Summary
Statisk adhesjon assay er et kraftig verktøy som kan brukes til å modellere interaksjonen mellom T-lymfocytter og andre celletyper. Interaksjoner genereres ved å injisere merkede T-celler i brønner belagt med adhesjonsmolekyler, mens en plate-leser brukes til å kvantifisere antallet adherente celler følgende serievaskinger.
Abstract
T-lymfocytter vedheft er nødvendig for flere T celle funksjoner, inkludert migrering til områder med betennelse og dannelse av immunologiske synapser med antigenpresenterende celler. T-celler oppnå regulert adhesjon ved å styre de adhesive egenskaper av integriner, en klasse av celleadhesjonsmolekyler som består av heterodimere par av transmembrane proteiner som interagerer med målmolekylene på partnerceller eller ekstracellulær matriks. Den mest fremtredende T-celle integrin er lymfocytt-funksjon-assosiert antigen (LFA) -1, sammensatt av underenheter pI og β2, hvis målet er den intracellulære adhesjonsmolekyl (ICAM) -1. Muligheten av en T-celle for å styre heft stammer fra muligheten til å regulere affinitet tilstander av individuelle integriner. Inside-out signale beskriver prosessen hvor signalene inne i en celle føre til eksterne domener av inte å anta påvirket tilstand. Mye av vår kunnskap om disse komplekse fenomener er basert på mekanistiskstudier utført i forenklet in vitro modellsystemer. Den T-lymfocytter vedheft analysen beskrevet her er et utmerket verktøy som lar T-celler til å følge målrette molekyler, under statiske betingelser, og deretter benytter et fluorescerende plate leseren å kvantifisere klebrighet. Denne analysen har vært nyttig å definere adhesjons-stimulerende eller inhiberende substanser som virker på lymfocytter, så vel som karakteriserer de signaleringshendelser som er involvert. Selv beskrevet her for LFA-1 - ICAM-1 mediert vedheft; Dette assay kan lett tilpasses for å muliggjøre studier av andre adhesive interaksjoner (for eksempel VLA-4 - fibronektin).
Introduction
T-lymfocytt adhesjon er en grunnleggende prosess i immunresponsen 1.. Det er nødvendig for T-celle-interaksjon med endotelceller dekorere kapillærveggene, for skanning antigen-presenterende celler (APC) i lymfeknuter, og for dannelse av immunologiske synapser (IS) med målceller 2. Disse kravene er funksjonelt og kinetisk distinkt. Prosessen med lymfocytter bloduttredelse består av chemoattraction, rullende, fast feste, og sjelevandring. Overgangen fra rulle til fast adhesjon krever T-celler til å svare på en G-protein koblet reseptor signal raskt. Dette svaret gir en inte ligand interaksjon som bremser og arrestasjoner den rullende cellen tre. En umiddelbar endring i inte grådighet formidler denne prosessen. Migrasjon krever dynamiske interaksjoner betweenTcells og endotelceller med dannelse av sammenvoksninger på "front end" og brekker av sammenvoksninger på "bakenden"med et intervall på omtrent et minutt mellom forming og bryte fire. IS danner inminutes, men må forbli intakt i timevis seks.
Interessant, en adhesjonsmolekyl, integrinet familiemedlem-lymfocytt-funksjon-assosiert antigen (LFA) - 1, er viktig for alle disse prosessene 5. LFA-1 medierer heft gjennom samhandling med flere medlemmer av immunoglobulin super. Den mest omfattende studert ligand med den høyeste affinitet til LFA-1 er det intercellulære adhesjonsmolekyl (ICAM) -1. Ikke-aktivert sirkulerende lymfocytter uttrykker lav affinitet LFA-1 på celleoverflaten, og derfor er ute av stand til å holde seg til ICAM-1-belagte overflater. LFA-en affinitet er variabel og regulert av flere signal arrangementer som G-protein koblet reseptor aktivering, cytokin stimulering, og signaler mediert av T-celle reseptorer (TCR). Den resulterende høy affinitet form av LFA-en formidler intracellulær aktivering til ekstracellulært through interaksjoner med ICAM-1. Denne veien kalles inside-out signale 7. Likeledes, signaliserer gjennom LFA-en fra den ekstracellulære rom kalles utenfor-i signalering.
Den intracellulære signal kaskader involvert i innside-ut og utside-inn signale er et stort fokus på aktuell forskning. Den lille GTPase Rap1 har nylig dukket opp som en nøkkelkomponent for inside-out signaliserer som er felles for både TCR ligation og cytokin signale åtte. Den kritiske rollen Rap1 i inte aktivering er markert med oppdagelsen av at overekspresjon av Rap1 stimulerer inteavhengig vedheft av T-celler, mens T-celle adhesjon er blokkert av uttrykk for dominerende negative Rap1 ni. Disse fremskritt i vår forståelse av inte regulering av Rap1 har blitt oppnådd ved hjelp av in vitro-verktøy. Blant dem er det statiske adhesjonsanalysen beskrevet her.
Det overordnede målet med denne metoden er å studere Tcelle klebrighet til ICAM-1 malte overflater. Mer spesifikt, er det brukt til å objektivt måle og kvantifisere LFA-en affinitet mot sine mot ligander i levende celler i sanntid, under forskjellige forhold. Denne teknikken anvender polystyren-brønner belagt med ICAM-1 til å etterligne de cellulære overflater som T-cellene kommuniserer med. Mange tidligere beskrevet statisk T celle adhesjon analyser var eksperimentelt kompleks. Disse analyser ofte er nødvendige for T-celler til å være radioaktivt merket, anvendes dyrkede bovine corneale celler til å lage en ekstracellulær matriks som substrat for T-celle-adhesjon, eller kalt for ikke-fysiologiske T-celle stimulering over en forlenget varighet for å fremme T-celle-adhesjon 10. Bruken av fluorometrisk måling for å kvantifisere T-celler etter inkubasjon adhesjon er en mer følsom og nøyaktig metode for mengdebestemmelse i forhold til flow cytometri og mikroskopi, som er utnyttet i mange andre bestemmelsessystemer 11. I tillegg, enkelt celle mikroskopic analyse av integrin lokalisering ikke tillater for den brede, populasjonsbasert analyse på samme måte som den fluorometrisk måling. Mens aktiverings state-spesifikke LFA-1-antistoffer er kommersielt tilgjengelige, er disse antistoffene har lav følsomhet i forhold til fremgangsmåten beskrevet her. Den viktigste fordel i forhold til alternative teknikker er dens enkelhet og evnen til å undersøke flere eksperimentelle betingelser samtidig. Når du vurderer denne metoden for et bestemt program, bør man ta hensyn til at T-cellene skal bli negativt valgt, fersk isolert, og merket med en fluoriserende fargestoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Coating Mikro Wells
Merk: Målet med dette trinnet er å belegge polystyren overflater med ICAM-1 for å tjene som ligander for T celle LFA-en.
- Forbered følgende løsninger:
- Klargjør beleggløsning ved resuspendering av rekombinante ICAM-1 med fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na HPO 2 4, 2 mM KH PO 2 til 4, pH 7,4) anriket med kalsium (1 mM CaCl 2) og magnesium (2 nM MgCl 2). Sørge for at den endelige konsentrasjonen av ICAM-1 er 10 mikrogram / ml, fremstilt av en 0,7 mg / ml stamløsning og holdt i en -80 ° C fryser.
- Klargjør adhesjon løsning ved å anrike PBS med 0,5% humant (eller bovint) serum-albumin (HSA / BSA), 2 mM MgCl2 og 1 mM CaCl 2.
- Klargjør vaskeløsning ved tilsetning av 2 mM MgCl2 og 1 mM CaCl 2 til PBS. Varm alle løsninger til 37° C før bruk.
- Vask 24 brønner med 50 ul vaskeløsning. Dette vil omfatte uvaskede brønner, positive (PMA behandlet celler), og negative (ubestrøket brønner) kontroller. For hver tilstand stilles i minst tre brønner (triplikat).
- Tilsett 50 pl av beleggløsning til hver brønn. Ikke legg til ubestrøket kontrollbrønner. Inkuber i en time på innsiden 37 ° C inkubator.
- Aspirer beleggsløsningen forsiktig, uten å tillate spissen å berøre bunnen av brønnene. Vask en gang med 50 ul vaskeløsning.
- Tilsett 50 pl av vedheft-løsning og inkuberes i mikroplate i en time på innsiden 37 ° C inkubator.
- Sug forsiktig og vaske en gang med 50 mL vaskeløsning. Bruk plate på samme dag, men det er mulig å holde den ved 4 ° C over natten, og bruke den følgende dag.
2. T Cell Isolasjon fra Blood
- Legg human T-celle-anrikning cocktail på 50 ul / ml of fullblod (for eksempel for 3 ml av antikoagulantia (heparin, EDTA eller citrat) fullblod, legge 150 mL av cocktail). Bland godt.
- Inkuber 20 minutter ved romtemperatur.
- Til et 50 ml sentrifugerør tilsett 3 ml av behandlet blod og et like stort volum PBS (uten kalsium og magnesium) anriket med 1% D-glukose ved romtemperatur. Bland forsiktig med en Pasteur pipette.
- Tilsett 15 ml Ficoll-Paque Plus til sentrifugerøret.
- Nøye lag de seks ml utvannet blodprøve på lymfocyttisolasjonsmetoder medium.
- Sentrifuger ved 400 xg i 20 min ved 20 ° C med brudd av.
- Tegn av det øvre lag ved hjelp av en ren Pasteur-pipette, slik at lymfocytt uforstyrret lag i grenseflaten. Det øvre lag av plasma kan lagres for senere bruk. Hjelp av en ren Pasteur pipette overføre lymfocytt-laget til et rent sentrifugerør.
- Tilsett 3 volumer (9 ml) i PBS til lymfocyttene. Suspender cellene ved forsiktig dramatiskvinge dem i og ut av en Pasteur pipette.
- Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Fjern supernatanten. Lymfocyttene skal nå bli suspendert i medium er tilpasset bruken. Overfør cellene til en T-75 kulturkolbe i 20 ml RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin.
Tre. Utarbeidelse av celler
Merk: Det forutsettes for at cellene skal være merket med et fluoriserende reagens. I denne protokollen bruker karboksv fluorescein succinimidyl ester (CFSE), men grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykker cellene er et akseptabelt alternativ.
- Telle 2,4 x 10 6 T-celler (1 x 10 5 for hver brønn) ved hjelp av en hemocytometer.
- Suspender cellene i kultur media mangler serum (serum sult). Inkuber cellene i 2 timer i 37 ° C inkubator.
- Sentrifuger cellene i 5 min (400 xg). Aspirer media ogresuspender i 1 ml PBS.
- Legg CFSE på 1:1.000 fortynning (lager laget til 5 mm). Dekker mot lys og inkuberes i 8 minutter ved romtemperatur.
- Stopp reaksjonen ved tilsetning av 10 ml av 37 ° C PBS og spinne ved 400 x g i 5 min.
- Re-suspen cellepelleten med 1,2 ml av forvarmede vedheft-løsning (1 x 10 5 celler pr 50 ul).
4.. Stimulering av cellene
NB: For å initiere adhesjon, må cellene stimuleres. I det følgende eksperiment cellene blir stimulert via TCR ved hjelp av anti-CD3 tverrbindende antistoffer, men oppløselig SDF-1 kan være et alternativ. Avhengig av målet med forsøkene, kan ulike farmakologiske reagenser tilsettes før eller under stimulering for å studere virkningen på cellulær adhesjon. Forbolmyristatacetat (PMA) er en phorbol ester som er strukturelt lik den andre messenger-diacyl glycerol (DAG), og derfor aktiverer multiple kinases nedstrøms TCR (hovedsakelig Proteinkinase C); her er det brukt som en positiv kontroll.
- Varm opp mikroplate til 37 ° C.
- Fordel cellene i åtte tomme 1,5 ml rør (150 mL i hvert rør), ett rør for hver tilstand.
- Unn cellene tilsvarende:
- Stimuler ett rør med PMA i 10 ng / ml for å tjene som positiv kontroll. Hold tre rør ubehandlet, for å tjene som kontroll for stimulering ("ingen stimulering"), uvasket lastekontroll ("no vask"), og kontroll for ICAM-1-belegg ("ubelagt").
- Stimuler fire rør med forskjellige konsentrasjoner av anti-CD3-antistoffer (0,1, 1, 5 og 10 pg / ml). Gå til neste trinn uten forsinkelser.
- Delmengde 50 mL av stimulert celle blanding i hver tomt godt. Det endelige antall celler pr brønn er 1 x 10 5.
- Plasser mikroplate i en 37 ° C inkubator i 15 min.
Merk: Noen T-cellelinjer krever kortere stimulering sjon tid. I løpet av denne tiden, vil cellene slå seg ned til bunnen av brønnene og følge mål-ligander.
5. Vaske vekk Non-heftende celler
Merk: Målet med dette trinnet er å fjerne celler som ikke var i stand til å danne tette kontakter med overflater ligand-belagt. Bruk av en multikanal pipette for dette trinn for å sikre at de samme fysiske krefter anvendes på alle brønnene. Det er viktig å holde de angitte kontrollbrønner unwashed å hjelpe til ved beregning av prosentandelen av adherente celler.
- Tilsett 150 pl av varme adhesjon løsning til hver brønner. Rist platen forsiktig for noen få sekunder før fjerning av mediet fra brønnene. Ikke ta på bunnen av brønnene med tips.
- Gjenta dette trinnet tre ganger. Skift retning av pipetten ved pipettering bufferen inn og ut.
6. Bestemme Prosent av heftende celler
_content "> NB: I dette trinnet en fluorescerende plateavleser blir brukt til å måle fluorescerende intensitet innenfor hver brønn Intensiteten er i direkte korrelasjon med antallet av de adherente celler..- Slå på plateleser. Åpne plateleser programvaren ved å klikke på snarveien på skrivebordet.
- Fra "Task"-menyen klikker du på "New" for å sette opp en ny protokoll.
- Fra "Handlinger" menyen velger du "Les" alternativet. Klikk "Fluorescent intensitet" og trykke "OK"-kategorien.
- Fra rullegardinmenyen velg "Eksitasjon bølgelengde 485" og "Emission bølgelengde 528". Trykk på "Ok"-kategorien.
- I "Optic" alternativmenyen, velg "Bottom" og trykke "OK"-kategorien. Gå tilbake til "Handlinger" menyen og sett temperaturen til 37 ° C og trykk "Ok".
- Sett mikro inn i plateleser ogklikk "Kjør". Resultatet vil bli eksportert til excel regneark.
- Beregn prosentandelen av heftende celler ved hjelp av følgende formel: Andel av heftende celler = (gjennomsnittlig fluorescerende intensitet lest i vasket brønner) / (gjennomsnittlig fluorescerende intensitet lest i uvaskede celler) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedenfor er et eksempel på adhesjon assay ved å bruke primære T-celler stimulert med forskjellige konsentrasjoner av anti-CD3 antistoffer. Det er nyttig å vite fluorescens av uvaskede celler (dvs. total belastning). Ustimulerte celler tjener som en negativ kontroll og PMA behandlede celler er positiv kontroll for anti-CD3-antistoffer. Celler belagt i ubelagte brønnene tjene som en kontroll for ICAM-1. I et typisk eksperiment hvor mange prosent av adherente PMA behandlede celler, er mellom 40% til 50%, mens prosentandelen av ustimulerte celler, er mellom 5% til 10%. En alternativ metode for å kvantifisere celle klebrighet er ved beregning ganger økning av fluorescerende intensitet i hver tilstand over at av ustimulerte celler.
Tabell 1 viser fluorescens-intensiteten av CFSE merkede primære T-celler stimulert med forskjellige doser av løselig anti-CD3-antistoffer, og sådd ut på ICAM-1-belagte brønner. Figur 1 viser representative imalderen lignende eksperiment. Cellene ble negativt valgt fra perifert blod. Etter sulting serum i 2 timer, ble 2,4 x 10 6 celler merket med CFSE etterfulgt av stimulering med løselig anti-CD3-antistoffer ved forskjellige konsentrasjoner. Stimulerte celler ble platet inn i ICAM-1-belagte brønner og inkubert i 15 min i mørket. Etter inkubering de ikke-adherente celler ble vasket ut tre ganger, og fluorescensintensiteten ble målt ved anvendelse av en plateavleser ved 485 nm. PMA behandlede og ustimulerte celler ble brukt som kontroller. Legg merke til at den første kolonnen (1A-1C) inneholder celler som ikke ble vasket (total belastning, f.eks 100%).
Figur 2 viser prosent av T-celle-adhesjon som beregnes på grunnlag av de fluoriserende intensiteter som er rapportert i tabell 1.. For hver tilstand den gjennomsnittlige intensitet av de tre brønner (triplikat) ble beregnet og omdannet til relative prosentandel av totale celler lastet ( Ingen Wash Ubestrøket Unstimulated PMA Anti-CD3 0,1 ug / ml Anti-CD3 1 pg / ml Anti-CD3 5 ug / ml Anti-CD3 10 pg / ml 1 2 3 4 5 6 7 8 A 89652 611 5219 45873 8964 20157 37972 37972 B 90248 320 6049 7568 25486 32549 32549 C 88321 409 5456 42697 8542 24568 32892 3289
Tabell 1.. Fluorescensintensitet verdier av CFSE merkede primære T-celler stimulert med varierende konsentrasjoner av løselig anti-CD3-antistoffer. De nyhøstede celler ble serum-sultet i to timer og deretter merket med CFSE ved konsentrasjon på 5 uM. Deretter ble cellene stimulert med et lavt (0,1 ug / ml), medium (1 pg / ml), høy (5 ug / ml), og meget høy (10 ug / ml) konsentrasjon av løselig anti-CD3-antistoffer og ett 5 x 10 celler ble sådd ut i hver brønn (pre-belagt med ICAM-1). Etter 15 min de ikke-adherente celler ble fjernet ved tre vaskinger serie. Antallet adherente celler ble målt med en plate-leser som shown i denne tabellen. Wells 1A-1C: uvaskede celler; 2A-2C: ubestrøket brønner; 3A-3C: unstimulated celler; 4A-4C: celler stimulert med 10 ng / ml PMA; 5A-5C: celler stimulert med lav dose anti-CD3 antistoffer; 6A-6C: celler stimulert med middels dose av anti-CD3 antistoff; 7A-7C: celler stimulert med høy dose anti-CD3 antistoffer; 8A-8C: celler stimulert med svært høye doser anti-CD3 antistoffer. 
Figur 1. Bilder av primære T-celler stimulert med varierende konsentrasjoner av løselig anti-CD3-antistoffer. Nyhøstede celler ble serum-sultet i to timer og deretter merket med CFSE ved konsentrasjon på 5 uM. Deretter ble cellene stimulert med PMA (10 ng / ml) eller forskjellige konsentrasjoner av anti-CD3-antistoffer (0,1, 1, 5 og 10 pg / ml) og belagt påICAM-1-belagte overflater. Representative bildene ble tatt med Zeiss 700 konfokalmikroskopi hjelp 20X forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2. Stimulering av T-celler med høy dose anti-CD3-antistoffer fører til økt adhesjon. Stilles grafisk fremstilling av prosent av T-celle-adhesjon som beregnet fra det vist i tabell 1.. Gjennomsnittlig prosentdel av adherente celler ble beregnet i forhold til uvasket cellene representerer 100%. Histogrammene presentere resultatene (betyr ± SEM) på minst tre brønner. Vennligst CLICk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere analyser for å studere signaler til LFA-1-aktivering og T-celle-adhesjon 12. Strømningscytometri er brukt til å måle LFA-1 affinitet tilstander i levende celler ved hjelp av monoklonale antistoffer som binder seg selektivt til enten bøyd eller utvidet LFA-1. En av begrensningene i denne metoden er at den ikke tar hensyn til de inte 'grådighet. Migrasjon analyser er nyttige verktøy, men de måler migrasjon, og ikke measly vedheft på et bestemt tidspunkt. Musemodeller for å studere T lymfocyttmigrering (f.eks kutan overfølsomhet modell) er fysiologisk relevant, men utnyttelse av disse modellene er multifaktoriell og komplisert å gjennomføre. Den største styrken til det statiske adhesjonsanalysen beskrevet her er evnen til å måle både aviditet og affinitet på en enkel måte. En annen fordel med denne metoden er dens evne til å påvise et lite antall celler som raskt og nøyaktig. Sammenlignet med andre metoder, er det mye lettere å ManipUlate cellene og behandle dem med forskjellige reagenser i et funksjonelt assay som den vi beskrive. Videre er adherente celler telles objektivt med en plate-leser, eliminering skjevhet i forbindelse med manuelle teller. Denne fremgangsmåte kan anvendes til å screene effekten av flere narkotiske stoffer eller gener manipulasjon på adhesjon prosessen.
Men denne teknikken er ikke fri for begrensninger. En svakhet er det faktum at andelen av adherente celler er et relativt tall, som kan variere fra ett forsøk til et annet. En annen svakhet er at blåse lymfocytter ikke kan brukes, da disse må være ferskt isolert. Videre vedheft studier med celler utvinnes fra frosne perifere mononukleære blodceller er ikke konsistent. Det er viktig å nevne at PMA bør arbeide konsekvent, og vi anbefaler å bruke det i hvert eksperiment. En positiv og en negativ kontroll er de første trinnene i feilsøkings mislykkede eksperimenter. I tilfelle av manglendeforsterket adhesjon i stimulerte celler, bør konsentrasjonen av target-ligand som dekker brønnen kontrolleres. I tillegg er det nødvendig å bekrefte at mer enn 95% av cellene er levedyktige, og i tilfelle av en cellelinje, bør deres vekstfase beregnes. I tilfelle av betydelig variasjon innenfor samme tilstand, er det anbefalt å bruke mer enn tre identiske brønner (flere enn tre eksemplarer).
For å kunne sette denne analysen er det nyttig å forstå at noen av trinnene i protokollen som inkubasjonstid og antallet seeded cellene må være ensartet blant alle forhold. Små forskjeller i inkubasjonstiden kan resultere er unøyaktige målinger. Det er også viktig å aliquot nøyaktig det samme antall celler er hver brønn. Fremtidige anvendelser av denne teknikken, ville forbedre sin nøyaktighet være en automatisert versjon som ville laste cellene og utføre de vasker i en mer objektiv måte. I tillegg vil en automatisert versjon gjør oss i standå utføre i stor skala skjermer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medisinsk Scholars forskningsmidler, og NYU Whitehead fellesskap støttet dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
