Summary
Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.
Abstract
Tumori ovarici metastasi versando nel liquido peritoneale e disperdendo ai siti distali all'interno del peritoneo. Colture monostrato non modellare accuratamente i comportamenti delle cellule tumorali in un ambiente non aderente, come le cellule tumorali intrinsecamente aggregano in strutture multicellulari che contribuiscono al processo metastatico legandosi e invadendo il rivestimento peritoneale di formare tumori secondari. Per modellare questa importante fase di metastasi del cancro ovarico, aggregati multicellulari, o sferoidi, possono essere generati da linee cellulari di carcinoma ovarico istituiti conservato in condizioni non aderenti. Per simulare il microambiente peritoneale incontrato dalle cellule tumorali in vivo, un modello di co-coltura sferoide-mesoteliali stato stabilito in cui preformate sferoidi sono placcati su di un monostrato di cellule mesoteliali umano, formata su una barriera matrice extracellulare. Metodi sono stati poi sviluppati utilizzando un analizzatore di cella in tempo reale per condurre reale quantitativamisure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi. Questo approccio consente la misura continua di invasione per lunghi periodi di tempo, che ha diversi vantaggi rispetto saggi endpoint tradizionali e analizza immagine microscopia tempo reale più laborioso. In breve, questo metodo permette una rapida determinazione dei fattori che regolano le interazioni tra cellule ovariche sferoidali cancro invasione attraverso mesoteliali e matrice ostacoli nel tempo.
Introduction
Il cancro ovarico ha il più alto tasso di mortalità di tutti i tumori ginecologici 1. In tutto il mondo, ci sono ~ 230.000 casi e 100.000 decessi dovuti alla malattia ogni anno 1. La maggior parte dei pazienti (> 75%) sono diagnosticati dopo che il cancro si è già metastatizzato, quando il trattamento è ulteriormente complicata da una maggiore resistenza alla chemioterapia e la prognosi è infausta 2. I pazienti con stadio III-IV malattia metastatica hanno 5 anni i tassi di sopravvivenza di solo il 30-40% 3. Pertanto, vi è una necessità urgente di una migliore comprensione dei comportamenti cellulari alla base metastasi del cancro ovarico per trattare efficacemente la malattia avanzata.
L'attuale modello di metastasi del cancro ovarico propone diverse fasi nel processo metastatico, ciascuno dei quali si verifica in un microambiente distinto che incide sul comportamento del tumore. Metastatico delle cellule tumorali ovariche inizialmente cadono dal sito del tumore primario e sopravvivere in un nonadherstato ent nel fluido peritoneale come singole cellule o strutture multicellulari tridimensionali, definito aggregati multicellulari o sferoidi 2,4,5. Le cellule che non fanno sferoidi in sospensione sono più suscettibili a anoikis 2,4,5. Sferoidi esibiscono anche una maggiore resistenza a chemioterapici, contribuendo alla malattia residua e successiva ricorrenza del cancro 2,4,5. Un secondo passo fondamentale nella metastasi del cancro ovarico è il passaggio di aggregati da cluster free-floating ai tumori secondari stabiliti all'interno della parete peritoneale e omento 5,6. Interazioni cellula-cellula e cellula-substrato sono stati implicati nella formazione di aggregati, la sopravvivenza e l'adesione alla matrice extracellulare (ECM) prodotta dal rivestimento mesoteliali del peritoneo 4-11. Al momento, questi processi sono poco conosciuti.
Per definire i meccanismi coinvolti nella diffusione dei tumori ovarici, sferoidi possono essere generATED da linee cellulari di cancro stabiliti con metodi di coltura non aderenti, mantenendo le cellule in sospensione o aggiungendo metilcellulosa ai terreni di coltura 12,13 o coltivando cellule su piastre basso attaccamento 2,14. Quando coltivate in questo modo, le cellule tumorali ovariche assemblano in aggregati multicellulari o sferoidi che presentano analoghe proprietà cellulari, molecolari e biochimici a quelli degli aggregati tumorali presenti in vivo 2,14. Dopo la formazione, sferoidi possono essere successivamente raccolti dal mezzo nonadherent e ripiastrate su una varietà di superfici solide per ulteriori studi funzionali. Questo rappresenta un progresso rispetto saggi in coltura monostrato, che non modellare accuratamente i comportamenti di cellule tumorali ovariche metastatizzanti all'interno di un ambiente nonadherent come fluido intraperitoneale.
La capacità invasiva delle sferoidi tumorali può essere valutata in saggi endpoint tradizionali Boyden camere 2 15,16; Tuttavia, l'analisi di dati time lapse richiede tempo e può essere personale. Qui, una rapida, metodo quantitativo per valutare i comportamenti invasivi di sferoidi tumorali ovariche in tempo reale è descritto. In primo luogo, un modello cellulare sferoide-mesoteliali è stato stabilito che rappresenta la fase di metastasi del cancro ovarico quando sferoidi multicellulari attaccarsi e invadere il rivestimento peritoneale a formare tumori secondari. Poi metodologia per un analizzatore in tempo reale cellulare (RTCA, vedere la tabella Materiali per i dettagli dell'azienda) è stato adattato per condurre quantitativi reali misure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi e testati in questo modello.
Nel RTCA instrumento, risposte cellulari vengono monitorati in continuo nel corso di un saggio, senza la necessità di etichette esogeni, da variazioni di impedenza elettrica di misura. Piastre di coltura appositamente progettati hanno microelettrodi oro rivestite situati sotto una membrana microporosa all'interfaccia tra le camere superiori e inferiori di un 2 concamerate bene (piastre «CIM»). La posizione degli elettrodi nella camera inferiore consente la misurazione delle variazioni di impedenza elettrica come cellule invadono attraverso un ECM o ECM / barriera cellulare. L'interfaccia membrana tra le 2 camere di ciascuna piastra CIM bene viene dapprima rivestito con il componente ECM di interesse. Nel sistema modello cellulare sferoide-mesoteliali, l'interfaccia è rivestita con uno strato di Matrigel (vedere la tabella Materiali per i dati aziendali), per imitare il complesso ECM sottostante il rivestimento mesoteliali del peritoneo, seguito da un monostrato confluente di mesoteliali umano ' "cellule bersaglio. Infine, preformati sferoidi tumorali ovariche sono annuncided. Cellule sferoidali cancro ovarico devono invadere attivamente attraverso lo strato di cellule bersaglio e la matrice per raggiungere la camera inferiore e alterare le letture di impedenza elettrica. Cellule bersaglio in proprio sono valutati anche per garantire che essi non invadono attraverso lo strato di matrice e sono adatti per l'uso in questo saggio.
Protocol
1. Preparazione di cellule, dei media e reagenti
- Preparazione di-metilcellulosa contenente Piano
- Sciogliere 1.5 g di metilcellulosa in 100 ml di sterile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (senza additivi) in un pallone da 250 ml.
- Riscaldare la soluzione sul basso in un forno a microonde per 5 min; fare attenzione ad evitare bollente.
- Una volta che la polvere metilcellulosa è semi-sciolto, aggiungere un agitatore magnetico pulito e mezzi per prendere il volume a 125 ml.
- Mescolare, invertito, e agitare a temperatura ambiente per 1,5 ore, seguita da agitazione a 4 ° C per una notte.
- Dividere la soluzione altrettanto in quattro provette da 50 ml e centrifugare per 1,5 ore a 2.300 x g.
- Raccogliere il chiaro, surnatante altamente viscoso (circa il 90-95% delle azioni), un'aliquota in sterili provette da 50 ml e conservare a 4 ° C per un massimo di 3 mesi.
- Cultura ed etichettatura di cellule
- Mantenere linee cellulari di carcinoma ovarico in monostrato in un tissue cultura incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 in terreni di coltura appropriato (DMEM per le cellule KGN 17 e MCBD110: M199 per le linee cellulari OVCA429 e OVCA433 18) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L -glutamina e 1% di penicillina-streptomicina.
- Mantenere le cellule mesoteliali umane LP9 in M199: Hams mezzi F12 contenente 15% FBS, 10 ng / ml Epidermal Growth Factor (EGF) e 400 ng / ml di idrocortisone, in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2.
- Cellule seme nel formato desiderato pallone e crescono a circa il 75% di confluenza. Celle di raccolta di tripsinizzazione con 0,05% tripsina / EDTA, centrifugare a 186 xg per 5 minuti, e lavare pellet di cellule due volte con PBS.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Facoltativo fluorescente metodo di etichettatura cellulare
- Risospendere le cellule tumorali ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml in 1 ml di preriscaldata PBS/0.1% BSA.
- Aggiungere 2 ml di 5 mM magazzino cellule Trsoluzione CSFE asso (o altra etichetta cella preferita che è trattenuta a lungo termine) a cellule ad una concentrazione finale di 10 mM e incubare a 37 ° C per 10-15 min a bagnomaria.
- Estinguere la reazione con 1 ml di ghiaccio mezzo freddo contenente 10% FBS e ri-pellet per centrifugazione. Risospendere in 10 ml di mezzo di crescita preriscaldata adeguato (vedere il punto 1.2.1).
- Cellule seme in un 2 pallone 75 centimetri filtro livellata e cultura a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Controllare cellule al microscopio a fluorescenza per verificare che il livello di etichettatura fluorescenza è sufficiente per il rilevamento. Una volta che le cellule raggiungono circa il 75% di confluenza, raccolto e contano come nei passaggi 1.2.3 e 1.2.4 di cui sopra.
2. Generazione di Spheroids in metilcellulosa
- Calcolare il volume delle cellule tumorali ovariche da Sezione 1 necessarie per la generazione sferoide (per un totale di 300.000 cellule sono richiesti per ogni esperimento pieno piastra a 96 pozzetti). Noa te: se si utilizza linee cellulari diverse da quelle qui presentate, le densità di cellule per la produzione di sferoide uniforme possono avere bisogno di essere ottimizzato per ogni linea.
- Per calcolare la diluizione di cellule in mezzi metilcellulosa, innanzitutto sottrarre il volume della cella richiesta (passo 2.1) da 15 ml.
- Aggiungere 3 ml di metilcellulosa soluzione madre (per fare 20% metilcellulosa finale) per un volume di terreno di coltura appropriato per ciascuna linea cellulare, pari a 15 ml meno il volume delle cellule e mescolare accuratamente capovolgendo.
- Aggiungi 300.000 cellule al medium contenente metilcellulosa e miscelare delicatamente per inversione.
- Pipettare 150 microlitri della miscela cellule / metilcellulosa / media (per un totale di 3000 cellule / pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti fondo concavo e coltura a 37 ° C, 5% CO 2 per 1-4 giorni o fino a formare sferoidi uniformi (1 sferoide / pozzetto è tipicamente osservata).
3. RTCA Cellulari Invasion saggi
NOTE: letture dell'impedenza sono espressi come indice cellulare (CI), un parametro adimensionale che rappresenta una variazione relativa in cella impedenza misurata rappresenta lo stato della cella. Per l'analisi, importare i dati in un foglio di calcolo, ad esempio Microsoft Excel.
- Piatto Preparazione
- Lavorando in gruppi di 4 pozzetti alla volta, aggiungere 50 microlitri matrice (diluito 1:10 in siero privo di mezzi di coltura) a ciascun pozzetto della camera superiore di una piastra a 16 pozzetti RTCA CIM per garantire che la superficie totale è coperto . Rimuovere 30 ml di matrice immediatamente, ma lentamente, per sbarazzarsi di qualsiasi liquido in eccesso.
- Incubare la piastra a 37 ° C per 4 ore prima dell'uso in un incubatore di coltura tissutale.
- Aggiungere 30 ml di mezzo privo di siero (SFM) appropriati per ciascuna linea cellulare di cancro alla camera superiore e 160 microlitri di media con o senza siero (secondo il vostro disegno sperimentale) alla camera inferiore.
- Montare la piastra CIM cliccando camera bassa nella camera superiore e equilibrmangiato in un incubatore a 37 ° C per 1 ora in un incubatore di coltura tissutale.
- Programmazione dello strumento RTCA
- Aprire il programma RTCA e selezionare la scheda 'Layout'. Evidenziare tutti i pozzetti sperimentali.
- Fai clic destro su pozzi e selezionare 'Attiva pozzi'; quindi compilare in condizioni sperimentali e nomi di cella, se lo desideri.
- Per aggiungere passaggi o sottofasi al programma, selezionare la scheda 'Pianificazione' e fare clic destro su 'Aggiungi un gradino'. Il primo passo è un fondo preprogrammato sweep, che è integrata automaticamente nel programma una volta sola 'aggiungere un passaggio' viene scelto.
- Inserire i dettagli del programma desiderato per la fase 2 del programma RTCA, che registrerà le letture durante la creazione del monostrato LP9. Aggiungere gli intervalli di tempo tra le letture dell'impedenza selezionando la scheda 'Intervallo' e digitando '15 minuti '. Aggiungi la durata sperimentale selezionando l''Durata' scheda did entrare in un tempo compreso tra 12-24 ore.
- Per aggiungere fasi successive, selezionare la scheda 'Pianificazione' e fare clic destro su 'Aggiungi un gradino' e inserire i dettagli dei passaggi aggiuntivi, come sopra. Fase 3 del programma RTCA dirigerà lo strumento per effettuare le letture durante l'invasione sferoide; Inserisci il '5 min 'sotto la' Intervallo 'scheda e '48 ore' nella scheda 'Durata'.
- Selezionare 'Plate' nella barra dei menu e salvare.
- Generazione di LP9 monostrato e misurazione dei Spheroid Invasion
- Posizionare la piastra CIM in strumento RTCA e programma aperto dal precedente passaggio 3.2. Prima di aggiungere le cellule, selezionare 'Esegui' nella barra dei menu e poi su 'Start'. Verrà automaticamente eseguita Uno sfondo sweep (Fase 1 nelle istruzioni del software RTCA).
- Rimuovere la piastra CIM dallo strumento seguendo lo sweep sfondo e posto in una cappa di coltura tissutale.
- Piatto 50,000 LP9 cellule risospese in 160 microlitri SFM nella camera superiore di ciascuna piastra CIM bene.
- Porre la piastra in strumento RTCA e le letture ogni 15 minuti, mentre il monostrato LP9 sta creando notte (Fase 2 del programma RTCA).
- Harvest sferoidi tumorali generate nella fase 2 'Generazione di sferoidi in metilcellulosa', sopra.
- Asetticamente, tagliare 1 millimetro la parte superiore di una punta di pipetta 1 ml e utilizzare per recuperare delicatamente il contenuto di ogni bene. Trasferire in una provetta sterile.
- Centrifugare sferoidi a 120 xg per 8 minuti, e rimuovere metilcellulosa contenente il mezzo aspirando delicatamente.
- Lavare sferoidi altre due volte con PBS, centrifugazione a 120 xg per 8 minuti per far sedimentare sferoidi dopo ogni lavaggio.
- Per ogni bene sperimentale, risospendere un totale di 10 sferoidi in 160 ml di mezzo senza FBS.
- Pausa l'esperimento RTCA selezionando 'Esegui' dalla barra dei menu e di controllo &# 8216; Pause '. Rimuovere la piastra CIM dallo strumento, e posizionare in una cappa di coltura di tessuti. Aspirare fuori il supporto di ogni bene e sostituirlo con i media sferoide contenenti (10 sfere in 160 microlitri) o di mezzi freschi per i pozzi di controllo solo LP9.
- Riportare la piastra allo strumento RTCA. Selezionare 'Esegui' dalla barra dei menu e controllare 'Abort passo'. Il programma si sposterà automaticamente alla fase successiva. Per riprendere l'esperimento, selezionare 'Esegui' dalla barra dei menu e verificare 'Start / Continue'. Fase 3 nel programma RTCA avvierà.
- Analisi dei dati
- Per determinare il livello di invasività cellulare sferoide, sottrarre i valori ottenuti per il monostrato LP9 solo dalle singole letture ottenute per le linee cellulari di carcinoma ovarico in ogni tempo di valutazione.
- Per tracciare 'invasione sferoide', normalizzare tutti i valori per il punto di tempo in cui gli sferoidi sono stati aggiunti alla piastra, da setting quel punto il tempo a '0 '.
Representative Results
Sferoidi tumorali ovariche possono essere generati da molti tipi di linee cellulari da loro coltura in sospensione o per la raccolta delle cellule tumorali primarie da ascite maligna 2,14. Qui due linee cellulari epiteliali cancro ovarico, OVCA433 e OVCA429, e una linea tumorale delle cellule della granulosa ovarica, KGN, sono stati utilizzati per generare sferoidi (Figura 1A). In questo metodo, le cellule sono coltivate in pozzetti fondo a U mentre sospeso in media che è stato fatto viscoso con l'aggiunta di metilcellulosa. In queste condizioni, molte cellule tumorali ovariche presentano una capacità intrinseca di aggregare per formare sferoidi 13. Seguendo coltura durante la notte sospesa in metilcellulosa / media, tutte e tre le linee cellulari formate strutture sferoidali compatte di circa 400-500 micron di diametro (Figura 1A). Nel frattempo, la piastra RTCA CIM viene preparato, dapprima rivestendo l'interfaccia membrana porosa con matrice e poi un monostrato confluente di mes umanicellule othelial (figura 1b). Una volta formate, sferoidi sono poi trasferiti alla piastra CIM preparato. Sferoidi tumorali prelevate vengono piastrate in cima al monostrato LP9 e valutati come descritto di seguito. Immagini al microscopio di fase standard (o al microscopio a fluorescenza, se la fase di marcatura delle cellule è stata seguita opzionale) di colture parallele sono periodicamente prelevati a favorire l'interpretazione dei dati RTCA (Figura 1C).
È informativo per valutare sia il livello basale di invasione di una linea cellulare di cancro, nonché invasione chemoattractant indotta. Tipicamente, invasività basale viene misurata mediante l'aggiunta di SFM ad entrambe le camere superiore ed inferiore. Mezzi completi (10% FBS), che contiene molti potenziali fattori chemiotattici, viene utilizzato nell'esempio corrente di esaminare 'chemiotattico indotto' invasione (Figura 2). Studi paralleli di LP9 sole cellule mesoteliali hanno confermato che queste cellule sono minimamente ininvasiva oltre 2 giorni sotto sia basale o 'chemoattractant' condizioni indotte e quindi erano un buon tipo di cellule da utilizzare in saggi di co-coltura con cellule di cancro ovarico (Figure 2A e 2B). Al contrario, sferoidi tumorali ovariche generati utilizzando una qualsiasi delle tre linee cellulari esposte la capacità di invadere verso un chemiotattico (FBS) (Figure 2A-2C). Il principale vantaggio di utilizzare gli strumenti in tempo reale RTCA oltre saggi endpoint tradizionali è che i cambiamenti nel comportamento delle cellule / sferoide possono essere quantificati nel corso del tempo. Sopra il test 2 giorni, la KGN, OVCA429, e linee cellulari OVCA433 tutti esposti la capacità di invadere verso un chemiotattico (indicato aumentando indici cellulari) ma bassi livelli basali di invasione (Figura 2C). Le linee cellulari esposte tassi simili di invasione, come indicato dalle piste parallele delle curve (Figura 2C); Tuttavia, la curva OVCA429 esposto un elevato asintoto superiore,che ha indicato un livello massimo superiore di invasione rispetto alle altre linee cellulari. Inoltre, le linee cellulari esposte differenze nei loro tempi di insorgenza di invasione, con le cellule KGN invadere rapidamente le cellule e matrice barriere e la OVCA433 e OVCA429 cellule prendono 3-5x più di invadere rispettivamente (Figura 2D). È importante sottolineare che i loro comportamenti allo scoppio della invasione non sono risultati predittivi della loro capacità complessiva di invasione (Figure 2C e 2D). Ciò suggerisce diverse capacità intrinseche delle linee cellulari del cancro ma anche può indicare che diversi fattori possono disciplinare precoci e tardivi comportamenti invasivi di sferoidi.
Figura 1 generazione Spheroid e il modello sperimentale di impostare una:.. Homaghi sotto microscopio a contrasto di fase sferoidi formando in metilcellulosa / media (in alto) e della linea cellulare di corrispondenza cresciuto come un monostrato (in basso) B:. schematico che mostra il RTCA 2 camerata piastra CIM ben impostato, in cui preformato cancro ovarico sferoidi sono placcati su di un monostrato di un LP9 mesoteliali strato / barriera matrice nella camera superiore e supporti ± FBS come fattore chemiotattico è aggiunto alla camera inferiore. Elettrodi sotto l'interfaccia del provvedimento 2 camere crescente impedenza elettrica come più cellule invadono le barriere al minor camera C:. Immagini di sferoidi KGN sulla parte superiore del monostrato LP9 al microscopio a contrasto di fase (sinistra) o microscopia a fluorescenza (a destra). Barre di scala = 100 micron. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
.. Figura 2 in tempo reale i dati ovarico sferoide cancro invasione A - B: risultati rappresentativi da un'invasione test RTCA condotta con e senza FBS nella camera di fondo di un piatto CIM bene. Invasione delle cellule KGN viene confrontato con cellule mesoteliali LP9. I risultati sono mostrati come media ± SD cellulare Indice dai pozzi triplice copia agli hr timepoint 24 (A) e oltre un intero periodo di test due giorni (B) C - D:. Un confronto tra la capacità invasiva delle KGN, OVCA429, e la cella OVCA433 linee raffigurati nelle 24 ore (C) e in modo più dettagliato in un periodo di tempo 2,5 hr (D).
Discussion
Invadere le cellule tumorali ovariche interagire con una varietà di tipi di cellule sulla superficie del peritoneo, comprese fibroblasti, adipociti e cellule mesoteliali, e la comunicazione bidirezionale tra cellule tumorali e cellule peritoneali è pensato di svolgere un ruolo chiave nel guidare il processo metastatico 2. Una volta masterizzato, il protocollo qui descritto è facilmente adattabile allo studio di queste interazioni nel microambiente peritoneale, ad esempio, mediante l'aggiunta di citochine esogene, fattori di crescita, o inibitori specifici verso le camere superiori o inferiori della piastra CIM bene o manipolazione genetica del cancro o linee cellulari peritoneale. Inoltre, questo metodo può essere usato con cellule di tumore ovarico primari raccolti di fresco da asciti maligne e / o cellule peritoneali primari per avere una visione diretta nelle segnali regolatori e le interazioni cellulari che regolano la creazione di una lesione metastatica all'interno della cavità peritoneale L'uso dello strumento RTCA per misurare la capacità invasiva delle cellule singole o sferoidi offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali saggi endpoint singoli e analisi di immagini time-lapse. Lo strumento RTCA misura invasione cellulare a intervalli definiti in continuo nel corso di un saggio, che può essere ore o giorni. Ciò consente la determinazione delle variazioni del tasso di invasione nel tempo, che supera i limiti dei dosaggi singoli endpoint. Ad esempio, esaminando i dati invasione delle diverse linee cellulari di cancro in un singolo endpoint (Figura 2), ad esempio, 3 ore, potrebbe aver portato alla conclusione erronea che KGN e OVCA433 cellule erano molto più invasivo rispetto OVCA429 cellule. Un altro vantaggio di questa tecnologia è che lo strumento RTCA misura variazioni di impedenza elettrica. Ciò significa che le analisi possono essere eseguiti senza etichettare le cellule con un agente esogeno, che potrebbe avere effetti indesiderati su phen cellulareotype o funzione. Questo diventa particolarmente importante quando si studiano le cellule tumorali ovariche primarie derivate da asciti maligne, con cui è essenziale mantenere manipolazioni al minimo in modo da evitare di introdurre cambiamenti molecolari e fenotipici che non riflettano la loro natura in vivo 2. Inoltre, l'uso dello strumento RTCA consente la raccolta di dati quantitativi in tempo reale, che non solo evita la perdita di tempo analisi associati microscopia time-lapse ma anche consente la rapida determinazione della chiave finestre sperimentali per l'ottimizzazione del saggio. Ciò è particolarmente utile quando si confrontano gli effetti di una serie di fattori di invasione sferoide, fattori come diversi possono esercitare i loro effetti massimi a diversi intervalli di tempo o con differenti profili notevolmente nel tempo. Anche se questo protocollo è suscettibile di modifiche (ad esempio, l'uso di matrici diverse ECM, diverse linee di cellule di cancro, o target diverso cells), se ciò, è importante notare che diverse condizioni sperimentali devono prima essere ottimizzati. Ad esempio, prima di iniziare studi di invasione sferoide, il numero ottimale di cellule tumorali / piastra CIM bene dovrebbe innanzitutto essere determinata mediante saggio del numero di cellule titolazioni in coltura monostrato. Il numero ottimale di sferoidi da utilizzare per ben si basa quindi su questa analisi. Ad esempio, nel metodo corrente, sferoidi comprendono circa 3.000 cellule ogni momento della generazione. Se iniziali numero di cellulare titolazioni indicano che 30.000 cellule in monostrato sono ottimali per il rilevamento nell'invasione analisi, poi 10 sferoidi sono aggiunti per piastra CIM bene. Inoltre, per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura, è importante studiare i comportamenti del 'bersaglio' monostrato cellulare separatamente al fine di determinare se queste cellule sono intrinsecamente invasiva, in quanto ciò potrebbe confondere i risultati. Nell'esempio mostrato, sferoidi tumorali sono placcati su di un Monola cella LP9yer, con e senza FBS aggiunto in fondo così come un chemoattractant. In parallelo, le cellule vengono coltivate LP9 soli, sotto ogni condizione di trattamento. Analogamente, quando si studia la capacità invasiva delle cellule e sferoidi, è anche importante esaminare le loro capacità migratorie e per distinguere i due comportamenti (cioè invasione richiede la digestione proteolitica di una barriera ECM mentre la migrazione non). Per fare questo, omettere la barriera ECM (Passi 3.1.1 - 3.1.3) e condurre il test in parallelo con la barriera ECM in luogo. Quest'ultima misura 'invasione' può essere corretto al precedente provvedimento 'migrazione', se lo si desidera. Infine, è importante notare che le informazioni ottenute dalle misure di impedenza elettrica non sono complete: una volta cellule hanno invaso nella camera inferiore, cambiamenti nella loro attaccamento, la diffusione, la proliferazione e sul lato inferiore della membrana possono contribuire ai cambiamenti rea impedenzaammaccature. Pertanto, questa metodologia è più informativa se usato in combinazione con altri saggi di redditività sferoide cellulare, l'adesione, la migrazione e la morfologia al fine di valutare complessivamente comportamenti delle cellule sferoidali. Ad esempio, idealmente, al fine di comprendere appieno le interazioni sferoidali-mesoteliale, co-culture separate dovrebbero essere ripreso periodicamente al microscopio a fase standard in modo che le valutazioni qualitative della sferoide morfologia e la salute possono essere effettuate in parallelo con saggi RTCA quantitativi di invasione. Se viene eseguita la fase di etichettatura facoltativa, poi i comportamenti delle singole cellule tumorali possono essere determinate mediante microscopia a fluorescenza come disgregano dal sferoide e interagiscono con le cellule mesoteliali non marcati. Un ulteriore vantaggio di etichettatura fluorescenza delle cellule tumorali quando co-coltura con un secondo tipo di cellule è che è poi possibile confermare che solo le cellule tumorali hanno invaso le barriere cellulari ed ECM.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una CASS Science Foundation e Medicina di Grant; (MB); un Health & Medical Research Council of Australia Nazionale Progetto Grant (KLS, 338.516); e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria (Australia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
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