हैं जब उनकी अभिव्यक्ति डोमेन आसन्न पदों पर कब्जा बल्कि कि. काला तीर आम तौर पर छोटे बड़े से छोटी नली व्यास में एक परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है जो पीसीटी और पीएसटी क्षेत्रों के बीच जंक्शन, संकेत मिलता है, क्रमशः. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6 alkaline फॉस्फेट और वयस्क गुर्दे नेफ्रॉन की पीसीटी खंड में dextran तेज शो ओवरलैप, और alkaline फॉस्फेट धुंधला propidium आयोडाइड के साथ परमाणु सहयोग लेबलिंग के साथ संगत है. (ऐ) (एसी) विलय छवि और एक भी गुर्दे की काठी क्षेत्र के अलग छवियों. (डीएफ) alkaline फॉस्फेट अकेले पीएसटी लेबल जबकि और (सैनिक) विलय छवियों और उदाहरण नेफ्रॉन की अलग छवियों के दो सेट. (आई) cryosection विश्लेषण, alkaline फॉस्फेट और (सफेद डॉट्स में उल्लिखित) पीसीटी क्षेत्रों में dextran फ्लोरो रूबी के सह लेबलिंग की पुष्टि खंड (पीले डॉट्स में उल्लिखित). (किमी) एक गुर्दा था(कश्मीर) alkaline फॉस्फेट (मरकत) और (एल) propidium आयोडाइड (बैंगनी), (एम) को सक्रिय करने के साथ लेबल क्रमशः. समीपस्थ छोटी नली कोशिकाओं और उनके नाभिक, के दृश्य विलय कर इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
7 चित्रा alkaline फॉस्फेट और डीबीए परस्पर वयस्क zebrafish गुर्दे नेफ्रॉन में मौजूद क्रमश: अखिल समीपस्थ और अखिल बाहर का क्षेत्र, निशान कि विशेष खंड लेबल, कर रहे हैं. (मुख्यालय) alkaline फॉस्फेट और rhodamine-डीबीए के साथ दाग एक zebrafish गुर्दे की साबुत माउंट तैयारी. Alkaline फॉस्फेट (मरकत) और यूके (लाल) गुर्दे में ओवरलैप नहीं दिखाते. क्षारीय phospha की पृष्ठभूमि स्तरTASE वजह से उनकी विस्तृत व्यास को विशिष्ट हैं जो प्रत्येक गुर्दे (तारक, *), में प्रमुख एकत्रित नलिकाओं की जोड़ी रोशन. डीबीए सकारात्मक नलिकाओं व्यास में पतले हैं और शाखा अंक (सफेद तीर) की मौजूदगी से अक्सर होती है. (एसी) छवि और एक भी गुर्दे की काठी क्षेत्र के अलग छवियों विलय कर दिया. (डीएफ) विलय छवियों और के अलग छवियों का एक सेट उदाहरण नेफ्रॉन. (जी, एच) अतिरिक्त उदाहरणों, alkaline फॉस्फेट सकारात्मक नलिकाओं के साथ branched डीबीए नलिकाओं, साथ छवियों विलय कर दिया. (आई) cryosection विश्लेषण alkaline फॉस्फेट और डी बी लेबल अलग छोटी नली वर्गों, और केवल दुर्लभ नलिकाओं न तो लेबल दिखाने पुष्टि की है कि (सफेद तीर ), कि छोटी नली के लिए खंड के कोण की संभावना की वजह से. इस विश्लेषण के लिए, wildtype ट्रांसजेनिक मछली, टीजी: enpep: EGFP, इस्तेमाल किया गया और यह गुर्दे में गुर्दे tubules के सभी GFP का पता लगाने के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ immunolabeled गया (जे). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 8
बाहर का खंड इच्छा विश्लेषण की तुलना में dextran तेज, alkaline फॉस्फेट, और यूके के साथ वयस्क गुर्दा cryosections की संख्या 8 ट्रिपल लेबलिंग. (एई) वयस्क गुर्दे intraperitoneally dextran-FITC (हरा) के साथ इंजेक्शन, और गुर्दे एम्बेड और cryosectioning के लिए 3 दिन बाद एकत्र किए गए थे. Alkaline फॉस्फेट जेट और dext के लिए सकारात्मक थे कि पीसीटी क्षेत्रों: alkaline फॉस्फेट (मरकत) और यूके (लाल) के साथ धुंधला नलिकाओं के तीन आबादी का पता चला(सफेद डॉट्स में उल्लिखित) भाग गया, केवल (पीले डॉट्स में उल्लिखित) alkaline फॉस्फेट जेट, और भी लक्षण बाहर शाखा अंक से पता चला है जो केवल (लाल डॉट्स में उल्लिखित) डी बी ए के लिए सकारात्मक थे कि बाहर का छोटी नली क्षेत्रों के लिए सकारात्मक थे कि पीएसटी खंडों. ( ई) विलय छवि और एक उदाहरण खंड के अलग छवियों. (ई) विलय एक और उदाहरण खंड की छवि. एकल (एफ एच से बाहर का छोटी नली जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के (एफआई) तुलना '") और डबल (मैं) इच्छा. (एफ एच ') सूचीबद्ध जीनों के लिए एकल इच्छा (बैंगनी धुंधला में प्रत्येक). (एफ, एफ') clcnk की अभिव्यक्ति पैटर्न, अखिल बाहर (डे डीएल) मार्कर, शाखा अंक निहित है कि पतली नलिकाओं में पता चला था (काला नोक). (जी, जी ') इसकी तुलना में, slc12a1 के लिए इच्छा का पता चला कोई शाखा अंक के साथ डे के निशान, और (एच एच' ") <उन्हें> slc12a3 डीएल, गुर्दे अंग (काला तीर) भर में कई शाखा अंक की विशेषता खंड के निशान. पीसीटी मार्कर slc20a1a (लाल) और अखिल बाहर का clcnk (बैंगनी) के लिए (मैं) डबल कामना करते हैं. इन मार्करों द्वारा चिह्नित क्षेत्रों ओवरलैप नहीं है, और न उनकी अभिव्यक्ति डोमेन ऐसे व्यक्ति पीसीटी coils (ठीक नीचे) कि गैर आसन्न पदों पर कब्जा डिस्टल नलिकाओं abut नहीं करते, और बाद असतत स्थानों पर कब्जा और काले (नोक बानगी शाखा अंक के अधिकारी ). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

यहाँ, हम वयस्क zebrafish में नेफ्रॉन खंड घटकों के दृश्य है कि सक्षम तरीकों का वर्णन किया है. फ्लोरोसेंट dextran conjugates इंजेक्शन इन समीपस्थ छोटी नली कोशिकाओं 30,38 के endocytic गुणों के कारण तरजीही पीसीटी लेबलिंग सक्षम बनाता है. इस विधि के कारण अलग फ्लोरोसेंट conjugates के एक bevy के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि dextrans के अस्तित्व के महान लचीलेपन के साथ किया जा सकता है. माध्यमिक लेबलिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है के रूप में इसके अलावा, लाइसिन-फिक्स dextrans का उपयोग, पीसीटी क्षेत्रों लेबल करने के लिए एक विशेष रूप से सुविधाजनक तरीका है. यह अपेक्षाकृत सरल संकेत का पता लगाने में सक्षम बनाता है और कई अन्य फ्लोरोसेंट लेबल, immunolabeling, और ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों के उपयोग के साथ संगत है. Alkaline फॉस्फेट लेबलिंग भी पीएसटी में पीसीटी में मजबूत जेट और थोड़ा कमजोर जेट के साथ, समीपस्थ छोटी नली के निशान. अंत में, डीबीए धुंधला एक चर्चा प्रदर्शित जो बाहर का छोटी नली क्षेत्रों की लेबलिंग सक्षम बनाता हैaracteristic आकारिकी branched. Nonimmune मूल के चीनी बाध्यकारी प्रोटीन होते हैं जो विभिन्न लेक्टिन अणु, स्तनधारी नेफ्रॉन खंडों 47 भेद करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. यह स्तनधारी गुर्दे 47 में एकत्रित नलिकाओं चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में zebrafish में यूके, डिस्टल छोटी नली क्षेत्रों के साथ संबद्ध है कि दिलचस्प है.

साथ में ले ली, इन तरीकों गुर्दे की संरचना और समारोह दस्तावेज़ के लिए विभिन्न संयोजनों में उपयोग किया जा सकता है. इन तरीकों के सभी पूरे गुर्दे की तैयारी में इस्तेमाल किया जा सकता है, वे पूरी तरह से अधिक समय लेने वाली, कठिन तरीकों, जैसे, cryosection काम और immunolabeling के उपयोग पर निर्भर बिना अंग भर नेफ्रॉन संरचना और समारोह का मूल्यांकन करने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं. हालांकि, इस तरीके आलेख में वर्णित दाग cryosection में सक्षम हैं. Cryosection विश्लेषण immunohistochemistry विशिष्ट pepti का पता लगाने के लिए बेहतर अनुकूल हैं कि (पूरे माउंट की तुलना में) के नमूने उत्पन्नडेस, ज़ाहिर है, हालांकि विश्लेषण के इस प्रकार के उचित प्राथमिक एंटीबॉडी की उपलब्धता की आवश्यकता है. दुर्भाग्य से zebrafish पशु मॉडल के साथ काम करने में एक प्रमुख सीमा एंटीबॉडी की गरीब उपलब्धता बनी हुई है. इस प्रकार करना चाहते हैं, यानी, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल बनी हुई है 'जाने के लिए' जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए प्रक्रिया. बैंगनी या लाल अवक्षेप निर्माण करने के लिए BCIP, एनबीटी, और / या INT सब्सट्रेट प्रतिक्रियाओं उपयोग करते हुए इच्छा cryosections पर फ्लोरोसेंट धुंधला के साथ संगत नहीं है. एक विकल्प फ्लोरोसेंट इच्छा का पता लगाने, zebrafish भ्रूण के नमूने के लिए अनुकूलित किया गया है और वयस्क गुर्दे के साथ प्रयोग के लिए सिलवाया जा सकता है कि एक प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए आह्वान किया जाएगा. इस वीडियो लेख में विधियों का विवरण व्यक्तिगत खंडों ऐसे EGFP या mCherry के रूप में एक पत्रकार के साथ चिह्नित कर रहे हैं जिसमें ट्रांसजेनिक Zebrafish लाइनों के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट इच्छा की तरह तकनीक के साथ आगे प्रयोग के लिए अनुमति चाहिए. वैकल्पिक रूप से, तरीकों यहाँ coul वर्णितअन्य महत्वपूर्ण रंजक, जैसे, अन्य lectins साथ संयोजन में परीक्षण किया जाना चाहते हैं. इस प्रकार, आगे अनुकूलन और यहां वर्णित विधि का विस्तार पूरे माउंट गुर्दे की तैयारी और विश्लेषण के लिए अनुसंधानकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए लागू किया जा सकता है.

जैसे, इन तरीकों चल रही उत्थान के अध्ययन के लिए zebrafish मॉडल के साथ लागू करने के लिए और भी आनुवंशिक रोग मॉडलिंग में व्यापक क्षमता है. गुर्दे की वेदनाओं के लिए नवीन अनुसंधान और उपचार के लिए एक दबाने की जरूरत नहीं है. लाखों लोग, जन्मजात तीव्र, और / या पुरानी कारणों से यह परिणाम है कि हर साल गुर्दे की बीमारी के कुछ फार्म से पीड़ित हैं. इसके अलावा, गुर्दे की बीमारी की व्यापकता इन रोगों एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा 14,15, जिससे दुनिया भर में वृद्धि जारी है. एक बाहरी डायलिसिस मशीन उनके गुर्दे इस भूमिका को करने में सक्षम नहीं हैं, तो चयापचय अपशिष्ट का एक रोगी के रक्त से मुक्त करने में कार्य करता है जिससे इस तरह के हेमोडायलिसिस के रूप में उपचार उपलब्ध हैं. दुर्भाग्यचल रहे इलाज के अस्तित्व के लिए आवश्यक है, के रूप में इस हस्तक्षेप, सीमाएँ हैं. इसके अलावा, रोगियों अंततः एक मरीज को एक प्रतीक्षा सूची पर रखा गया है एक बार प्राप्त करने के लिए साल लग सकते हैं, जो एक गुर्दा प्रत्यारोपण की आवश्यकता होगी. यहां तक ​​कि एक गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्त करने के बाद, कई रोगियों की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में प्रतिकूल प्रभाव पीड़ित हैं और अपने जीवन के आराम के लिए इन प्रभावों लड़ाई चाहिए. इन कठिनाइयों गुर्दे की बीमारी को रोकने या शायद ऊतक उत्थान 8,16,52,53 बढ़ाने के लिए मदद करने के लिए या तो उपन्यास उपचार के विकास के लिए गंभीर जरूरत प्रदर्शित करता है. जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में मानव परीक्षण विषयों के उपयोग की स्पष्ट नैतिक सीमाओं को देखते हुए, पशु मॉडल मानव रोग रोगजनन के अध्ययन के लिए और नए उपचार के परीक्षण के लिए आवश्यक हैं. इसकी संरचनात्मक समानता और विकासवादी निकटता का एक परिणाम के रूप में, माउस मानव रोग 45 की सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल बन गया है. हालांकि, इस जानवर के साथ कुछ सीमाएं समेत, कर रहे हैंअसमर्थता आईएनजी विवो और बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन को पूरा करने की व्यावहारिकता में अंग विकास की कल्पना करने के लिए. Zebrafish मानव रोग 45,46 के अंग विकास और मॉडलिंग के अध्ययन के लिए एक प्रासंगिक और उपयोगी मॉडल जीव हैं. मानव रोग के संबंध में, zebrafish में कार्यात्मक homologs सभी मानव जीन 54,55 का लगभग 70% के लिए मौजूद हैं.

हाल ही में काम गुर्दे अनुसंधान 31,37,56 के कई क्षेत्रों के लिए zebrafish की उपयोगिता पर प्रकाश डाला गया है. अकी के बाद zebrafish में उत्थान और मरम्मत का अध्ययन छोटी नली उपकला उत्थान और neonephrogenesis होते हैं और 30,37 timecourse उत्थान भर में ओवरलैप है कि दो प्रक्रियाओं हैं कि सुझाव. एक aminoglycoside एंटीबायोटिक बुलाया जेंटामाइसिन का उपयोग वयस्क zebrafish 29,30,37 में अकी के परिणामों का अध्ययन करना है जिसके माध्यम से एक चोट प्रतिमान के रूप में उपयोग किया गया है. जेंटामाइसिन से एक लगभग दो सप्ताह की अवधि निम्नलिखित चोट ओवर, समीपस्थ tubulतों पुनर्जन्म, और इस बीच नई नेफ्रॉन अंग 29,30,37 भर के रूप में. सामान्य तौर पर, उपकला उत्थान को विनियमित तंत्र है कि अत्यधिक विवादास्पद रहते हैं. मरम्मत की प्रक्रिया का एक प्रस्तावित तंत्र में, लुमेन में मृत कोशिकाओं के sloughing द्वारा पीछा प्रारंभिक गंभीर चोट घटना है. अगला, नई कोशिकाओं को अलग जिसके बाद de-भेदभाव, प्रसार, और प्रवास की घटनाओं की एक श्रृंखला, घायल तहखाने झिल्ली repopulating और घायल साइट के लिए समारोह बहाल है. वैकल्पिक रूप से, अन्य अध्ययनों प्रतिस्थापन कोशिकाओं नेफ्रॉन नलिकाओं के भीतर रहते हैं कि स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से पैदा होती है कि सुझाव दिया है. Zebrafish में neonephrogenesis की प्रक्रिया का संबंध है, सेलुलर समुच्चय जेंटामाइसिन इंजेक्शन 29,30 से निम्नलिखित अकी मनाया गया है. इन समुच्चय बाद में पहले से ही विद्यमान नलिकाओं 29,30 में साहुल कि नया नेफ्रॉन में परिपक्व. नेफ्रॉन उपकला उत्थान और neonephr एकजुट करती है कि आम धागाogenesis उनके सरासर रहस्य कारक है: वर्तमान में इन पुनर्योजी कारनामों उपलब्ध अंतर्दृष्टि वहाँ से पाए जाते हैं के बारे में कैसे तेजी से अधिक सवाल कर रहे हैं.

तिथि करने के लिए, हालांकि, सबूत के कई रोमांचक लाइनों zebrafish का उपयोग गुर्दे उत्थान अनुसंधान वास्तव में भी प्रत्यक्ष translational क्षमता 56-58 हो सकता है कि मानव अकी में प्रासंगिक तुलनात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि धारणा का समर्थन है. रासायनिक स्क्रीनिंग हाल ही में हिस्टोन deacetylase अवरोध मिथाइल-4 (phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56,57 की पहचान करने के लिए नेतृत्व zebrafish भ्रूण में गुर्दे पूर्वज कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ाने कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए. जेंटामाइसिन प्रेरित अकी के साथ zebrafish लार्वा को इस परिसर के प्रशासन लार्वा अस्तित्व में वृद्धि हुई है और यह कि गुर्दे ट्यूबलर प्रसार 56,58 बढ़ाया गया था कि पता चला. मध्यम ischemia प्रेरित अकी के साथ चूहों m4PTB साथ इलाज किया गया, उनकी वसूली Assoc में त्वरित किया गया थागुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं 58 proliferating के दोनों ट्यूबलर शोष और सेल चक्र गिरफ्तारी में कमी के साथ iation. इन निष्कर्षों को सामान्य zebrafish गुर्दे विकास और / या अकी पुनर्योजी प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार रास्ते स्तनधारियों 56 से संरक्षित किया जाएगा कि सुझाव.

इस प्रकार, आगे के अध्ययन को शामिल किया जाता है कि संकेत दे रास्ते की पहचान और उनकी बातचीत-zebrafish नेफ्रोलॉजी क्षेत्र में इस महत्वपूर्ण लक्ष्य का पीछा करने के लिए एक वादा अवसर प्रदान करता है समझने के उत्थान-अर्थात् के तंत्र अलग तंग करने की जरूरत है, जबकि. ऐसे में इस प्रोटोकॉल में वर्णित नेफ्रॉन सेल लेबल के रूप में उपकरण अकी मॉडल में गुर्दे की रचना और कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि assays के एक समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, वे गुर्दे की बीमारी के ट्रांसजेनिक मॉडल को चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है और गुर्दे बांध के बाद नेफ्रॉन संरचना की बहाली को बढ़ावा देने में सक्षम रसायन चिकित्सा विज्ञान की पहचान करने के लिए तरीके प्रदान कर सकता हैउम्र.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के बाद से रॉ को धन के द्वारा समर्थित किया गया था: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237 अनुदान; ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुदान पुरस्कार # 5 FY12-75 के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज विश्वविद्यालय से धन शुरू; और Gallagher परिवार की ओर से एलिजाबेथ और माइकल Gallagher से नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के एक उदार उपहार स्टेम सेल शोध को बढ़ावा. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारी धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके बकाया समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. अंत में, हम इस काम के बारे में उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और अंतर्दृष्टि के लिए हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20 American Bioanalytical AB02038
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. 
Fine Forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55 
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost 
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder Thermo-Fisher 12-587 Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution Bleach mix formula (for a 20 ml solution):
1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution
0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution
100 μl of 20% Tween
Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide Sigma 221473
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Blocking solution Blocking Solution (for a 10 ml solution):
8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween
2 ml of fetal calf serum
150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection Invitrogen E6601 We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. 
Alkaline phosphatase wash solution Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):
5 ml of 0.5 M EDTA
120 mg of Levamisole
95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW Invitrogen D1844 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW Invitrogen D1976 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW Invitrogen D1825 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW Invitrogen D1817 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine Vector laboratories RL-10-32 DBA Staining Solution (for a 100 μl solution):
1 μl of DBA
99 μl of 1X PBS
Propidium iodide Invitrogen E6601
DAPI Invitrogen P1304MP
Vectashield hard set mounting medium Vector laboratories H-1400
Micro cover glass VWR 48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO American Bioanalytical 67-68-5
Sucrose Sigma S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502
Levamisole Sigma L-9756
Tissue freezing medium Triangle Biomedical Sciences, Inc. TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm Sakura Finetek 4565
TruBond 380 adhesive microscope slides Tru Scientific 0380W
Liquid blocker – super PAP pen Electron Microscopy Sciences 71312
Immuno stain moisture chamber Evergreen Scientific 240-9020-Z10
Cryostat Therm Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope Nikon SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. 
Compound microscope Nikon 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
  2. Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
  4. Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
  5. Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
  6. Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
  7. Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
  8. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11 (2013).
  9. Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
  10. Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
  11. Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
  12. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  13. Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
  14. Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
  15. El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
  16. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
  17. Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
  18. Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
  19. Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
  20. Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3 (2009).
  21. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  22. Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
  23. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  24. Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
  25. Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
  26. Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
  27. Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
  28. Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
  29. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  30. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  31. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  32. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189 (2007).
  33. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  34. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  35. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  36. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
  37. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  38. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
  39. Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
  40. Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
  41. Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
  42. Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
  43. Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
  44. Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
  45. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  46. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  47. Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
  48. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  49. Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
  50. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. e51604 (2014).
  51. Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
  52. Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
  53. Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  54. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  55. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  56. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1, (3), (2013).
  57. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
  58. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).
वयस्क zebrafish गुर्दे में नेफ्रॉन संरचना और समारोह के विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).More

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter