Summary
Ensaio de adesão estático é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para modelar as interacções entre linfócitos T e de outros tipos de células. Interacções são geradas por injecção de células T marcadas em poços revestidos com moléculas de adesão, enquanto que um leitor de placa é utilizada para quantificar o número de células aderentes a seguir lavagens em série.
Abstract
Adesão de linfócitos T é necessária para várias funções das células T, incluindo a migração para os locais de inflamação e formação de sinapses imunológicas com células apresentadoras de antigénios. As células T realizar adesão regulada através do controlo das propriedades adesivas de integrinas, uma classe de moléculas de adesão celular que consistem de pares heterodiméricas de proteínas transmembranares que interagem com moléculas-alvo de células parceiras ou matriz extracelular. O mais proeminente a integrina da célula T é a função dos linfócitos antigénio associado (LFA) -1, composta por subunidades aL e β2, cujo alvo é a molécula de adesão intracelular (ICAM) -1. A capacidade de uma célula T para controlar a aderência deriva da capacidade para regular os estados de afinidade de integrinas individuais. Sinalização dentro para fora descreve o processo pelo qual os sinais dentro de uma célula com que os domínios externos de integrinas para assumir um estado activado. Muito do nosso conhecimento destes fenómenos complexos é baseada na mecânicaEstudos realizados em simplificada em sistemas de modelo in vitro. O ensaio de adesão de linfócitos T descrito aqui é uma excelente ferramenta que permite que as células T para aderir a moléculas alvo, sob condições estáticas, e, em seguida, utiliza um leitor de placas fluorescente para quantificar a adesividade. Este ensaio tem sido útil na definição de substâncias de adesão-estimulador ou inibidor que actuam sobre os linfócitos, assim como a caracterização dos eventos de sinalização envolvidos. Embora descrito aqui para LFA-1 - ICAM-1 de adesão mediada; este ensaio pode ser facilmente adaptada para permitir o estudo de outras interacções adesivas (por exemplo, VLA-4 - fibronectina).
Introduction
Linfócitos T aderência é um processo fundamental para a resposta imune 1. É necessário para a interacção das células T com as células endoteliais decoração nas paredes dos capilares, para o antigénio de células apresentadoras de varrimento (APC) dentro de nódulos linfáticos, e para a formação de sinapses imunológicas (IS), com células-alvo 2. Estes requisitos são funcionalmente e cineticamente distintas. O processo de linfócitos extravasamento consiste quimioatração, rolamento, adesão firme e transmigração. A transição a partir de rolamento para firmar aderência requer as células T de responder a um sinal de receptor acoplado a proteína G rapidamente. Esta resposta produz uma interação ligante integrina que retarda e prisões da célula de rolamento 3. Uma mudança imediata na avidez integrina medeia este processo. A migração requer interacções betweenTcells dinâmicos e células endoteliais com a formação de aderências no 'front end "e quebra de aderências no' extremidade traseira 'com um intervalo de cerca de um minuto entre a formação e quebra 4. O IS constitui inminutes, mas precisa permanecer intacta por horas 6.
Curiosamente, uma molécula de adesão, a função de membro da família de linfócitos integrina antígeno associado (LFA) - 1, é essencial para todos estes processos 5. LFA-1 medeia a adesão através de interacções com vários membros da superfamília das imunoglobulinas. O ligando mais extensivamente estudado com a mais elevada afinidade para o LFA-1 é a molécula de adesão intercelular (ICAM) -1. Linfócitos circulantes não-activadas expressam baixa afinidade de LFA-1 na superfície das células, e, por conseguinte, não são capazes de aderir a superfícies revestidas de ICAM-1. LFA-1 é de afinidade variável e regulada por vários eventos de sinalização, tais como a proteína G acoplado a activação do receptor, estimulação de citoquinas, e os sinais mediados pelos receptores das células T (TCR). A forma de afinidade elevada, resultante da LFA-1 transmite activação intracelular para o espaço extracelular tinteracções hrough com ICAM-1. Este caminho é chamado de dentro para fora sinalização 7. Do mesmo modo, a sinalização através de LFA-1 a partir do espaço extracelular é chamado de fora para dentro de sinalização.
O cascatas de sinalização intracelular envolvidas na de dentro para fora e de fora para dentro de sinalização são um grande foco de pesquisa atual. A pequena GTPase Rap1 surgiu recentemente como o componente chave de dentro para fora sinalizando que é comum a ambos ligadura TCR e citocina sinalização 8. O papel crítico da Rap1 na activação de integrina é realçada pela descoberta de que a sobre-expressão de Rap1 estimula a adesão dependente de integrina de células T, enquanto que a adesão de células T é bloqueada através da expressão de Rap1 dominante negativa 9. Esses avanços em nossa compreensão da regulação integrina por Rap1 ter sido realizado utilizando em ferramentas vitro. Entre elas, está o ensaio de adesão estático descrito aqui.
O objetivo geral deste método é estudar Tadesividade de células a ICAM-1 as superfícies revestidas. Mais especificamente, é utilizado para medir e quantificar objectivamente LFA-1 de afinidade para com os seus ligandos de contador em células vivas em tempo real, sob diferentes condições. Esta técnica utiliza poços de poliestireno revestidas com ICAM-1, para imitar as superfícies celulares que as células T interagem com. Muitos ensaios de adesão de células T estático anteriormente descritos foram experimentalmente complexo. Estes ensaios frequentemente requeridos para as células T a ser marcado radioactivamente, utilizado células da córnea de bovino em cultura para criar uma matriz extracelular como o substrato para a aderência das células T, ou chamados para a estimulação não-fisiológico de células T durante um período prolongado para promover a adesão de células T 10. A utilização de medição fluorométrico para quantificar as células T após a incubação de adesão é um método mais sensível e precisa de quantificação, em comparação com a citometria de fluxo e microscopia, que são utilizados em muitos outros sistemas de ensaio 11. Além disso, uma única célula microscopic análise de integrina localização não permite a ampla, a análise da população com base na mesma maneira como a medição f luorométrica. Enquanto que os anticorpos específicos do Estado de LFA-1 de activação estão comercialmente disponíveis, estes anticorpos oferecer uma baixa sensibilidade em relação com o método descrito aqui. A principal vantagem sobre as técnicas alternativas é a sua simplicidade e a capacidade de analisar múltiplas condições experimentais simultaneamente. Ao considerar este método para uma aplicação específica, deve-se levar em conta que as células T devem ser selecionados de forma negativa, recentemente isolado, e marcadas com um marcador fluorescente.
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Protocol
1. O revestimento das microplacas Poços
Nota: O objectivo deste passo é o de revestir as superfícies de poliestireno com ICAM-1 e servem como ligandos para as células T LFA-1.
- Prepare as seguintes soluções:
- Preparar a solução de revestimento por ressuspensão recombinante de ICAM-1 com a solução (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) tampão fosfato salino enriquecido com cálcio (1 mM CaCl2) e magnésio (2 nM de MgCl 2). Certifique-se de que a concentração final de ICAM-1 é de 10 ug / ml, feito a partir de uma solução de estoque de 0,7 mg / ml e mantidas em um congelador a -80 ° C.
- Preparar a solução de adesão, através do enriquecimento de PBS com 0,5% de humano (ou de bovino) de albumina sérica humana (HSA / BSA), MgCl2 2 mM, e 1 mM de CaCl2.
- Preparar a solução de lavagem através da adição de 2 mM de MgCl2 e 1 mM de CaCl2 a PBS. Aqueça todas as soluções para 37° C antes do uso.
- Lavar as placas com 24 poços com 50 mL de solução de lavagem. Isso irá incluir poços não lavados, (PMA) trataram células positivas e (poços não revestidos) negativos controles. Para cada condição de definir pelo menos três poços (triplas).
- Adicionar 50 ul de solução de revestimento, para cada poço. Não adicione aos poços de controlo não revestidos. Incubar durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora.
- Aspirar suavemente a solução de revestimento, sem que a ponta para tocar no fundo dos poços. Lavar uma vez com 50 ul de solução de lavagem.
- Adicionar 50 ul de solução de adesão e incubar a microplaca durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora.
- Aspirar suavemente e lave uma vez com 50 mL de solução de lavagem. Usar a placa no mesmo dia, no entanto, é possível manter a 4 ° C durante a noite, e usá-lo no dia seguinte.
2. T o isolamento de células a partir de sangue
- Adicionar humano T enriquecimento célula coquetel em 50 ul / ml of sangue inteiro (por exemplo por 3 ml de anticoagulante (heparina, EDTA, ou citrato) de sangue total, adicionar 150 mL de cocktail). Misture bem.
- Incubar 20 min a temperatura ambiente.
- Para um tubo de centrífuga de 50 ml adicionar 3 ml de sangue tratado e um volume igual de PBS (sem cálcio e magnésio) enriquecido com 1% de D-glucose, à temperatura ambiente. Misture delicadamente com uma pipeta Pasteur.
- Adicionar 15 ml de Ficoll-Paque PLUS para o tubo de centrífuga.
- Camada cuidadosamente os 6 ml diluído amostra de sangue no meio de isolamento de linfócitos.
- Centrifugar a 400 xg por 20 min a 20 ° C, com pausa fora.
- Decantar a camada superior com uma pipeta de Pasteur limpa, deixando a camada de linfócitos não perturbada na interface. Se a camada superior de plasma pode ser guardado para uso posterior. Utilizando uma pipeta de Pasteur limpa transferir a camada de linfócitos para um tubo de centrífuga limpo.
- Adicionar 3 volumes (9 ml) de PBS para os linfócitos. Suspender as células suavemente draala-los dentro e para fora de uma pipeta de Pasteur.
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Remover o sobrenadante. Os linfócitos deve agora ser suspensos no meio apropriado para a aplicação. Transferência das células para um balão de cultura T-75, em 20 ml de RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina.
3. Preparação das Células
Nota: Um pré-requisito é de que as células a ser marcado com um reagente fluorescente. Neste protocolo usar carboxi éster succinimidyl fluoresceína (CFSE), proteína fluorescente no entanto verde (GFP) são células que expressam uma alternativa aceitável.
- Contagem de 2,4 x 10 6 células T (1 x 10 5 para cada poço) usando um hemocitômetro.
- Ressuspender as células em meio de cultura sem soro (privação de soro). Incubar as células durante 2 horas na incubadora a 37 ° C.
- Centrifugar as células durante 5 min (400 xg). Aspirar a mídia eressuspender em 1 ml de PBS.
- Adicionar CFSE em 1:1.000 diluição (estoque feito para 5 mM). Cubra de luz e incubar durante 8 minutos à temperatura ambiente.
- Parar a reacção por adição de 10 ml de 37 ° C, PBS e girar a 400 xg durante 5 min.
- Re-suspender a pelete de células com 1,2 ml de solução de adesão pré-aquecido (1 x 10 5 células por 50 pi).
4. Estimulação das células
Nota: Para iniciar a adesão, as células devem ser estimuladas. Na experiência seguinte, as células são estimuladas através do TCR utilizando anticorpos anti-CD3 de reticulação, no entanto, solúveis SDF-1 pode servir como uma alternativa. Dependendo do objetivo dos experimentos, vários reagentes farmacológicos pode ser adicionado antes ou durante a estimulação para estudar o impacto na adesão celular. Forbol miristato acetato de forbol (PMA) é um éster de forbol que é estruturalmente semelhante ao do segundo mensageiro diacil glicerol (DAG) e, por conseguinte, activa quinase múltiplas a jusante do TCR (principalmente proteína cinase C); aqui é usado como um controlo positivo.
- Aquece-se a microplaca a 37 ° C.
- Dividir as células em 8 vazios tubos de 1,5 ml (150 ul em cada tubo), um tubo para cada condição.
- Tratar as células em conformidade:
- Estimular um tubo com PMA a 10 ng / ml para servir como controlo positivo. Mantenha três tubos sem tratamento, para servir como controle de estímulo ("nenhum estímulo"), controle de carga sujo ("sem lavagem"), e controle para ICAM-1 revestimento ("sem revestimento").
- Estimular quatro tubos com diferentes concentrações de anticorpos anti-CD3 (0,1, 1, 5, e 10 ug / ml). Continue para a próxima etapa, sem atrasos.
- Alíquota de 50 mL de mistura de células estimuladas em cada poço vazio. O número final de células por cavidade é de 1 x 10 5.
- Coloque a microplaca na incubadora 37 ° C por 15 min.
Nota: Algumas linhas de células T requerem menor estimulação tempo ção. Durante este tempo, as células vão estabelecer-se para o fundo dos poços e aderir aos ligandos-alvo.
5. Lavar células não aderentes
Nota: O objetivo deste passo é remover as células que não foram capazes de formar contactos estreitos com as superfícies recobertas pelo ligante. Usar uma pipeta de canais múltiplos para este passo, a fim de assegurar que as mesmas forças físicas são aplicados a todos os poços. É importante manter os poços de controlo indicados unwashed para auxiliar no cálculo da percentagem de células aderentes.
- Adicione 150 ml de solução de aderência quente para cada poços. Agitar a placa suavemente durante alguns segundos antes de remover o meio dos poços. Não toque no fundo dos poços com as pontas.
- Repita este passo três vezes. Mude a direção da pipeta ao pipetar o buffer de entrada e saída.
6. Determinação da percentagem de células aderentes
_content "> Nota: Neste passo um leitor de placas de fluorescência é usado para medir a intensidade de fluorescência dentro de cada poço a intensidade está em correlação directa com o número de células aderentes..- Ligue o leitor de placas. Abra o software leitor de placas, clicando no ícone de atalho na área de trabalho.
- No menu "Tarefas", clique em "Novo" para criar um novo protocolo.
- A partir do menu "Ações", escolha a opção "Read". Clique em "A intensidade de fluorescência" e clique na aba "Ok".
- A partir do menu drop-down selecione "comprimento de onda de excitação 485" e "Emissão de comprimento de onda 528". Hit na guia "Ok".
- No menu de opções "Óptica", selecione "Bottom" e clique na aba "Ok". Volte ao menu "Ações" e definir a temperatura a 37 ° C e clique em "Ok".
- Insira a microplaca no leitor de placa eclique em "Executar". O resultado será exportado para planilha excel.
- Calcula-se a percentagem de células aderentes utilizando a seguinte fórmula: Percentagem de células aderentes = (média intensidade de fluorescência lida em poços lavados) / (média intensidade de fluorescência lida em células não lavadas) x 100%.
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Representative Results
Abaixo está um exemplo de ensaio de adesão usando células T primárias estimuladas com várias concentrações de anticorpos anti-CD3. É útil saber a fluorescência das células não lavadas (isto é, a carga total). As células não estimuladas servir como um controle negativo e células tratadas com PMA são o controlo positivo para anticorpos anti-CD3. As células plaqueadas em poços não-revestidos servir como um controlo para a ICAM-1. Numa experiência típica, a percentagem de células tratadas com PMA aderentes é entre 40% a 50%, enquanto a percentagem de células não estimuladas é entre 5% a 10%. Um método alternativo de quantificar a aderência celular é por vezes de aumento de cálculo da intensidade de fluorescência em cada estado durante a de células não estimuladas.
A Tabela 1 mostra a intensidade de fluorescência de CFSE marcado células T primárias estimuladas com diferentes doses de anticorpos anti-CD3 solúvel e semeadas em ICAM-1 poços revestidos. Figura 1 mostra im representanteidades de experiência semelhante. As células foram seleccionadas negativamente a partir do sangue periférico. Após a privação de soro, durante 2 horas, com 2,4 x 10 6 as células foram marcadas com CFSE seguido por estimulação com anticorpos anti-CD3 solúvel em várias concentrações. As células estimuladas foram plaqueadas em ICAM-1 cavidades revestidas e incubaram-se durante 15 min no escuro. Após incubação, as células não aderentes foram lavadas três vezes e a intensidade de fluorescência foi medida utilizando um leitor de placas a 485 nm. PMA tratadas e células não estimuladas foram utilizados como controlos. Note-se que a primeira coluna (1A-1C) contém células que não foram lavados (carga total, por exemplo, 100%).
A Figura 2 mostra a percentagem de adesão das células T, calculada com base nas intensidades de fluorescência relatados na Tabela 1. Para cada condição a intensidade média das três cavidades (em triplicado) foi calculada e convertida em percentagem relativa de células totais carregados ( Sem Lavagem Não revestido Não estimulada PMA Anti-CD3 de 0,1 ug / ml Anti-CD3 1 ug / ml Anti-CD3 5 ng / mL Anti-CD3, 10 ug / ml 1 2 3 4 5 6 7 8 A 89652 611 5219 45873 8964 20157 37972 37972 B 90248 320 6049 7568 25486 32549 32549 C 88321 409 5456 42697 8542 24568 32892 3289
Os valores de intensidade de fluorescência Tabela 1. De CFSE marcado células T primárias estimuladas com várias concentrações de anticorpos anti-CD3 solúvel. As células colhidas foram privadas de soro durante duas horas e, subsequentemente, rotulados com CFSE, na concentração de 5 uM. Em seguida, as células foram estimuladas com uma baixa (0,1 ug / ml), média (1 ug / ml), segundo (5 ug / ml), e muito alta (10 ug / ml), as concentrações de anticorpos anti-CD3 e um solúveis 5 x 10 células foram semeadas em cada poço (pré-revestidas com ICAM-1). Após 15 minutos, as células não aderentes foram removidos por três lavagens em série. O número de células aderentes foi medida com um leitor de placas que shown nesta tabela. Wells 1A-1C: células não lavadas; 2A-2C: poços não revestidos; 3A-3C: células não estimuladas; 4A-4C: As células estimuladas com 10 ng / ml de PMA; 5A-5C: células estimuladas com anticorpos anti-CD3 dose baixa; 6A-6C: células estimuladas com dose média de anticorpos anti-CD3; 7A-7C: células estimuladas com anticorpos anti-CD3 dose elevada; 8A-8C: células estimuladas com anticorpos anti-CD3 muito altas doses. 
Figura 1. De imagens de células T primárias estimuladas com várias concentrações de anticorpos anti-CD3 solúvel. Células recentemente colhidas foram privadas de soro durante duas horas e, subsequentemente, rotulados com CFSE, na concentração de 5 uM. Em seguida, as células foram estimuladas com PMA (10 ng / ml) ou várias concentrações de anticorpos anti-CD3 (0,1, 1, 5, e 10 ug / ml) e semeada emICAM-1 superfícies revestidas. Imagens representativas foram tiradas com Zeiss 700 microscopia confocal usando ampliação 20X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2. Estimulação de células T com doses elevadas de anti-CD3 resulta no aumento da aderência representação. Sobrepostos da percentagem de adesão das células T, conforme calculado a partir da relação mostrada na Tabela 1. A percentagem média de células aderentes foi calculada para as células que impuras representam 100%. Os histogramas apresentam os resultados (média ± SEM) de, pelo menos, três poços. favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem diversos ensaios para estudar os sinais de LFA-1 a activação e a adesão de células T 12. A citometria de fluxo é utilizada para medir a LFA-1 estados de afinidade em células vivas, utilizando anticorpos monoclonais que se ligam selectivamente, quer dobrado ou estendido a LFA-1. Uma das limitações deste método é que ele não leva em conta a avidez dos integrinas. Ensaios de migração são ferramentas úteis, mas eles medem a migração, e não adesão desprezível em um ponto de tempo específico. Modelos de ratos para estudar a migração de linfócitos T (por exemplo, modelo de hipersensibilidade cutânea) são fisiologicamente relevante, porém a utilização destes modelos é multifatorial e complicado de executar. A principal força do ensaio de adesão estático descrito aqui é a capacidade de medir a avidez e afinidade de uma forma simples. Outra vantagem deste método é a sua capacidade para detectar um pequeno número de células de forma rápida e precisa. Quando comparado com outros métodos, é muito mais fácil de ManipulaçãoUlate as células e tratá-los com diferentes reagentes num ensaio funcional, tal como o descrevemos. Além disso, as células aderentes são contados objectivamente com um leitor de placas, polarização eliminação associados com contagens manuais. Este método pode ser utilizado para pesquisar o efeito de múltiplas drogas ou manipulação genes no processo de adesão.
No entanto, esta técnica não é livre de limitações. Uma fraqueza potencial é o facto de a percentagem de células aderentes é um número relativo, o que pode variar a partir de uma experiência para a outra. Outra fraqueza é o facto de que os linfócitos de explosão não pode ser utilizado, uma vez que estas devem ser isoladas de fresco. Além disso, estudos de adesão com células recuperadas a partir de células mononucleares do sangue periférico congelados não são consistentes. É importante mencionar que a PMA deve trabalhar de forma consistente, e recomendamos usá-lo em cada experimento. Um positivo e um controle negativo são os primeiros passos na solução de problemas de experiências mal sucedidas. Em caso de falta deaumentada de adesão em células estimuladas, a concentração do ligando-alvo que cobre as cavidades devem ser verificados. Além disso, é necessário para validar que mais de 95% das células são viáveis, e, no caso de uma linha de células, a sua fase de crescimento deve ser calculada. Em caso de variação significativa dentro da mesma condição, é recomendado o uso de mais do que três poços idênticos (mais do que triplicado).
De modo a apreciar este ensaio é útil para compreender que alguns passos do protocolo, tais como o tempo de incubação e o número de células semeadas deve ser uniforme entre todas as condições. Pequenas diferenças no tempo de incubação pode resultar é medições imprecisas. Também é vital a alíquota exatamente o mesmo número de células é cada poço. Futuras aplicações desta técnica, melhorando a precisão seria uma versão automatizada que carregar as células e efectuar as lavagens de forma mais objectiva. Além disso, uma versão automatizada irá permitir-nospara executar telas em grande escala.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Hirschil Trust, Michael Saperstein médicos Scholars Fundos de Pesquisa, ea comunhão NYU Whitehead apoiaram este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
