इस वीडियो लेख सफलतापूर्वक एक पूरी पशु कशेरुकी जीव का उपयोग कर परिसर परीक्षण और दवाओं की खोज के लिए एक नया शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने zebrafish भ्रूण की बड़ी संख्या को संक्रमित और विश्लेषण करने के लिए स्थापित किया गया है कि उच्च पाइपलाइन का वर्णन करता है.
Zebrafish उच्च throughput स्क्रीनिंग संभावनाओं के साथ एक पूरी पशु मॉडल के रूप में दवाओं की खोज स्क्रीनिंग के preclinical चरण में एक महत्वपूर्ण उपकरण होते जा रहे हैं. वे इस तरह से, कम करने, स्तनधारी मॉडल में पहले चरण में सेल आधारित assays के बीच की खाई और इन विवो सत्यापन में पुल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अधिक महंगा कृंतक मॉडल पर परीक्षण करने के लिए के माध्यम से गुजर यौगिकों की संख्या. इस रोशनी में, वर्तमान पांडुलिपि में Staphylococcus epidermidis का अध्ययन और माइकोबैक्टीरियम marinum संक्रमण के लिए vivo मॉडल प्रणाली के रूप में zebrafish का उपयोग कर एक नई उच्च throughput पाइपलाइन में वर्णित है. इस सेटअप तुल्यकालिक भ्रूण की बड़ी संख्या की पीढ़ी और विश्लेषण homogenously संक्रमित अनुमति देता है. इसके अलावा पाइप लाइन के लचीलेपन उपयोगकर्ता आसानी से जब जरूरत विश्लेषण के संकल्प में सुधार के लिए अन्य प्लेटफार्मों को लागू करने की अनुमति देता है. एक साथ अभिनव उच्च throughput ते साथ zebrafish के संयोजनchnologies क्योंकि नए यौगिकों की कार्रवाई की विधा को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उपलब्ध ट्रांसजेनिक लाइनों की बड़ी संख्या की वजह से एक पूरी पशु मॉडल का उपयोग कर, लेकिन यह भी की ताकत का न केवल औषधि परीक्षण और नई संभावनाओं के लिए खोज के क्षेत्र खुल जाता है.
Zebrafish तारीख करने के लिए (Danio rerio) सफलतापूर्वक संक्रामक रोगों 1 की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए एक कुशल मॉडल के रूप में स्थापित किया गया है. zebrafish भ्रूण की वजह से उनकी पारदर्शिता और फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त मौजूदा ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों की बड़ी संख्या के लिए vivo इमेजिंग संभावनाओं में अद्वितीय प्रदान करता है. इस शक्तिशाली संयोजन ऐसे माइकोबैक्टीरियम marinum, एम. के निकटतम रिश्तेदार के रूप में रोगजनकों के साथ बातचीत करते हुए यह संभव समय में अलग प्रतिरक्षा प्रकार की कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए बनाता है तपेदिक 2, या Staphylococcus epidermidis, biomaterial जुड़े संक्रमण 3-5 की मुख्य प्रेरणा का. संक्रमण के विभिन्न मार्गों अध्ययन 6 के उद्देश्यों के आधार पर zebrafish भ्रूण में इस्तेमाल किया जा सकता है.
इन संक्रमण मार्गों में से एक बैक्टीरिया की जर्दी इंजेक्शन है. दूसरों की तुलना में इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि जर्दी infecti हैपर काफी इंजेक्शन समय को कम करने और संक्रमण 7, 8 के उच्च reproducibility की अनुमति, रोबोट इंजेक्शन के माध्यम से स्वचालित रूप से किया जा सकता है.
पिछला काम, एस के अध्ययन के लिए vivo मॉडल प्रणाली में एक उच्च throughput के रूप में zebrafish का उपयोग epidermidis और एम. marinum संक्रमण 7, 8 सफल होने के लिए दिखाया. इस प्रणाली के रोबोट की जर्दी जल्दी भ्रूण के इंजेक्शन और जीवाणु लोड के लिए एक उपाय के रूप में प्रतिदीप्ति readout का उपयोग कर के माध्यम से रोग प्रगति के लिए स्क्रीन करने में सक्षम है. इस धारणा के साथ समझौते में, इस स्थापना अनुकूलित और homogenously संक्रमित भ्रूण की बड़ी संख्या को पैदा करते हैं और यौगिकों की एक संख्या के साथ उपचार के बाद समय के दौरान संक्रमण की प्रगति को ट्रैक करने की क्षमता के साथ एक अत्यधिक कुशल उच्च throughput पाइपलाइन स्थापित किया गया है. स्थापित सेटअप के साथ यह स्क्रीन करने के लिए 8,000 तुल्यकालिक भ्रूण को उत्पन्न करने के लिए संभव हैरोग प्रगति के लिए, प्रति घंटे 2,500 भ्रूण अप करने के लिए इस तरह से प्रसंस्करण. भ्रूण संक्रमित लार्वा के समरूप समूह, यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग कर उनके जीवाणु लोड के आधार पर हल कर रहे हैं. इसके अलावा, सेटअप को मान्य करने के लिए, स्तनधारियों में तपेदिक बढ़ने से रोकने के लिए जाना जाता है संदर्भ का प्रभाव एम. से संक्रमित भ्रूण पर परीक्षण किया गया है marinum E11 तनाव या अधिक विषमय एम तनाव 9.
इस अध्ययन में विस्तार से संक्रमित भ्रूण की बड़ी संख्या है और विकास के दौरान और यौगिक उपचार के बाद बैक्टीरियल प्रगति के बाद के विश्लेषण उत्पन्न करने में सक्षम होने के लिए स्थापित किया गया है कि उच्च पाइपलाइन का वर्णन करता है.
इस पत्र में वर्णित उच्च throughput कार्यप्रणाली संक्रमण के विभिन्न प्रकार के साथ मछली भ्रूण और लार्वा की उच्च संख्या स्क्रीन करने के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी पाइप लाइन में हैं. बजाय पारंपरिक एकल या परिवार प्रजनन टैंक की बड़ी प्रजनन पोत का उपयोग spawning प्रक्रिया का नियंत्रण और तुल्यकालिक अंडे की बड़ी संख्या की पीढ़ी में मदद की. स्वचालित सूक्ष्म इंजेक्शन प्रणाली 7 के एक उन्नत संस्करण के साथ, यह 1 घंटे के भीतर एक ही सेल चरण में लगभग सभी 2,500 अंडे को इंजेक्षन करने के लिए संभव है. इन अद्यतन और बेहतर सॉफ्टवेयर के साथ एक पढ़ा बाहर के रूप में बैक्टीरियल प्रसार के साथ बड़ी दवा स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो पहले संभव था और अधिक से अधिक अंडे इंजेक्षन करने के लिए संभव है. हालांकि इस पद्धति अभी भी इंजेक्शन, Benard एट अल द्वारा वर्णित उदाहरण के लिए अन्य इंजेक्शन मार्गों जर्दी तक सीमित है. (2012) 6, उम्मीद है कि निकट भविष्य में स्वचालित सूक्ष्म इंजेक्शन प्रणाली में शामिल किया जाएगा.
<इन तरीकों zebrafish स्क्रीनिंग के लिए बेंचमार्क हालांकि पी वर्ग = "jove_content">, यह रूप में अच्छी तरह से अन्य मछली प्रजातियों के साथ अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होगा. उदाहरण के लिए, कॉमन कार्प दवा स्क्रीन के लिए फायदे हैं करने के लिए संकेत किया गया है. Zebrafish की तरह, अंडे और कॉमन कार्प से प्रारंभिक चरण भ्रूण पारदर्शी लेकिन सौ अंडे के हजारों और एक अधिक स्थिर आनुवंशिक पृष्ठभूमि 16 प्रस्ताव है कि जन्मजात लाइनों की उपलब्धता के अपने बड़े अंडे के आकार का मुख्य लाभ के साथ कर रहे हैं.संक्रमित भ्रूण की बड़ी मात्रा का विश्लेषण cytometer उच्च throughput बड़े कण प्रवाह के साथ किया जाता है. इस डिवाइस के आधार पर क्रमबद्ध बहु अच्छी तरह प्लेटें या यौगिकों की बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए यह विशेष रूप से उपयुक्त बना एक पेट्री डिश में भ्रूण का विश्लेषण कर सकते हैं. एक उच्च इमेजिंग संकल्प की जरूरत है, तो सेटअप प्रौद्योगिकी cytometer बड़े कण प्रवाह पूर्व स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तरह से अनुकूल है और बाद में के माध्यम से एक मध्यम पर नमूनों का विश्लेषण किया जाता है के अलावाएक उच्च संकल्प पर डाल दिया. इस हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक 17, 18 का उपयोग किया जा सकता है. इस डिवाइस स्वचालित रूप से एक बहु अच्छी तरह से थाली या थोक कंटेनर, छवि CLSM या स्टीरियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक केशिका के माध्यम से 360 डिग्री से 2 और 7 दिनों के बाद निषेचन के बीच रहते हैं या तय भ्रूण लीजिए और आधारित भ्रूण के मैनुअल छँटाई की अनुमति 2 थोक कंटेनरों में फिर से निपटान कर सकते हैं सूक्ष्म चित्र पर. भविष्य में सुधार इसलिए यह संभव CLSM के साथ समय पर व्यक्तिगत भ्रूण की स्वचालित रूप से बड़ी संख्या में स्क्रीन करने के लिए कर रही है, बहु अच्छी तरह से थाली में इमेजिंग के बाद भ्रूण की छंटाई की अनुमति देगा. भविष्य अनुप्रयोगों में हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक प्रणाली भी बहु अच्छी तरह प्लेटें में पूर्व वितरण लार्वा की आवश्यकता के बिना प्रौद्योगिकी cytometer बड़े कण प्रवाह से जोड़ा जा सकता है कि मान लिया जाये कि, एक और अधिक उन्नत सॉर्टिंग को बढ़ावा मिलेगा.
इस पत्र स्थापना एक का वर्णनएस अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput सेटअप के डी अनुकूलन epidermidis और एम. दवाओं की खोज के लिए एक मॉडल के रूप में marinum संक्रमण. यह जर्दी में इंजेक्शन इन बैक्टीरिया के परिणाम इंजेक्शन के समय पर अंडे के विकास के चरण पर निर्भर करता है कि यह दर्शाता है. एम. इंजेक्शन लगाने 16-128 सेल मंच या 16-64 सेल स्तर पर एम तनाव में marinum E11 दुम नस इंजेक्शन 2, 6 के रूप में ही संक्रमण पैटर्न की ओर जाता है. हालांकि इस सेटअप केवल बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के प्रसार तक ही सीमित नहीं है. यह रोबोट क्रमशः 13, अभिव्यक्ति और जीन दस्तक नीचे पढ़ाई transgenesis के लिए डीएनए, आरएनए या morpholinos युक्त समाधान इंजेक्षन करने के लिए संभव है कि पहले दिखाया गया था. इसके अलावा, यह इस स्थापना भी कैंसर सेल प्रसार और प्रवास के अध्ययन के लिए उपयोगी है कि दिखाया गया था. इसलिए इस पाइपलाइन के संदर्भ में संकेत तंत्र की एक किस्म के उच्च throughput स्क्रीन के लिए एक बहुमुखी विधि प्रस्तुत करता हैजन्मजात उन्मुक्ति की, संक्रामक रोग और कैंसर के विकास के लिए लागू होता है. ये स्क्रीन दवा की खोज के लिए अन्य लोगों के साथ, लेकिन यह भी पहचान लागू दवाओं के संभावित विषाक्त प्रभाव के विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
हम एस के साथ हमें प्रदान करने के लिए Leonie डे बोअर और बास Zaat (शैक्षणिक मेडिकल सेंटर) के आभारी हैं epidermidis हे -47 तनाव. हम Copas एक्स्ट्रा लार्ज और विशाल BioImager विश्लेषण के साथ मदद और सलाह के लिए रीको Bongaarts, फ्रांसिस Smet और एंजेला comas (संघ Biometrica) धन्यवाद. हम मछली Caretaking, और उपयोगी विचार विमर्श के लिए लीडेन विश्वविद्यालय से अन्य सहयोगियों के लिए डेवी डे विट, उल्रिके Nehrdich, और लौरा वैन Hulst धन्यवाद. इस शोध सामग्री बायोमेडिकल संस्थान, आर्थिक मामलों के डच मंत्रालय द्वारा सह वित्त पोषित के अनुसंधान कार्यक्रम की परियोजना P5.03 इबीसा का एक हिस्सा है, और आर्थिक मामलों के मंत्रालय ने नीदरलैंड के स्मार्ट मिक्स कार्यक्रम (NWOA_6QY9BM) की और से शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान के मंत्रालय ने नीदरलैंड. अतिरिक्त समर्थन यूरोपीय संघ परियोजना जेडएफ स्वास्थ्य (FP7 स्वास्थ्य 2009-242048) से प्राप्त किया गया था, और RMJ यूरोपीय संघ के प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क FishForPharma (PITN-ga-201 में अनुभवी शोधकर्ता के रूप में मैरी क्यूरी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया1-289209). SJR 115,337 ° अनुदान समझौते n के तहत अभिनव दवाओं पहल के संयुक्त उपक्रम से धन प्राप्त किया, संसाधनों, जिनमें से यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) और तरह contribution.The लेखकों में EFPIA कंपनियों आगे मानने से वित्तीय योगदान से बना रहे हैं रोबोटिक्स के लिए लीडेन विश्वविद्यालय कोष (LUF) से और Cyttron से वित्तीय सहायता, बदले में आर्थिक रूप से इमेजिंग सुविधाओं के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन द्वारा समर्थित है जो Besluit सब्सिडी Investeringen Kennisinfrastructuur कार्यक्रम में. Copas प्रणाली अधिग्रहण आंशिक रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO, 834.10.004) से वित्तीय सहायता के साथ पृथ्वी और लाइफ साइंसेज (ALW) के लिए विभाग द्वारा समर्थित किया गया.
Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |