Summary
Analyse de l'adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d'autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l'injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d'adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série.
Abstract
L'adhérence des lymphocytes T sont nécessaires pour de multiples fonctions de cellules T, y compris la migration vers les sites d'inflammation et la formation de synapses immunologiques avec des cellules présentatrices d'antigène. Les cellules T accomplir adhérence régulée en contrôlant les propriétés adhésives des intégrines, une classe de molécules d'adhésion cellulaire hétérodimères constitués de paires de protéines transmembranaires qui interagissent avec les molécules cibles sur des cellules ou des partenaires de la matrice extracellulaire. L'intégrine la plus importante des cellules T est la fonction lymphocytaire antigène associé (LFA) -1, composé de sous-unités β2 et aL, dont la cible est la molécule d'adhésion intracellulaire (ICAM) -1. La capacité d'une cellule T pour contrôler l'adhérence provient de la capacité à réguler les états d'affinité des intégrines individuelles. Signalisation inside-out décrit le processus par lequel des signaux à l'intérieur d'une cellule provoquent les domaines externes de intégrines à assumer un état activé. Une grande partie de notre connaissance de ces phénomènes complexes est basée sur mécanisteDes études effectuées dans simplifiée dans des systèmes de modèles in vitro. Le test d'adhésion des lymphocytes T décrit ici est un excellent outil qui permet aux cellules T à adhérer à des molécules cibles, dans des conditions statiques, puis utilise un lecteur de plaque fluorescente de quantifier l'adhérence. Ce dosage a été utile dans la définition de l'adhérence des substances stimulant ou inhibiteur qui agissent sur les lymphocytes, ainsi que la caractérisation des événements de signalisation impliquées. Bien que décrit ici pour LFA-1 - ICAM-1 médiée adhérence; ce dosage peut être facilement adapté pour permettre l'étude d'autres interactions adhésives (par exemple, VLA-4 - fibronectine).
Introduction
L'adhérence des lymphocytes T est un processus fondamental dans la réponse immunitaire 1. Il est nécessaire pour l'interaction des lymphocytes T avec les cellules endothéliales décorer les parois capillaires, pour l'antigène des cellules présentatrices de balayage (APC) à l'intérieur des ganglions lymphatiques, et pour la formation de synapses immunologiques (IS) avec des cellules cibles 2. Ces exigences sont fonctionnellement distincte et cinétique. Le processus de lymphocytes extravasation se compose de la chimio-attraction, roulement, adhérence ferme et la transmigration. La transition de roulement pour raffermir l'adhérence des lymphocytes T nécessite de répondre à un signal de récepteur couplé à la protéine G rapidement. Cette réponse donne une interaction ligand des intégrines qui ralentit et arrête la cellule de roulement 3. Un changement immédiat dans avidité intégrine médiatise ce processus. Migration nécessite interactions betweenTcells dynamiques et les cellules endothéliales avec la formation d'adhérences à l'extrémité avant »et la rupture des adhérences à l'extrémité arrière 'avec un intervalle d'environ une minute entre la formation et la rupture 4. L'IS forme inminutes, mais doit rester intact pendant des heures 6.
Fait intéressant, une molécule d'adhérence, la fonction des lymphocytes membre de la famille des intégrines antigène associé (LFA) - 1, est essentiel pour tous ces processus 5. LFA-1 médie l'adhésion grâce à des interactions avec plusieurs membres de la superfamille des immunoglobulines. Le ligand le plus largement étudié avec la plus forte affinité pour le LFA-1 est la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM) -1. Lymphocytes circulants non activés expriment une faible affinité de LFA-1 sur la surface cellulaire, et par conséquent ne peuvent pas adhérer à des surfaces ICAM-1-enduit. LFA-1, l'affinité est variable et régulée par plusieurs événements de signalisation telles que la protéine G couplée activation du récepteur, la stimulation de cytokines, et des signaux médiés par des récepteurs de cellules T (TCR). L'forme de haute affinité résultant de LFA-1 transmet activation intracellulaire vers l'espace extracellulaire trâce interactions avec ICAM-1. Cette voie est appelée inside-out signalisation 7. De même, la signalisation par LFA-1 de l'espace extracellulaire est appelé en dehors dans la signalisation.
Le intracellulaire cascades impliqués dans l'envers et à l'extérieur dans la signalisation de signalisation sont un axe majeur de la recherche actuelle. La petite GTPase Rap1 a récemment émergé comme l'élément clé de l'intérieur-out signalisation qui est commun aux deux ligature TCR et de signalisation 8 cytokine. Le rôle essentiel des Rap1 dans l'activation des intégrines est mis en évidence par la découverte que la surexpression de Rap1 stimule l'adhérence de l'intégrine-dépendant des cellules T, tandis que l'adhésion des cellules T est bloqué par l'expression d'Rap1 dominant négatif 9. Ces avancées dans notre compréhension de la régulation de l'intégrine par Rap1 ont été réalisées en utilisant des outils in vitro. Parmi eux se trouve l'analyse de l'adhérence statique décrit ici.
L'objectif global de cette méthode est d'étudier Tcellule adhérence à ICAM-1 des surfaces revêtues. Plus précisément, il est utilisé pour mesurer objectivement et quantifier l'affinité de LFA-1 vers ses homologues de ligands dans les cellules vivantes au temps réel, dans différentes conditions. Cette technique utilise des puits de polystyrène revêtus d'ICAM-1 pour imiter les surfaces cellulaires que les cellules T interagissent avec. De nombreux tests d'adhésion sur les cellules T ont été décrites précédemment statique expérimentalement complexe. Ces dosages souvent requis pour les cellules T à être marquées de façon radioactive, utilisés cellules cornéennes bovines en culture pour créer une matrice extracellulaire comme substrat pour T adhésion cellulaire, ou appelé à la stimulation des cellules T non-physiologique pendant une durée prolongée, de promouvoir T adhésion cellulaire 10. L'utilisation de la mesure fluorométrique pour quantifier les lymphocytes T suite à l'incubation de l'adhérence est une méthode plus sensible et précise de la quantification par rapport à la cytométrie en flux et la microscopie, qui sont utilisés dans de nombreux autres systèmes de dosage 11. En outre, par microscopie de cellule uniqueic analyse de l'intégrine localisation ne permet pas de la large population sur la base de l'analyse de la même manière que la mesure fluorométrique. Alors que l'activation de LFA-1 anticorps spécifiques de l'Etat sont disponibles dans le commerce, ces anticorps offrent une faible sensibilité par rapport à la méthode décrite ici. Le principal avantage par rapport aux techniques alternatives est sa simplicité et la possibilité d'examiner de multiples conditions expérimentales simultanément. Lors de l'examen de cette méthode pour une application spécifique, il faut prendre en compte que les cellules T doivent être sélectionnés négativement, fraîchement isolées, et marqué avec un marqueur fluorescent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Enrobage du puits de microplaques
Remarque: Le but de cette étape est de recouvrir les surfaces de polystyrène avec ICAM-1 pour servir de ligands pour les cellules T de LFA-1.
- Préparer les solutions suivantes:
- Préparer la solution de revêtement par remise en suspension recombinante d'ICAM-1 avec un tampon phosphate salin (PBS) (137 mM NaCl, KCl 2,7, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) enrichi en calcium (1 mM CaCl 2) et de magnésium (MgCl 2 nM 2). Assurez-vous que la concentration finale de ICAM-1 est de 10 pg / ml, faites partir d'une solution de 0,7 mg / ml et conservé dans un congélateur à -80 ° C.
- Préparer la solution d'adhérence par l'enrichissement du PBS avec 0,5% de l'homme (ou bovine) de sérum-albumine (HSA / BSA), 2 mM de MgCl2, et 1 mM de CaCl2.
- Préparer la solution de lavage par addition de 2 mM de MgCl2 et 1 mM de CaCl 2 à PBS. Réchauffer toutes les solutions à 37° C avant utilisation.
- Laver les puits avec 24 50 ul de solution de lavage. Il s'agira notamment de puits non lavés, (PMA cellules traitées) positifs et négatifs (puits non revêtus) Commandes. Pour chaque condition énoncée au moins trois puits (triple).
- Ajouter 50 ul de solution de revêtement dans chaque puits. Ne pas ajouter aux puits témoins non revêtus. Incuber pendant une heure à l'intérieur 37 ° C incubateur.
- Aspirer la solution de revêtement en douceur, sans permettre à la pointe de toucher le fond des puits. Laver une fois avec 50 ul de solution de lavage.
- Ajouter 50 ul de solution d'adhérence et incuber la microplaque pendant une heure à l'intérieur de 37 ° C incubateur.
- Aspirer délicatement et laver une fois avec 50 solution de lavage ul. Utilisation de la plaque, le même jour, cependant, il est possible de le maintenir à 4 ° C pendant une nuit, et l'utiliser le jour suivant.
2. Cellules T Isolation de sang
- Ajouter T enrichissement cellulaire humaine cocktail à 50 pl / ml of sang entier (par exemple pour 3 ml d'anticoagulant (héparine, EDTA, ou citrate) sang total, ajouter 150 ul de cocktail). Mélangez bien.
- Incuber 20 min à température ambiante.
- Pour un tube à centrifugation de 50 ml ajouter 3 ml de sang traité et d'un volume égal de PBS (sans calcium ni magnésium) enrichi avec 1% de D-glucose à température ambiante. Mélanger doucement avec une pipette Pasteur.
- Ajouter 15 ml de Ficoll-Paque PLUS pour le tube de centrifugation.
- Superposer soigneusement les 6 ml dilué un échantillon de sang sur le milieu d'isolement des lymphocytes.
- Centrifugeuse à 400 g pendant 20 min à 20 ° C avec de brisure.
- Prélever la couche supérieure à l'aide d'une pipette Pasteur propre, en laissant la couche de lymphocytes non perturbée à l'interface. La couche supérieure de plasma peut être conservé pour une utilisation ultérieure. Aide d'une pipette Pasteur propre transférer la couche de lymphocytes à un tube à centrifuger propre.
- Ajouter 3 volumes (9 ml) de PBS pour les lymphocytes. Suspendre les cellules par doucement draaile eux dans et hors d'une pipette Pasteur.
- Centrifuger à 400 g pendant 5 min à 20 ° C.
- Retirer le surnageant. Les lymphocytes devraient maintenant être suspendus dans le milieu approprié à l'application. Transférer les cellules dans un ballon de culture T-75 dans 20 ml du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine.
3. Préparation des cellules
Remarque: Une condition préalable est que les cellules devant être étiquetés avec un réactif fluorescent. Dans ce protocole utiliser carboxy succinimidylester fluorescéine (CFSE), la protéine fluorescente cependant verte (GFP) des cellules exprimant sont une alternative acceptable.
- Comptez 2,4 x 10 6 cellules T (1 x 10 5 pour chaque puits) en utilisant un hématimètre.
- Remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture dépourvu de sérum (de privation de sérum). Incuber les cellules pendant 2 heures dans le 37 ° C incubateur.
- Centrifuger les cellules pendant 5 min (400 x g). Aspirer les médias etremettre en suspension dans 1 ml de PBS.
- Ajouter CFSE à 1:1000 dilution (bouillon à base de 5 mM). Couvrir de la lumière et incuber pendant 8 min à température ambiante.
- Arrêter la réaction en ajoutant 10 ml de PBS 37 ° C et centrifuger à 400 g pendant 5 min.
- Re-suspendre culot de cellules avec 1,2 ml de la solution d'adhérence préchauffé (1 x 10 5 cellules par 50 ul).
4. Stimulation des cellules
Remarque: Afin de lancer l'adhérence, les cellules doivent être stimulées. Dans l'expérience suivante, les cellules sont stimulées par l'intermédiaire du TCR l'aide d'anticorps anti-CD3 de reticulation, mais soluble SDF-1 pourrait servir d'alternative. Selon le but des expériences, divers réactifs pharmacologiques pourraient être ajoutés avant ou pendant la stimulation d'étudier l'impact sur l'adhésion cellulaire. Phorbol myristate acétate (PMA) est un ester de phorbol qui est structurellement similaire à la deuxième glycérol messager diacylique (DAG) et active la kinase multiple doncs en aval de la TCR (principalement la protéine kinase C); ici, il est utilisé comme contrôle positif.
- Réchauffez la microplaque à 37 ° C.
- Diviser les cellules vides dans 8 tubes de 1,5 ml (150 pl dans chaque tube), un tube pour chaque condition.
- Traiter les cellules en conséquence:
- Stimuler un tube avec de la PMA à 10 ng / ml pour servir de témoin positif. Maintenir trois tubes non traité, pour servir de témoin pour la stimulation ("pas de stimulation"), le contrôle de chargement non lavé ("pas de lavage"), et le contrôle de ICAM-1 revêtement («non couché»).
- Stimuler quatre tubes avec différentes concentrations d'anticorps anti-CD3 (0,1, 1, 5 et 10 pg / ml). Passez à l'étape suivante sans retard.
- Aliquotes de 50 pi de mélange de cellules stimulées dans chaque puits vide. Le nombre final de cellules par puits est de 1 x 10 5.
- Placer la microplaque à 37 ° C incubateur pendant 15 min.
Remarque: Certaines lignées de cellules T nécessitent une stimulation plus courte temps de tion. Pendant ce temps, les cellules se déposeront au fond du puits et de se conformer aux ligands cibles.
5. Laver à l'extérieur des cellules non-adhérentes
Remarque: Le but de cette étape est d'éliminer les cellules qui ne sont pas capables de former des contacts étroits avec les surfaces revêtues de ligands. Utiliser une pipette multicanaux pour cette étape afin de faire en sorte que les mêmes forces physiques sont appliqués à tous les puits. Il est important de conserver les puits témoins non lavées indiqués pour aider au calcul du pourcentage de cellules adhérentes.
- Ajouter 150 ul de solution d'adhérence à chaud chacun des puits. Secouer doucement la plaque pendant quelques secondes avant de retirer le support des puits. Ne pas toucher le fond des puits avec les conseils.
- Répétez cette étape trois fois. Changer le sens de la pipette lors du pipetage du tampon et de sortie.
6. Détermination du pourcentage de cellules adhérentes
_content "> Remarque: Dans cette étape d'un lecteur de plaque fluorescente est utilisé pour mesurer l'intensité de fluorescence dans chaque puits L'intensité est en corrélation directe avec le nombre de cellules adhérentes..- Allumez le lecteur de plaque. Ouvrez le logiciel de lecture de plaque en cliquant sur l'icône de raccourci sur le bureau.
- Dans le menu "Groupe", cliquez sur "Nouveau" pour créer un nouveau protocole.
- Dans le menu "Actions", choisissez l'option "Lire". Cliquez sur "l'intensité fluorescente" et cliquez sur l'onglet "Ok".
- Du menu déroulant, sélectionnez "onde d'excitation 485» et «longueur d'onde d'émission 528". Hit l'onglet "Ok".
- Dans le menu d'option "optique", sélectionnez "Bas" et cliquez sur l'onglet "Ok". Retour au menu "Actions" et régler la température à 37 ° C et cliquez sur "Ok".
- Insérer la microplaque dans le lecteur de plaque etcliquez sur "Exécuter". Le résultat sera exporté dans Excel feuille de calcul.
- Calculer le pourcentage de cellules adhérentes en utilisant la formule suivante: Pourcentage de cellules adhérentes = (intensité de fluorescence moyenne de lire dans les puits lavés) / (intensité de fluorescence moyenne de lire dans les cellules non lavés) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ci-dessous est un exemple d'analyse de l'adhérence en utilisant des cellules T primaires stimulées avec diverses concentrations d'anticorps anti-CD3. Il est utile de connaître la fluorescence des cellules sales (c'est à dire de la charge totale). Cellules non stimulées servent de témoin négatif et les cellules traitées sont des PMA le contrôle positif pour les anticorps anti-CD3. Cellules étalées dans des puits non revêtus servent de contrôle pour ICAM-1. Dans une expérience typique, le pourcentage de cellules adhérentes PMA traitée est comprise entre 40% et 50% tandis que le pourcentage de cellules non stimulées est comprise entre 5% et 10%. Une autre méthode pour quantifier l'adhérence cellulaire se fait par augmentation de pliage de calcul de l'intensité de fluorescence dans chaque condition par rapport à celle des cellules non stimulées.
Le tableau 1 montre l'intensité de fluorescence de CFSE marqué des cellules T primaires stimulées avec différentes doses d'anticorps anti-CD3 soluble et étalées sur des ICAM-1 puits revêtus. Figure 1 montre im représentantâges de expérience similaire. Les cellules ont été sélectionnées négativement à partir de sang périphérique. Après privation de sérum pendant 2 heures, 2,4 x 10 6 cellules ont été marquées avec du CFSE suivi d'une stimulation avec des anticorps anti-CD3 soluble à diverses concentrations. Les cellules stimulées ont été étalées dans ICAM-1 puits revêtus et mis en incubation pendant 15 min à l'obscurité. Après incubation, les cellules non adhérentes ont été lavées trois fois et l'intensité de fluorescence a été mesurée en utilisant un lecteur de plaque à 485 nm. PMA traitée et les cellules non stimulées ont été utilisés comme témoins. A noter que la première colonne (1A-1C) contient des cellules qui n'ont pas été lavés (charge totale, par exemple 100%).
La figure 2 montre le pour cent de l'adhésion des cellules T tel que calculé sur la base des intensités de fluorescence rapportés dans le tableau 1. Pour chaque état de l'intensité moyenne des trois puits (en triple) a été calculée et convertie en pourcentage relatif de cellules totales chargées ( Pas de lavage Non couché Non stimulées PMA Anti-CD3 0,1 pg / ml Anti-CD3 1 pg / ml Anti-CD3 5 pg / ml Anti-CD3 10 pg / ml 1 2 3 4 5 6 7 8 A 89652 611 5219 45873 8964 20157 37972 37972 B 90248 320 6049 7568 25486 32549 32549 C 88321 409 5456 42697 8542 24568 32892 3289
Tableau 1. Valeurs d'intensité de fluorescence de CFSE marquées des cellules T primaires stimulées avec diverses concentrations d'anticorps anti-CD3 solubles. Les cellules fraîchement récoltées ont été privées de sérum pendant deux heures et ensuite marquées avec CFSE à une concentration de 5 uM. Ensuite, les cellules ont été stimulées avec un faible (0,1 ug / ml), moyen (1 pg / ml), haute (5 ug / ml), et très élevée (10 ug / ml) des concentrations d'anticorps anti-CD3 soluble et une 5 x 10 cellules ont été étalées dans chaque puits (pré-revêtus avec ICAM-1). Après 15 minutes, les cellules non adhérentes ont été éliminées par trois lavages en série. Le nombre de cellules adhérentes a été mesurée avec un lecteur de plaque en tant que shown dans ce tableau. Les puits 1A-1C: cellules non lavés; 2A à 2C: puits non revêtus; 3A à 3C: cellules non stimulées; 4A-4C: les cellules stimulées avec 10 ng ml de PMA /; 5A à 5C: des cellules stimulées avec une faible dose d'anticorps anti-CD3; 6A à 6C: cellules stimulées par dose moyenne d'anticorps anti-CD3; 7A-7C: cellules stimulées par des doses élevées d'anticorps anti-CD3; 8A à 8C: des cellules stimulées avec des anticorps anti-CD3 très forte dose. 
Figure 1. Images de cellules T primaires stimulés avec des concentrations variables d'anticorps anti-CD3 solubles. Des cellules fraîchement récoltées ont été privées de sérum pendant deux heures et ensuite marqué avec CFSE à une concentration de 5 uM. Ensuite, les cellules ont été stimulées avec du PMA (10 ng / ml) ou différentes concentrations d'anticorps anti-CD3 (0,1, 1, 5 et 10 pg / ml) et étalées sur desICAM-1 surfaces revêtues. Images représentatives ont été prises avec Zeiss 700 microscopie confocale en utilisant un grossissement de 20x. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 2. Stimulation des cellules à haute dose anti-CD3 anticorps entraîne une augmentation de l'adhérence T. Représentation graphiquement de la pour cent des T adhésion cellulaire calculée à partir du rapport présenté dans le tableau 1., Le pourcentage moyen de cellules adhérentes a été calculé pour non lavés cellules qui représenter 100%. Les histogrammes présentent les résultats (moyenne ± SEM) d'au moins 3 puits. S'il vous plaît cliquerk ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il existe plusieurs tests pour étudier les signaux de LFA-1 et l'activation T adhésion cellulaire 12. La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer LFA-1 affinité Etats dans les cellules vivantes en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient sélectivement soit plié ou étendu LFA-1. Une des limites de cette méthode est qu'elle ne tient pas compte de l'avidité des intégrines. essais de migration sont des outils utiles, mais ils mesurent la migration, et non adhérence maigre à un point de temps spécifique. Des modèles murins pour étudier la migration des lymphocytes T (par exemple de modèle d'hypersensibilité cutanée) sont physiologiquement pertinente, mais l'utilisation de ces modèles est multifactorielle et complexe à exécuter. La principale force de l'analyse de l'adhérence statique décrit ici est sa capacité à mesurer à la fois l'avidité et l'affinité d'une manière simple. Un autre avantage de cette méthode est sa capacité à détecter un petit nombre de cellules rapidement et avec précision. Par rapport aux autres procédés, il est beaucoup plus facile à Manipuler les cellules et de les traiter avec des réactifs différents dans une analyse fonctionnelle que celle que nous décrivons. En outre, les cellules adhérentes sont comptés objectivement avec un lecteur de plaque, le biais de l'élimination associés avec comptages manuels. Cette méthode peut être utilisée pour cribler l'effet de plusieurs médicaments ou la manipulation des gènes sur le processus d'adhérence.
Cependant, cette technique n'est pas sans limites. Une faiblesse potentielle est le fait que le pourcentage de cellules adhérentes est un nombre relative, qui peut varier d'une expérience à l'autre. Une autre faiblesse réside dans le fait que les lymphocytes-fourneaux ne peuvent pas être utilisés, car ceux-ci doivent être fraîchement isolées. De plus, des études d'adhérence avec des cellules récupérées à partir de cellules congelées périphériques mononucléaires du sang ne sont pas cohérentes. Il est important de mentionner que PMA devrait travailler de manière cohérente, et nous vous recommandons de l'utiliser dans chaque expérience. A positif et un contrôle négatif sont les premières étapes dans le dépannage essais infructueux. En cas de manque d'adhérence augmentée dans les cellules stimulées, la concentration du ligand cible recouvrant les puits doit être vérifié. En outre, il est nécessaire de valider le fait que plus de 95% des cellules sont viables, et dans le cas d'une lignée cellulaire, de leur phase de croissance doit être calculée. En cas de variabilité significative dans le même état, il est recommandé d'utiliser plus de trois puits identiques (plus que trois exemplaires).
Afin d'apprécier cette analyse, il est utile de comprendre que certaines étapes du protocole, tels que le temps d'incubation et le nombre de cellules ensemencées doit être homogène parmi toutes les conditions. Les petites différences de temps d'incubation peuvent résulter est des mesures inexactes. Il est également essentiel de aliquote exactement le même nombre de cellules est chaque puits. Les futures applications de cette technique, l'amélioration de la précision serait une version automatisée qui charger les cellules et effectuer les lavages de manière plus objective. En outre, une version automatisée nous permettrapour effectuer des écrans de grande envergure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Hirschil Trust, Saperstein Scholars finance la recherche médicale Michael, et la communion NYU Whitehead pris en charge ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
