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Medicine

रीयल टाइम में mesothelial कोशिकाओं की डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल अनुलग्नक और आक्रमण का आकलन

Published: May 20, 2014 doi: 10.3791/51655
Automatic Translation
1, 1,2
1Reproductive Development and Cancer Laboratory, MIMR-PHI Institute of Medical Research, 2Department of Developmental Biology and Anatomy, Monash University

Summary

पेरिटोनियम के mesothelial अस्तर में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका आक्रमण समय के साथ एक गतिशील प्रक्रिया है. एक वास्तविक समय विश्लेषक का उपयोग, एक अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सेल सह संस्कृति मॉडल में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक क्षमता metastatic प्रक्रिया को विनियमित करने वाले कारकों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, लंबे समय अवधि में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

Abstract

डिम्बग्रंथि के कैंसर peritoneal तरल पदार्थ में बहा और पेरिटोनियम भीतर बाहर साइटों के लिए dispersing द्वारा metastasize. कैंसर की कोशिकाओं को स्वाभाविक करने के लिए संलग्न और माध्यमिक ट्यूमर के रूप में पेरिटोनियल अस्तर हमलावर द्वारा metastatic प्रक्रिया में योगदान जो बहुकोशिकीय संरचनाओं में कुल के रूप में monolayer संस्कृतियों सही, एक nonadherent पर्यावरण के भीतर कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार मॉडल नहीं है. डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस, बहुकोशिकीय समुच्चय, या spheroids के इस महत्वपूर्ण चरण के लिए मॉडल, nonadherent परिस्थितियों में बनाए रखा स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों से उत्पन्न हो सकता है. Vivo में ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा सामना करना पड़ा पेरिटोनियल microenvironment नकल करने के लिए, एक अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सह संस्कृति मॉडल spheroids एक बाह्य मैट्रिक्स बाधा से अधिक का गठन, एक मानव mesothelial सेल monolayer के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है preformed जो में स्थापित किया गया था. तरीके तो मात्रात्मक वास्तविक संचालन करने के लिए एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक का उपयोग कर विकसित किया गयाspheroids के रूप में विकसित विभिन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के आक्रामक क्षमता की समय मापन. यह दृष्टिकोण पारंपरिक समापन बिंदु assays और अधिक श्रमसाध्य वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी छवि का विश्लेषण करती है पर कई फायदे हैं, जो समय की लंबी अवधि में आक्रमण की निरंतर माप के लिए अनुमति देता है. संक्षेप में, इस विधि समय के साथ मेसोथेलियल और मैट्रिक्स बाधाओं के माध्यम से हमलावर डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल कोशिकाओं के बीच बातचीत को विनियमित जो कारकों की एक तेजी से, दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है.

Introduction

डिम्बग्रंथि के कैंसर के सभी स्त्रीरोगों कैंसर 1 के उच्चतम मृत्यु दर है. दुनिया भर में, ~ 230,000 मामलों और वजह से हर साल 1 रोग से 100,000 से अधिक लोगों की मृत्यु रहे हैं. अधिकांश रोगियों (> 75%) कैंसर पहले से ही metastasized है के बाद इलाज के आगे कीमोथेरेपी की वृद्धि हुई प्रतिरोध से जटिल है जब, निदान और रोग का निदान 2 गरीब है कर रहे हैं. चरण-III चतुर्थ metastatic रोग के साथ मरीजों को केवल 30-40% 3 से 5 साल जीवित रहने की दर है. इस प्रकार, प्रभावी रूप से उन्नत बीमारी के इलाज के क्रम में डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस अंतर्निहित सेलुलर व्यवहार का एक बेहतर समझ के लिए एक तत्काल आवश्यकता है.

डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस के मौजूदा मॉडल जो ट्यूमर व्यवहार पर प्रभाव डालता है एक अलग microenvironment में होता है, जिनमें से प्रत्येक metastatic प्रक्रिया में कई कदम का प्रस्ताव है. Metastasizing डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को शुरू में प्राथमिक ट्यूमर साइट से शेड और एक nonadher में जीवित रह रहे हैंएकल कक्षों या तीन आयामी बहुकोशिकीय संरचनाओं के रूप में peritoneal तरल पदार्थ के भीतर ईएनटी राज्य, बहुकोशिकीय समुच्चय या spheroids 2,4,5 करार दिया. निलंबन में spheroids फार्म नहीं है जो कोशिकाओं anoikis 2,4,5 लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. Spheroids भी अवशिष्ट रोग और कैंसर 2,4,5 के बाद पुनरावृत्ति के लिए योगदान, रसायन - चिकित्सा के लिए प्रतिरोध वृद्धि हुई दिखा रहे हैं. डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस में एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम पेरिटोनियल दीवार और omentum 5,6 भीतर स्थापित माध्यमिक ट्यूमर के लिए मुक्त अस्थायी समूहों से समुच्चय का संक्रमण है. सेल सेल और सेल सब्सट्रेट बातचीत कुल गठन, अस्तित्व, और पेरिटोनियम 4-11 के mesothelial अस्तर द्वारा निर्मित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के पालन में फंसाया गया है. अभी तक, इन प्रक्रियाओं खराब समझ रहे हैं.

डिम्बग्रंथि के कैंसर के प्रसार में शामिल तंत्र को परिभाषित करने के लिए, spheroids gener हो सकता हैपैदा संस्कृति मीडिया 12,13 को methylcellulose जोड़कर या कम लगाव प्लेटें 2,14 पर संवर्धन कोशिकाओं द्वारा या तो निलंबन में कोशिकाओं को बनाए रखने, nonadherent संस्कृति तरीकों का उपयोग कर स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों से. इस तरह से सुसंस्कृत जब डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को विवो 2,14 में पाया ट्यूमर समुच्चय के समान ही है, सेलुलर आणविक, और जैव रासायनिक गुणों का प्रदर्शन जो बहुकोशिकीय समुच्चय या spheroids में इकट्ठा. गठन के बाद, spheroids बाद में nonadherent मध्यम से काटा जा सकता है और आगे कार्यात्मक अध्ययन के लिए ठोस सतहों की एक किस्म पर replated. यह सही ऐसे intraperitoneal तरल पदार्थ के रूप में एक nonadherent पर्यावरण के भीतर metastasizing डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार मॉडल नहीं है जो monolayer संस्कृति में assays पर एक अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है.

कैंसर spheroids की आक्रामक क्षमता Boyden कक्षों 2 में परंपरागत समापन बिंदु assays में मूल्यांकन किया जा सकता 15,16 हमलावर द्वारा mesothelial सेल निकासी के समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर तैयार किया गया है; बहरहाल, समय व्यतीत हो जाने के डेटा का विश्लेषण समय लगता है और व्यक्तिपरक हो सकता है. इस के साथ साथ, वास्तविक समय में डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids के आक्रामक व्यवहार का आकलन करने के लिए एक तेजी से, मात्रात्मक विधि वर्णित है. सबसे पहले, एक अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सेल मॉडल बहुकोशिकीय spheroids को देते हैं और माध्यमिक ट्यूमर के रूप में पेरिटोनियल अस्तर पर आक्रमण जब डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस के चरण का प्रतिनिधित्व करता है जो स्थापित किया गया था. फिर एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक (RTCA, कंपनी विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें) के लिए कार्यप्रणाली spheroids के रूप में हो गई है और इस मॉडल में परीक्षण अलग डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के आक्रामक क्षमता की मात्रात्मक वास्तविक समय माप का संचालन करने के लिए अनुकूलित किया गया था.

RTCA में मेंstrument, सेलुलर प्रतिक्रियाओं विद्युत प्रतिबाधा में बदलाव को मापने के द्वारा, एक्सोजेनस लेबल के लिए आवश्यकता के बिना, एक परख के पाठ्यक्रम पर लगातार निगरानी कर रहे हैं. विशेष रूप से डिजाइन संस्कृति प्लेटें एक अच्छी तरह से 2 संभाग '(यूके' प्लेट) के ऊपरी और निचले कक्षों के बीच इंटरफेस में एक microporous झिल्ली के नीचे स्थित स्वर्ण लेपित microelectrodes है. कोशिकाओं को एक ईसीएम या ईसीएम / सेलुलर बाधा के माध्यम से आक्रमण के रूप में निचले सदन में इलेक्ट्रोड के स्थान विद्युत प्रतिबाधा में परिवर्तन की माप के लिए सक्षम बनाता है. प्रत्येक यूके प्लेट अच्छी तरह से 2 कक्षों के बीच झिल्ली इंटरफ़ेस सबसे पहले ब्याज की ईसीएम घटक के साथ लेपित है. अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सेल मॉडल प्रणाली में, इंटरफेस मानव मेसोथेलियल का एक मिला हुआ monolayer द्वारा पीछा पेरिटोनियम के mesothelial अस्तर अंतर्निहित जटिल ईसीएम की नकल करने Matrigel की एक परत (कंपनी के विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें), 'साथ लेपित है लक्ष्य 'कोशिकाओं. अंत में, पूर्व गठित डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids विज्ञापन कर रहे हैंded. डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल कोशिकाओं को सक्रिय रूप से नीचे कक्ष तक पहुंचने और विद्युत प्रतिबाधा रीडिंग को बदलने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की परत और मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण करना होगा. अपने दम पर लक्ष्य कोशिकाओं भी वे मैट्रिक्स परत के माध्यम से आक्रमण और इस परख में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं.

Protocol

1. तैयारी प्रकोष्ठों की, मीडिया, और अभिकर्मकों

  1. Methylcellulose युक्त मध्यम की तैयारी
    1. एक 250 मिलीलीटर कुप्पी में बाँझ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) (कोई additives) की 100 मिलीलीटर में methylcellulose के 1.5 ग्राम भंग.
    2. 5 मिनट के लिए माइक्रोवेव में कम पर समाधान गर्मी; पर उबलते से बचने के लिए ध्यान रखना.
    3. Methylcellulose पाउडर अर्द्ध भंग कर रहा है एक बार, 125 मिलीलीटर मात्रा लेने के लिए एक साफ चुंबकीय उत्तेजक और मीडिया जोड़ें.
    4. , पलटना मिक्स, और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सरगर्मी से पीछा 1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हलचल.
    5. चार 50 मिलीलीटर ट्यूब और 2300 x जी पर 1.5 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र में समान रूप से समाधान फूट डालो.
    6. अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट, अत्यधिक चिपचिपा बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (शेयर के लगभग 90-95%), विभाज्य, और दुकान लीजिए.
  2. संस्कृति और कोशिकाओं के लेबल
    1. एक ती में monolayer में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों का रखरखाव10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल के साथ पूरक: 37 डिग्री सेल्सियस, (OVCA429 और OVCA433 सेल लाइनों 18 के लिए M199 केजीएन कोशिकाओं 17 और MCBD110 के लिए DMEM) उचित विकास मीडिया में 5% सीओ 2 ssue संस्कृति इनक्यूबेटर glutamine, और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन.
    2. M199 में LP9 मानव mesothelial कोशिकाओं को बनाए रखें: Hams F12 मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक मशीन में 15% FBS, 10 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) और 400 एनजी / एमएल hydrocortisone युक्त.
    3. बीज वांछित कुप्पी आकार में कोशिकाओं और लगभग 75% confluency तक हो जाना. 0.05% trypsin / EDTA, 5 मिनट के लिए 186 XG पर स्पिन, और पीबीएस के साथ दो बार सेल गोली धोने का उपयोग करने trypsinization द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं.
    4. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
  3. वैकल्पिक फ्लोरोसेंट सेल लेबल विधि
    1. Prewarmed PBS/0.1% BSA के 1 मिलीलीटर में 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में Resuspend कैंसर कोशिकाओं.
    2. 5 मिमी शेयर सेल टोबैगो के 2 μl जोड़ेंइक्का CSFE समाधान (या लंबे समय तक बनाए रखा है जो अन्य वरीय सेल लेबल) 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं के लिए और एक waterbath में 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    3. Centrifugation द्वारा 10% FBS और फिर से गोली युक्त बर्फ के ठंडे माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया बुझाने. उचित prewarmed मध्यम विकास के 10 एमएल में Resuspend (चरण 1.2.1 देखें).
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 75 सेमी 2 फिल्टर से ढकी फ्लास्क और संस्कृति में बीज कोशिकाओं, 5% सीओ 2.
    5. प्रतिदीप्ति लेबलिंग के स्तर का पता लगाने के लिए पर्याप्त है कि सत्यापित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें. कोशिकाओं लगभग 75% confluency, फसल पहुँचने के लिए और कदम 1.2.3 और ऊपर 1.2.4 में के रूप में गिनती एक बार.

Methylcellulose में Spheroids के 2. जनरेशन

  1. (300000 कोशिकाओं की कुल प्रत्येक पूर्ण 96 अच्छी तरह से थाली प्रयोग के लिए आवश्यक हैं) उपगोल पीढ़ी के लिए आवश्यक धारा 1 से डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं की मात्रा की गणना. नहींते: यहां प्रस्तुत तुलना में अलग सेल लाइनों का उपयोग करते हैं, तो वर्दी अंडाकार आकृति पीढ़ी के लिए सेल घनत्व प्रत्येक पंक्ति के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है.
  2. Methylcellulose मीडिया में कोशिकाओं के कमजोर पड़ने की गणना करने के लिए, सबसे पहले 15 मिलीलीटर से (2.1 कदम) आवश्यक सेल की मात्रा घटाना.
  3. , प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए संस्कृति के माध्यम से उपयुक्त की मात्रा 15 मिलीग्राम शून्य से सेल की मात्रा के बराबर (अंतिम 20% methylcellulose बनाने के लिए) और कोमल उलटा द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से methylcellulose शेयर समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. Methylcellulose युक्त मध्यम करने के लिए 300,000 कोशिकाओं जोड़ें और कोमल उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रित.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 96 अच्छी तरह अवतल नीचे संस्कृति थाली और संस्कृति के प्रत्येक कुएं में (3000 कोशिकाओं / अच्छी तरह के कुल के लिए) सेल / methylcellulose / मीडिया मिश्रण के पिपेट 150 μl, 5% सीओ 2 के 1-4 दिनों के लिए या वर्दी spheroids (1 उपगोल / अच्छी तरह से आम तौर पर मनाया जाता है) फार्म तक.

3. RTCA सेल आक्रमण assays

कोईते: विरोध रीडिंग सेल सूचकांक (सीआई), सेल की स्थिति का प्रतिनिधित्व मापा सेल प्रतिबाधा में एक रिश्तेदार परिवर्तन है जो एक आयामरहित पैरामीटर के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. Microsoft एक्सेल जैसे एक स्प्रेडशीट में विश्लेषण के लिए, आयात डाटा,.

  1. प्लेट तैयारी
    1. एक समय में 4 कुओं के समूह में कार्य करना, कुल सतह क्षेत्र को कवर किया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए एक 16 अच्छी तरह RTCA यूके थाली के ऊपरी सदन के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए (सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया में पतला 1:10) 50 μl मैट्रिक्स जोड़ . किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ से छुटकारा पाने के लिए, धीरे धीरे तुरंत मैट्रिक्स के 30 μl निकालें, लेकिन.
    2. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में उपयोग करने से पहले 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
    3. प्रत्येक कैंसर सेल ऊपरी सदन के लिए लाइन और निचले सदन के लिए (अपने प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार) के साथ या सीरम के बिना मीडिया के 160 μl के लिए उपयुक्त सीरम मुक्त मध्यम (SFM) का 30 μl जोड़ें.
    4. ऊपरी सदन और equilibr में निचले सदन क्लिक करके यूके प्लेट इकट्ठाएक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में खा लिया.
  2. RTCA साधन प्रोग्रामिंग
    1. RTCA कार्यक्रम खोलें और 'लेआउट' टैब का चयन करें. सभी प्रयोगात्मक कुओं को हाइलाइट करें.
    2. राइट कुओं पर क्लिक करें और 'कुओं पर बारी' का चयन करें; वांछित के रूप में तो प्रयोगात्मक शर्तों और सेल के नाम में भरें.
    3. , कार्यक्रम के लिए कदम या substeps जोड़ 'एक कदम जोड़ें' पर 'अनुसूची' टैब और ठीक क्लिक करें का चयन करें. पहले कदम के लिए चुना जाता है 'एक कदम जोड़' एक बार स्वचालित रूप से कार्यक्रम में शामिल किया है जो एक preprogrammed पृष्ठभूमि झाडू, है.
    4. LP9 monolayer की स्थापना के दौरान रीडिंग रिकॉर्ड होगा जो RTCA कार्यक्रम के चरण 2 के लिए वांछित कार्यक्रम विवरण दर्ज करें. '' अंतराल 'टैब का चयन और '15 मिनट दर्ज करके प्रतिबाधा रीडिंग के बीच समय अंतराल में जोड़ें. 'अवधि' टैब एक का चयन करके प्रयोगात्मक अवधि में जोड़ेंडी 12-24 घंटा के बीच एक समय में प्रवेश.
    5. बाद के चरणों में जोड़ने के लिए, 'एक कदम जोड़ें' पर 'अनुसूची' टैब और ठीक क्लिक करें का चयन करें और ऊपर के रूप में, अतिरिक्त कदम का विवरण दर्ज करें. RTCA कार्यक्रम के चरण 3 उपगोल आक्रमण के दौरान रीडिंग लेने के लिए साधन निर्देशित करेंगे; 'अवधि' टैब के तहत अंतराल 'टैब और '48 घंटा' के तहत ''5 मिनट में प्रवेश.
    6. मेनू पट्टी पर 'प्लेट' का चयन करें और बचाने के लिए.
  3. उपगोल आक्रमण की LP9 monolayer और मापन की पीढ़ी
    1. ऊपर 3.2 चरण से RTCA साधन और खुले कार्यक्रम में यूके प्लेट रखें. पिछले कोशिकाओं को जोड़ने के लिए, मेनू बार में 'निष्पादित करें' और फिर 'आरंभ'. एक पृष्ठभूमि झाडू स्वतः (RTCA सॉफ्टवेयर निर्देश में चरण 1) प्रदर्शन किया जाएगा.
    2. एक टिशू कल्चर हुड में पृष्ठभूमि झाडू और जगह निम्नलिखित साधन से यूके थाली निकालें.
    3. प्लेट 50,000 LP9 कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रत्येक यूके थाली के ऊपरी सदन में 160 μl SFM में निलंबित कर दिया.
    4. RTCA साधन में थाली प्लेस और LP9 monolayer (RTCA कार्यक्रम के चरण 2) रात भर की स्थापना है, जबकि रीडिंग हर 15 मिनट लेते हैं.
    5. हार्वेस्ट कैंसर spheroids ऊपर, चरण 2 'जनरेशन methylcellulose में spheroids की' के तहत उत्पन्न.
      1. Aseptically, 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के ऊपर से 1 मिमी कटौती और धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक की सामग्री प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल करते हैं. एक बाँझ ट्यूब पर स्थानांतरण.
      2. अपकेंद्रित्र 8 मिनट के लिए 120 XG पर spheroids, और कोमल आकांक्षा से methylcellulose युक्त मध्यम निकालें.
      3. प्रत्येक धोने के बाद spheroids गोली 8 मिनट के लिए 120 XG पर centrifuging, पीबीएस के साथ दो बार अधिक spheroids धो लें.
      4. प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह के लिए, FBS बिना माध्यम के 160 μl में 10 spheroids की कुल resuspend.
      5. मेनू पट्टी से 'निष्पादित करें' का चयन और जाँच और से RTCA प्रयोग रोक# 8216; से रोकें. साधन से यूके थाली निकालें, और एक टिशू कल्चर हुड में जगह है. महाप्राण प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया से दूर और LP9 केवल नियंत्रण कुओं के लिए अंडाकार आकृति युक्त मीडिया (160 μl में 10 क्षेत्रों) या ताजा मीडिया के साथ की जगह.
    6. RTCA साधन के लिए थाली लौटें. मेनू पट्टी से 'निष्पादित करें' और 'कदम को विफल करें' जाँच का चयन करें. प्रोग्राम स्वचालित रूप से अगले कदम के लिए कदम होगा. प्रयोग को फिर से शुरू करने के लिए, मेनू पट्टी से 'निष्पादित करें' और 'आरंभ / जारी' की जांच का चयन करें. RTCA कार्यक्रम में चरण 3 आरंभ हो जाएगा.
  4. डेटा विश्लेषण
    1. अंडाकार आकृति सेल invasiveness के स्तर को निर्धारित करने के लिए, केवल प्रत्येक timepoint पर डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के लिए प्राप्त व्यक्ति रीडिंग से LP9 monolayer के लिए प्राप्त मूल्यों घटाना.
    2. 'उपगोल आक्रमण' साजिश करने के लिए, एस द्वारा, spheroids थाली करने के लिए जोड़ा गया था, जिस पर समय बात करने के लिए सभी मूल्यों को सामान्य'0 'के लिए उस समय के बिंदु etting.

Representative Results

डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids निलंबन में उन्हें संवर्धन द्वारा या घातक जलोदर 2,14 से प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं कटाई से सेल लाइनों के कई प्रकार से उत्पन्न हो सकता है. यहाँ दो उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों, OVCA433 और OVCA429, और एक डिम्बग्रंथि granulosa सेल ट्यूमर लाइन, केजीएन, spheroids (चित्रा 1 ए) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Methylcellulose के अलावा द्वारा चिपचिपा बना दिया गया है जो मीडिया में निलंबित कर दिया, जबकि इस विधि में, कोशिकाओं यू तली कुओं में सुसंस्कृत हैं. इन शर्तों के तहत, कई डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं spheroids 13 फार्म करने के लिए कुल एक अंतर्निहित क्षमता दिखा रहे हैं. Methylcellulose / मीडिया में निलंबित रातोंरात संस्कृति के बाद, सभी तीन सेल लाइनों व्यास में लगभग 400-500 माइक्रोन (चित्रा 1 ए) की कॉम्पैक्ट अंडाकार आकृति संरचनाओं का गठन. इस बीच, RTCA यूके प्लेट सबसे पहले मैट्रिक्स और मानव एमईएस की तो एक मिला हुआ monolayer साथ झरझरा झिल्ली इंटरफ़ेस कोटिंग से, तैयार किया जाता हैothelial कोशिकाओं (चित्रा 1 बी). एक बार का गठन, spheroids तो तैयार यूके थाली करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. काटा कैंसर spheroids LP9 monolayer के शीर्ष पर चढ़ाया और नीचे वर्णित के रूप में मूल्यांकन कर रहे हैं. समानांतर संस्कृतियों का (वैकल्पिक सेल लेबलिंग कदम पीछा किया गया था अगर या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत,) मानक चरण माइक्रोस्कोपी के तहत छवियाँ RTCA डेटा की व्याख्या (चित्रा 1C) में सहायता करने के लिए समय समय पर लिया जाता है.

यह एक कैंसर कोशिका लाइन के आक्रमण के बेसल स्तर है, साथ ही chemoattractant प्रेरित आक्रमण दोनों का आकलन करने के लिए जानकारीपूर्ण है. आमतौर पर, बेसल invasiveness दोनों ऊपरी और निचले कक्षों को SFM के अलावा द्वारा मापा जाता है. कई संभावित chemoattractants होता है जो पूरा मीडिया (10% FBS), 'chemoattractant प्रेरित' आक्रमण (चित्रा 2) की जांच के लिए मौजूदा उदाहरण में प्रयोग किया जाता है. अकेले LP9 mesothelial कोशिकाओं के समानांतर अध्ययन इन कोशिकाओं न्यूनतम में हैं पुष्टि की है किvasive इस प्रकार बेसल या 'chemoattractant' प्रेरित शर्तों और या तो नीचे से अधिक 2 दिनों डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति assays में उपयोग करने के लिए एक अच्छा सेल प्रकार थे (आंकड़े 2A और 2 बी). इसके विपरीत, तीन सेल लाइनों में से किसी का उपयोग कर उत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids एक chemoattractant (एफबीएस) (आंकड़े 2A -2 सी) की ओर आक्रमण करने की क्षमता का प्रदर्शन किया. परंपरागत समापन बिंदु assays अधिक RTCA वास्तविक समय उपकरणों का उपयोग करने का प्रमुख लाभ सेल / अंडाकार आकृति व्यवहार में बदलाव समय के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. 2 दिन परख में, केजीएन, OVCA429, और OVCA433 सेल लाइनों सब एक (सेल सूचकांक में वृद्धि से संकेत) chemoattractant लेकिन आक्रमण के कम बेसल स्तर (चित्रा -2) की ओर आक्रमण करने की क्षमता का प्रदर्शन किया. घटता (चित्रा -2) के समानांतर ढलानों से संकेत के रूप में सेल लाइनों, आक्रमण की समान दर का प्रदर्शन किया; हालांकि, OVCA429 वक्र एक उच्च ऊपरी asymptote का प्रदर्शन,जो अन्य सेल लाइनों की तुलना में आक्रमण के एक उच्च अधिकतम स्तर का संकेत दिया. इसके अलावा, सेल लाइनों केजीएन कोशिकाओं को जल्दी चित्रा (2 डी) क्रमश: आक्रमण करने के लिए लंबे समय तक 3-5X लेने सेल और मैट्रिक्स बाधाओं और OVCA433 और OVCA429 कोशिकाओं पर हमला करने के साथ, आक्रमण की शुरुआत करने के लिए अपने समय में अंतर का प्रदर्शन किया. महत्वपूर्ण बात है, आक्रमण की शुरुआत में उनके व्यवहार आक्रमण के लिए उनके समग्र क्षमता (आंकड़े -2 सी और 2 डी) की भविष्यवाणी नहीं थे. यह कैंसर कोशिका लाइनों के विभिन्न अंतर्निहित क्षमताओं से पता चलता है, लेकिन यह भी विभिन्न कारकों spheroids की जल्दी और देर से आक्रामक व्यवहार को विनियमित करते हैं कि संकेत हो सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रयोगात्मक की उपगोल पीढ़ी और मॉडल एक की स्थापना की.:. मैं. बी methylcellulose / मीडिया (ऊपर) में बनाने spheroids के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत और एक monolayer (नीचे) के रूप में विकसित मिलान सेल लाइन की Mages: योजनाबद्ध RTCA 2 यूके प्लेट अच्छी तरह से डिम्बग्रंथि के कैंसर पूर्व गठित जिसमें, की स्थापना की संभाग दिखा spheroids एक chemoattractant रूप FBS ± ऊपरी सदन और मीडिया में एक LP9 मेसोथेलियल परत / मैट्रिक्स बाधा के एक monolayer के शीर्ष पर चढ़ाया जाता निचले सदन में जोड़ा जाता है. . चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (बाएं) या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (दाएं) के तहत LP9 monolayer के शीर्ष पर केजीएन spheroids का चित्र: अधिक कोशिकाओं निचले सदन सी के लिए बाधाओं के माध्यम से आक्रमण के रूप में बिजली प्रतिबाधा बढ़ती 2 कक्षों उपाय के इंटरफेस के नीचे इलेक्ट्रोड. स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


.. चित्रा 2 वास्तविक समय डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल आक्रमण डेटा एक - बी: अच्छी तरह से एक यूके प्लेट के नीचे कक्ष में FBS के साथ और बिना आयोजित एक RTCA आक्रमण परख से प्रतिनिधि परिणाम है. केजीएन सेल आक्रमण LP9 mesothelial कोशिकाओं की तुलना में है. परिणाम 24 घंटा timepoint (ए) में और एक पूरे दो दिन परख अवधि (बी) पर तीन प्रतियों कुओं से मतलब ± एसडी सेल सूचकांक के रूप में दिखाए जाते हैं सी - डी:. केजीएन, OVCA429 की आक्रामक क्षमता की तुलना, और OVCA433 सेल एक 24 घंटे की अवधि (सी) से अधिक और 2.5 घंटा समय अवधि (डी) पर अधिक विस्तृत फैशन में दिखाया गया लाइनों.

Discussion

हमलावर डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं fibroblasts, adipocytes, और mesothelial कोशिकाओं सहित पेरिटोनियम की सतह पर सेल प्रकार की एक किस्म के साथ बातचीत, और कैंसर कोशिकाओं और peritoneal कोशिकाओं के बीच द्विदिश संचार metastatic प्रक्रिया 2 ड्राइविंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सोचा है. एक बार जब महारत हासिल है, के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल पेरिटोनियल microenvironment के भीतर इन संबंधों के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलनीय है, जैसे, एक्सोजेनस साइटोकिन्स, वृद्धि कारक है, या यूके में अच्छी तरह से थाली या आनुवंशिक हेरफेर के ऊपरी या निचले कक्षों के लिए विशिष्ट inhibitors के अलावा के माध्यम से कैंसर या पेरिटोनियल सेल लाइनों की. इसके अलावा, इस विधि विनियामक संकेत और peritoneal गुहा के भीतर एक metastatic घाव की स्थापना को नियंत्रित करने वाले सेलुलर बातचीत में प्रत्यक्ष अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए घातक जलोदर और / या प्राथमिक peritoneal कोशिकाओं से हौसले से काटा प्राथमिक डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया जा सकता है

एकल कक्षों या spheroids की आक्रामक क्षमता को मापने के लिए RTCA साधन का प्रयोग पारंपरिक एकल समापन बिंदु assays और समय चूक छवि का विश्लेषण करती है पर कई लाभ प्रदान करता है. RTCA साधन घंटे या दिन हो सकता है जो एक परख, के पाठ्यक्रम पर लगातार अंतराल परिभाषित सेलुलर आक्रमण के उपाय. यह एकल समापन बिंदु assays की सीमाओं पर काबू जो समय के साथ आक्रमण की दर में परिवर्तन के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, एक समापन बिंदु (चित्रा 2), उदाहरण के लिए, 3 घंटा में विभिन्न कैंसर कोशिका लाइनों से आक्रमण डेटा की जांच, केजीएन और OVCA433 कोशिकाओं कहीं अधिक आक्रामक OVCA429 कोशिकाओं की तुलना में थे कि गलत निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व हो सकता है. इस तकनीक का एक और लाभ RTCA साधन विद्युत प्रतिबाधा में बदलाव उपाय है. इस assays सेल Phen पर अनायास ही प्रभाव हो सकता है, जो एक exogenous एजेंट के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के बिना चलाए जा सकता है कि इसका मतलब हैotype या समारोह. यह उनके vivo प्रकृति 2 को प्रतिबिंबित नहीं कर रहे हैं जो आणविक और प्ररूपी परिवर्तन शुरू करने से बचने के लिए एक न्यूनतम करने के लिए जोड़तोड़ रखना अनिवार्य है, जिसके साथ घातक जलोदर, से व्युत्पन्न प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं का अध्ययन करने पर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है. इसके अलावा, RTCA साधन का उपयोग समय समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ जुड़ा विश्लेषण लेने से बचा जाता है, लेकिन यह भी परख अनुकूलन के लिए कुंजी प्रयोगात्मक खिड़कियों के तेजी से दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है, जो न केवल वास्तविक समय में मात्रात्मक डेटा के संग्रह के लिए सक्षम बनाता है. उपगोल आक्रमण पर कारकों की एक सीमा के प्रभाव की तुलना करने पर यह विशेष रूप से उपयोगी है, के रूप में विभिन्न कारकों अलग timepoints पर या समय के साथ बहुत अलग प्रोफाइल के साथ अपने अधिक से अधिक प्रभाव डालती सकता है.

इस प्रोटोकॉल परिवर्तन (जैसे, के लिए उत्तरदायी है हालांकि अलग ईसीएम मैट्रिक्स, विभिन्न कैंसर कोशिका लाइनों, या अलग लक्ष्य सेल का उपयोगऐसा करने से अगर लोकसभा),, यह विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों पहली अनुकूलित किया जाना चाहिए कि नोट करना महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, पिछले उपगोल आक्रमण की पढ़ाई शुरू करने, कैंसर कोशिकाओं / यूके थाली के इष्टतम संख्या वैसे पहले monolayer संस्कृति में सेल नंबर titrations की परख द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. अच्छी तरह से प्रति उपयोग करने के लिए spheroids के इष्टतम संख्या तो इस विश्लेषण पर आधारित है. पहले उत्पन्न करते हैं, उदाहरण के लिए, वर्तमान विधि में, spheroids प्रत्येक लगभग 3000 कोशिकाओं शामिल. प्रारंभिक सेल नंबर titrations monolayer में 30,000 कोशिकाओं का विश्लेषण करती आक्रमण में पता लगाने के लिए इष्टतम संकेत मिलता है कि, तो 10 spheroids अच्छी तरह यूके प्लेट प्रति जोड़ रहे हैं. सह संस्कृति प्रयोगों का आयोजन इसके अलावा, जब यह अलग से इन कोशिकाओं को इस परिणाम उलझाना सकता है, जैसा कि स्वाभाविक आक्रामक रहे हैं ताकि यह निर्धारित करने में 'लक्ष्य' सेल monolayer के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. का प्रदर्शन उदाहरण में, कैंसर spheroids एक LP9 सेल monola के शीर्ष पर चढ़ाया जाता हैFBS के साथ और बिना Yer, एक chemoattractant के रूप में अच्छी तरह से नीचे तक गयी. समानांतर में, LP9 कोशिकाओं प्रत्येक उपचार शर्त के तहत अकेले सुसंस्कृत हैं.

कोशिकाओं और spheroids की आक्रामक क्षमता का अध्ययन इसी प्रकार, जब यह दो व्यवहार (माइग्रेशन नहीं करता है, जबकि यानी आक्रमण एक ईसीएम बाधा के proteolytic पाचन की आवश्यकता है) भेद करने के क्रम में उनके साथ ही प्रवासी क्षमताओं की जांच के लिए भी महत्वपूर्ण है. ऐसा करने के लिए, ईसीएम बाधा न आना (3.1.1 कदम - 3.1.3) और जगह में ईसीएम बाधा के साथ समानांतर में परख आचरण. अगर वांछित उत्तरार्द्ध 'आक्रमण' उपाय, पूर्व 'माइग्रेशन' उपाय करने के लिए सही किया जा सकता है. कोशिकाओं नीचे चेंबर में हमला किया है एक बार, उनके लगाव, प्रसार, और झिल्ली के नीचे पर प्रसार में परिवर्तन में परिवर्तन करने के लिए योगदान कर सकते हैं: अंत में, यह विद्युत प्रतिबाधा के उपायों से प्राप्त जानकारी के दायरे में सीमित है कि नोट करना महत्वपूर्ण है प्रतिबाधा वजहdings. व्यापक अंडाकार आकृति सेल व्यवहार का आकलन करने के क्रम में अंडाकार आकृति सेल व्यवहार्यता, आसंजन, प्रवास, और आकृति विज्ञान की अन्य assays के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल करते हैं, इसलिए, इस पद्धति सबसे जानकारीपूर्ण है. अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान और स्वास्थ्य के गुणात्मक आकलन आक्रमण की मात्रात्मक RTCA assays के साथ समानांतर में किया जा सकता है, ताकि उदाहरण के लिए, आदर्श रूप में, पूरी तरह से अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल बातचीत को समझने के क्रम में, अलग सह संस्कृतियों भी मानक चरण माइक्रोस्कोपी के तहत समय समय पर imaged किया जाना चाहिए. वैकल्पिक लेबलिंग कदम किया जाता है तो वे अंडाकार आकृति से disaggregate और unlabeled mesothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत के रूप में, फिर भी कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत निर्धारित किया जा सकता है. एक दूसरा सेल प्रकार के साथ सह संवर्धन जब fluorescently कैंसर कोशिकाओं लेबलिंग का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह केवल कैंसर कोशिकाओं सेल और ईसीएम बाधाओं के माध्यम से आक्रमण किया है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए तो संभव है कि है.

Acknowledgments

यह काम एक CASS फाउंडेशन विज्ञान और चिकित्सा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; (एमबी); ऑस्ट्रेलिया परियोजना अनुदान की एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (KLS, 338516); और विक्टोरियन सरकार का परिचालन बुनियादी सुविधाओं सहायता कार्यक्रम (ऑस्ट्रेलिया) से.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
xCELLigence RTCA DP Analyser ACEA biosciences RTCA DP
xCELLigence CIM plates  ACEA biosciences 5665817001
Cell TraceTM CFSE  Molecular Probes C34554
Methylcellulose (4,000 centipose) Sigma M0512
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies  11966-025
Medium 199  Life Technologies  11150067
Ham's F-12 Nutrient mix Life Technologies  11765062
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech  100-15
Hydrocortisone  Sigma H4001
Trypsin EDTA Gibco-Invitrogen 15400-054
96-well concave culture plate  Grenier Bio-One 650185
LP9 Human mesothelial cell line Coriell Institute for Medical Research  AG07086
Growth Factor-reduced Matrigel matrix BD Biosciences  354230

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References

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चिकित्सा अंक 87 डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस आक्रमण mesothelial कोशिकाओं spheroids वास्तविक समय विश्लेषण
रीयल टाइम में mesothelial कोशिकाओं की डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल अनुलग्नक और आक्रमण का आकलन
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Bilandzic, M., Stenvers, K. L. Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time. J. Vis. Exp. (87), e51655, doi:10.3791/51655 (2014).

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