Summary
복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.
Abstract
난소 암은 복강 액에 흘리고 복막 내 원심 사이트에 분산 전이. 암 세포가 본질적으로 부착 및 이차 종양을 형성하는 복막 안감 침입하여 전이성 프로세스 올릴 다세포 구조로 응집으로서 단층 배양 정확하게, 비 접착 환경 내 암세포의 동작을 모델링하지 않는다. 난소 암 전이, 다세포 집계 또는 구 상체의 중요한 단계를 모델링하기 위해, 비 접착 조건 하에서 유지 확립 난소 암 세포주에서 생성 될 수있다. 생체 내에서 종양 세포에 의해 발생하는 복막 미세 환경을 모방하기 위해, 회전 타원체 - 중피 공동 문화 모델은 상체가 세포 외 기질 장벽 형성, 인간 중피 세포 단일 층 위에 도금하는 예비 성형하는 년에 설립되었습니다. 방법은 그 후에 정량적 실시간을 수행하는 실시간 셀 분석기를 사용하여 개발되었다상체로 성장 다른 난소 암 세포주의 침윤 능력의 시간 측정. 이 방식은 기존의 엔드 포인트 분석 등 힘든 실시간 현미경 이미지 분석을 통해 몇 가지 장점을 가지고 시간의 긴 기간 동안 침략의 연속 측정 할 수 있습니다. 요컨대,이 방법은 시간이 지남에 중피 매트릭스 장벽을 통해 침입하는 난소 암 타원체 세포 사이의 상호 작용을 조절 요인 신속한 결정을 가능하게한다.
Introduction
난소 암은 모든 부인과 암 1의 가장 높은 사망률을 가지고 있습니다. 전 세계적으로 ~ 230,000가지 경우 인해 매년 1 병에 100,000의 죽음이 있습니다. 대부분의 환자 (> 75 %)의 암이 이미 전이 된 후 치료가 더 화학 요법에 저항 증가에 의해 복잡하게되는 경우, 진단과 환자의 예후 (豫后)는 2 좋지 않습니다. 단계 III-IV 전이성 질환 환자는 30~40% 3 5 년 생존율이 있습니다. 따라서, 효과적으로 향상된 질병을 치료하기 위해 난소 암 전이의 기초가 셀룰러 동작의 더 나은 이해를위한 긴급한 필요가있다.
난소 암 전이의 현재 모델은 어떤 종양 행동에 영향 미세 환경에서 발생하는 별개의 각각의 전이 과정의 여러 단계를 제안한다. 을 전이 난소 암 세포는 처음에 기본 종양 사이트에서 창고 및 nonadher에서 살아남을 수 있습니다단일 셀 또는 3 차원 다세포 구조로 복강 액 내에서 ENT 상태, 다세포 집계 또는 상체 2,4,5라고. 서스펜션의 상체를 형성하지 않는 세포는 anoikis 2,4,5에 더 취약합니다. 구 상체는 또한 잔여 질병 및 암 2,4,5의 후속 반복에 기여하고, 화학 요법에 대한 내성을 증가 나타낸다. 난소 암 전이의 두 번째 중요한 단계는 복막 벽과 대망 5,6 내에 설립 이차 종양 자유 부동 클러스터에서 집계의 전환이다. 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용은 집계 형성, 생존, 그리고 복막 4-11의 중피 라이닝에 의해 생성 된 세포 외 기질 (ECM) 준수에 연루되어있다. 아직 이러한 프로세스는 제대로 이해하고 있습니다.
난소 암의 보급에 관여하는 메커니즘을 정의하려면, 상체는 gener이 될 수 있습니다ated 배양액 12,13에 메틸 셀룰로오스를 첨가하여 또는 저 부착 2,14 플레이트에 세포를 배양하여 세포 현탁액 중의 어느 하나를 유지하는 비 접착 배양 방법을 사용하여 확립 된 암 세포주에서. 이 방법으로 배양 한 경우, 난소 암 세포는 생체 내에서 발견 2,14 종양 골재 마찬가지 세포 분자 및 생화학 적 특성을 나타낸다 다세포 응집체 또는 구 상체에 조립한다. 형성 후, 구 상체는 이후 비 접착 매체로부터 수확 될 수 있고, 추가적인 기능 연구에 대한 고체의 표면 상에 다양한 replated. 이것은 정확하게 같은 복막 유체로서 비 접착 환경 내을 전이 난소 암 세포의 행동을 모델화하지 않는 단층 배양에서 분석을 통해 사전을 나타낸다.
암 상체의 침습 용량 보이든 챔버이 전통적인 종점 분석법으로 평가할 수있다 (15, 16)에 침입하여 중피 세포 정리의 시간 경과 비디오 현미경을 사용하여 고안되었습니다; 그러나, 시간 경과 데이터의 분석은 시간이 소요됩니다 주관적 일 수있다. 여기서, 실시간 난소 암 상체의 침습 행동을 평가하기위한 신속하고 정량적 방법이 설명된다. 첫째, 구형 - 중피 세포 모델은 다세포 상체가 연결하고 보조 종양을 형성하는 복막 안감을 공격 할 때 난소 암 전이의 단계를 나타내는 설립되었습니다. 그런 다음 실시간 세포 분석기 (RTCA, 회사 정보에 대한 자료 표 참조)에 대한 방법론은 상체로 성장이 모델에서 테스트 다른 난소 암 세포주의 침략 능력의 정량적 실시간 측정을 실시하도록했다.
RTCA에있는strument, 세포 반응은 전기 임피던스의 변화를 측정함으로써, 외인성 레이블에 대한 필요없이, 분석의 과정 동안 연속적으로 모니터링된다. 특별히 디자인 문화 판은 2 잘 챔버 ( 'CIM'판)의 상부 및 하부 챔버 사이의 계면에 미세 다공성 막 아래에있는 금 코팅 된 미세 전극이있다. 세포가 ECM 또는 ECM / 세포 장벽을 통해 침입으로 하부 챔버 내의 전극의 위치는 전기 임피던스의 변화를 측정 할 수있다. 각 CIM 판 우물의 2 챔버 사이의 막 인터페이스는 먼저 관심 ECM 성분으로 코팅되어 있습니다. 구형 - 중피 세포 모델 시스템에서 인터페이스는 인간 중피의 합류 단층 다음 복막의 중피 라이닝의 기초가되는 복잡한 ECM을 모방하는 리겔 층 (회사 자세한 내용은 재료 표 참조) '으로 코팅 대상 '세포. 마지막으로, 미리 형성된 난소 암 상체는 광고입니다DED. 난소 암 세포 타원체 적극적 하부 측실 도달 전기 임피던스 측정 값을 변경하는 표적 세포 층과 매트릭스를 통해 침입한다. 자신에 대한 표적 세포는 또한 그들이 매트릭스 층을 통해 침입 및이 분석에서 사용하기에 적합하지 않는 것을 보장하기 위해 평가된다.
Protocol
1. 준비 세포의, 미디어 및 시약
- 메틸 셀룰로오스 함유 매체의 제조
- 250 ㎖의 플라스크에 멸균 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) (무첨가) 100 ㎖에 메틸 1.5 g을 녹인다.
- 5 분 동안 전자 레인지에 최저 솔루션을 열; 닦는 않도록주의하십시오.
- 메틸 셀룰로오스 파우더가 반 용해되면, 125 ML에 볼륨을 깨끗한 자석 교반기와 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- , 반전을 혼합하고, 4 ° C에서 하룻밤 교반하여 1.5 시간 동안 실온에서 교반.
- 네 개의 50 ㎖ 튜브와 2,300 X g에서 1.5 시간 동안 원심 분리기에 동일하게 솔루션을 나눈다.
- 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 명확하고, 점성이 높은 멸균 50 ML 튜브에 뜨는 (주식의 약 90 % -95 %), 나누어지는 및 저장을 수집합니다.
- 문화와 세포의 라벨링
- TI의 단일 층의 난소 암 세포주를 유지10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L 보충 : 37 ° C, (OVCA429 및 OVCA433 세포주 18 M199 KGN 셀 (17)과 MCBD110에 대한 DMEM) 적절한 성장 배지에서 5 % CO 2에서 ssue 문화 인큐베이터 -글루타민 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신.
- M199에 LP9 인간 중피 세포를 유지 : 햄의 F12 미디어는 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 15 % FBS, 10 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF) 400 NG / ㎖ 하이드로 코티손을 포함.
- 종자 원하는 플라스크 크기의 세포와 약 75 %의 포화 상태로 성장합니다. 0.05 % 트립신 / EDTA, 5 분 186 XG에 스핀, 그리고 PBS로 두 번 세포 펠렛을 씻어를 사용하여 트립신 처리하여 수확 세포.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 선택적인 형광 셀 라벨 방법
- 데워진 PBS/0.1 %의 BSA를 1 ㎖에 1 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 재현 탁 암세포.
- 5 mM의 재고 셀 (TR)의 2 μl를 추가에이스 CSFE 솔루션 (또는 장기간 유지되는 다른 바람직한 셀 라벨) 10 μM의 최종 농도에서 세포와 수조에서 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 원심 분리에 의해 10 % FBS 및 재 펠렛을 함유하는 얼음 냉각 된 배지 1 ㎖으로 반응을 켄 칭하고. 데워진 적절한 성장 배지 10ml에 재현 탁한다 (단계 1.2.1 참조).
- 37 ° C에서 75cm 2 필터 덮인 플라스크와 문화에 씨앗 세포, 5 % CO 2.
- 형광 라벨의 수준이 탐지를위한 적절한 지 확인하기 위해 형광 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포는 약 75 %의 포화 상태, 수확에 도달하고 단계 1.2.3 이상 1.2.4에서와 같이 계산하면.
메틸 셀룰로오스의 상체의 2. 세대
- (300000 셀 전체가 각각 전체 96 - 웰 플레이트 실험에 필요한) 타원체 생성에 필요한 제 1 ~ 난소 암 세포의 양을 계산한다. 아니테 : 여기에 제시된 다른 세포 라인을 사용하는 경우, 균일 한 구형의 생성을위한 세포 밀도는 각각의 라인에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다.
- 메틸 미디어 세포의 희석을 계산하려면 먼저 15 ML에서 (단계 2.1)에 필요한 세포의 양을 뺍니다.
- 각 세포주에 대한 문화 매체의 적절한 부피 15 ㎖를 뺀 세포 부피와 동일 (최종 20 %가 메틸하기 위해) 부드러운 반전에 의해 철저하게 혼합 메틸 원액 3 ㎖를 추가합니다.
- 메틸 셀룰로오스 함유 배지에 30 만 셀을 추가하고 부드러운 반전에 의해 완전히 혼합.
- 37 ° C에서 96 - 웰 오목 바닥 배양 플레이트와 문화의 각 웰에 (3,000 세포 / 웰의 총) 셀 / 메틸 / 미디어 믹스의 피펫 150 μL, 5 % CO 2 1~4일 또는 균일 한 구형 체 (1 회전 타원체가 / 잘 일반적으로 관찰)를 형성 할 때까지.
3. RTCA 셀 침략 분석 실험
NOTE : 임피던스 측정 값은 셀 인덱스 (CI), 셀의 상태를 나타내는 측정 셀 임피던스의 상대적인 변화 무 차원 매개 변수로 표현된다. Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트에 분석을 위해 데이터를 가져옵니다.
- 접시 준비
- 한번에 4 웰 그룹에서 작동하는 전체 표면적이 적용되도록하기 위해 16 - 웰 RTCA CIM 플레이트의 상부 챔버의 각 웰에 (무 혈청 배지 1:10 희석) 50 μL 행렬을 쓰 . 초과 액체를 제거하는, 천천히 바로 행렬의 30 μl를 제거 할 수 있지만.
- 조직 문화 인큐베이터에서 사용하기 전에 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 각각의 암 세포 상부 챔버 라인과 하부 챔버 (당신의 실험 설계에 따라) 또는 혈청이없는 미디어의 160 μL에 적합한 혈청 배지 (SFM)의 30 μl를 추가합니다.
- 상부 챔버 및 equilibr에 하부 챔버를 클릭하여 CIM 판을 조립조직 문화 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 먹었다.
- RTCA 악기를 프로그래밍
- RTCA 프로그램을 열고 '레이아웃'탭을 선택합니다. 모든 실험 우물을 강조 표시합니다.
- 오른쪽 우물을 클릭하고 '우물를 켜고'를 선택; 원하는대로 다음 실험 조건 및 셀 이름을 입력합니다.
- 프로그램에 단계 또는 하위 단계를 추가 '단계를 추가'에서 '일정'탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭을 선택합니다. 첫 번째 단계는 선택 '단계 추가'를하면 자동으로 프로그램에 포함되어있는 미리 프로그램 된 배경 청소입니다.
- LP9 단층의 설립시 판독 값을 기록합니다 RTCA 프로그램의 2 단계의 원하는 프로그램의 세부 정보를 입력합니다. ''간격 '탭을 선택하고 '15 분을 입력 임피던스 측정 값 사이의 시간 간격을 추가합니다. '시간'탭을 선택하여 실험 기간을 추가D 12 ~ 24 시간 사이에 시간을 입력.
- 다음 단계를 추가하려면 '단계를 추가'에서 '일정'탭을 선택하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 위의 추가 단계의 세부 정보를 입력합니다. RTCA 프로그램의 3 단계 회전 타원체 침공 기간 동안 독서를 취할 수있는 악기를 직접 것입니다; '시간'탭에서 간격 '탭과 '48 시간'에서 '5 분을 입력합니다.
- 메뉴 바의 '판'을 선택하고 저장합니다.
- 회전 타원체의 침략의 LP9 단층 및 측정의 생성
- 위의 단계 3.2에서 RTCA 악기 및 오픈 프로그램에서 CIM 판을 놓습니다. 이전에 셀을 추가로 선택 메뉴 바에서 '실행'다음 '시작'. 배경 청소가 자동으로 (RTCA 소프트웨어 지침 1 단계) 수행됩니다.
- 조직 문화 후드에서 배경 청소 및 장소 다음 악기에서 CIM 플레이트를 제거합니다.
- 판 50,000 LP9 세포는 물론 각 CIM 판의 상부 챔버에 160 ㎕의 SFM에서 일시 중단.
- RTCA 악기에 접시를 놓고 LP9 단층이 (RTCA 프로그램의 2 단계) 하룻밤 구축하는 동안 판독마다 15 분을.
- 수확 암 상체 위, 2 단계 '세대 메틸있는 상체의'에서 생성 된.
- 무균, 1 ㎖ 피펫 팁의 맨 오프 1mm를 잘라 부드럽게 잘 각각의 내용을 검색하기 위해 사용합니다. 멸균 튜브에 전송합니다.
- 원심 분리기는 8 분 120 XG에 상체, 부드러운 열망에 의해 메틸 셀룰로오스 함유 배지를 제거합니다.
- 각 세척 후 상체를 펠렛 8 분 120 XG에서 원심 분리, PBS로 두 번 더 상체를 씻으십시오.
- 각 실험 잘 들어, FBS가없는 배지 160 ㎕의 10 상체의 총을 재현 탁.
- 메뉴 바에서 '실행'을 선택하고 확인 및하여 RTCA 실험을 일시 중지# 8216; '일시 중지합니다. 악기에서 CIM 플레이트를 제거하고 조직 문화 후드에 배치합니다. 기음 각 우물에서 용지 오프 LP9 전용 제어 우물 구형 함유 미디어 (160 ㎕의 10 분야) 또는 신선한 용지로 교체합니다.
- RTCA 계기로 판을 반환합니다. 메뉴 바에서 '실행'과 '단계를 중단'확인을 선택합니다. 이 프로그램은 자동으로 다음 단계로 이동합니다. 실험을 다시 시작하려면 메뉴 바에서 '실행'과 '시작 / 계속'확인을 선택합니다. RTCA 프로그램의 3 단계를 시작합니다.
- 데이터 분석
- 회전 타원체 세포 침윤의 수준을 결정하기 위해, 단지 각 평가시기에서 난소 암 세포주에 대해 얻어진 각각의 판독으로부터 LP9 단층 얻은 값을 뺀다.
- '회전 타원체 침입을'그리려면되다, 상체가 플레이트에 첨가되는 시점에 모든 값을 정규화'0 '으로 그 시점을 랩탑 설치.
Representative Results
난소 암 상체는 현탁액들을 배양함으로써 악성 복수 2,14에서 일차 종양 세포를 수확하여 세포주 많은 종류로부터 생성 될 수있다. 이곳이 상피 성 난소 암 세포주, OVCA433 및 OVCA429 및 난소 과립 막 세포 종양 라인 KGN은 상체 (도 1a)을 생성하는데 사용되어왔다. 메틸 셀룰로오스를 첨가하여 이루어진 것으로, 점성 매체에 부유하는 동안이 방법에서, 세포는 U-바닥 웰에서 배양 하였다. 이러한 조건 하에서, 많은 난소 암 세포는 상체 (13)를 형성하도록 응집하는 고유의 능력을 나타낸다. 메틸 셀룰로오스 / 매체에 현탁하고 하룻밤 동안 배양 후, 세 개의 세포주는 직경이 약 400 ~ 500 μM (도 1a)의 소형 구형 구조를 형성했다. 한편, RTCA CIM 플레이트는 첫번째 행렬과 인간의 MES 후 합류 단층과 공막 인터페이스를 코팅함으로써, 제조othelial 세포 (그림 1B). 일단 형성, 상체는 다음 준비된 CIM 판에 전송됩니다. 수확 암 상체는 LP9 단층 위에 도금과 아래에 설명 된대로 평가된다. 병렬 문화 (옵션 셀 라벨 단계는 다음 경우 또는 형광 현미경 아래) 표준 위상 현미경 아래 이미지는 RTCA 데이터의 해석 (그림 1C)을 돕기 위해 정기적으로 촬영하고 있습니다.
이는 암세포의 침윤 기저 수준뿐만 아니라, 화학 유인 물질 - 유도 침입 모두를 평가 유익하다. 통상적으로, 기저 침입 양쪽 상부와 하부 챔버 SFM의 첨가에 의해 측정된다. 많은 잠재적 인 chemoattractants을 포함 전체 미디어 (10 % FBS)을, '화학 유인 물질에 의한 침략 (그림 2)을 검사하는 현재의 예에서 사용됩니다. 혼자 LP9 중피 세포의 병렬 연구는이 세포가 최소한에 있는지 확인vasive 따라서 기저 또는 '화학 유인 물질'유도 조건으로 하나에서 2 일 이상은 난소 암 세포와 공동 배양 분석에 사용하기 좋은 셀 분류 있었다 (도 2a 및도 2b). 반면, 세 개의 세포주 중 하나를 사용하여 생성 된 난소 암 상체는 화학 유인 물질 (FBS) (도 2A-2C)을 향하여 침입하는 능력을 나타내었다. 전통적인 종점 분석법 위에 RTCA 실시간 계기를 사용의 주요 이점은 셀 / 회전 타원체 행동의 변화가 시간이 지남에 따라 정량화 될 수 있다는 것이다. 2 일 분석을 통해, KGN, OVCA429 및 OVCA433 세포주 모두 (셀 인덱스를 증가로 표시) 화학 유인 물질 그러나 침략의 낮은 기저 수준 (그림 2C)으로 침입 할 수있는 능력을 나타내었다. 곡선 (도 2c)의 평행 한 경사면으로 나타낸 바와 같이 세포주, 침입의 유사한 비율을 나타내었다; 그러나 OVCA429 곡선은 높은 상부 점근선을 나타내,이는 다른 세포주에 비해 침윤 높은 최대 수준을 나타냈다. 또한, 세포 라인은 KGN 세포가 빠르게 (그림 2D) 각각 침공 이상 3 배를 복용 세포 및 매트릭스 장벽과 OVCA433 및 OVCA429 세포 침입과, 침략의 발병에 자신의 배의 차이를 보였다. 중요한 것은, 침략의 발병에 그들의 행동은 침략에 대한 자신의 전체 용량 (그림 2C와 2D)의 예측하지 않았다. 이는 암세포의 다른 고유 기능을 제안하지만, 또한 다른 요인 상체의 초기와 후기 침습 행동을 조절할 수 있다는 것을 의미 할 수있다.
그림 1 실험의 회전 타원체 생성 및 모델을 설정합니다.. I. B 메틸 / 미디어 (위)에 형성 상체의 위상차 현미경의 밑에 그리고 단층 (아래)로 성장 일치하는 세포주의 마법사 : 회로도 RTCA 2 CIM 판 잘 난소 암을 사전에 형성되는, 설정 챔버 표시 상체가 화학 유인 물질로 FBS ± 상부 챔버 및 미디어 LP9의 중피 층 / 매트릭스 장벽의 단층 위에 도금하는 하부 챔버에 추가됩니다. . 위상차 현미경 (왼쪽) 또는 형광 현미경 (오른쪽)에서 LP9 단층 위에 KGN의 상체의 이미지 : 더 많은 세포가 하부 챔버 C의 장벽을 통해 침입으로 전기 임피던스를 증가 2 챔버 측정의 인터페이스 아래에 전극. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
.. 그림 2 실시간 난소 암의 회전 타원체의 침공 데이터 - B : 잘 CIM 판의 아래쪽 챔버에 FBS와 사용하지 실시 RTCA 침공 분석에서 대표 결과. KGN 세포 침윤 LP9 중피 세포에 비교된다. 결과는 24 시간 평가시기 (A)에서와 전체 이틀 분석 기간 (B)에 세중 우물에서 평균 ± SD 휴대 지수로 표시됩니다 C - D :. KGN, OVCA429의 침략 용량의 비교 및 OVCA433 세포 24 시간주기 (C)에와 2.5 시간의 시간 (D)에 대한 자세한 방식으로 묘사 라인.
Discussion
침입 난소 암 세포는 섬유 아세포, 지방 세포, 및 중피 세포 포함한 복막의 표면에 다양한 종류의 세포와 상호 작용하고, 암세포 및 복막 세포 사이의 양방향 통신이 전이 과정이 구동에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 일단 마스터, 본원에 기재된 프로토콜은 복막 미세 환경 내에서 이러한 상호 작용의 연구에 용이하게 적응할 수있다, 예를 들어, 외인성 사이토 카인, 성장 인자, 또는 CIM 웰 플레이트 또는 유전자 조작의 상부 또는 하부 챔버에 특정한 억제제의 추가를 통해 복막 암 세포주. 또한,이 방법은 규제 신호 및 복강 내 전이 병변의 설립을 제어하는 세포의 상호 작용에 직접적인 통찰력을 얻기 위해 악성 복수 및 / 또는 기본 복막 세포에서 갓 수확 된 차 난소 종양 세포와 함께 사용할 수 있습니다 단일 세포 또는 상체의 침략 용량을 측정 할 수 RTCA 악기의 사용은 기존의 단일 엔드 포인트 분석과 시간 경과 이미지 분석을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. RTCA 계기는 몇 시간 또는 며칠이 될 수있는 분석의 과정을 통해 지속적으로 정의 된 간격으로 세포 침입을 측정합니다. 이것은 하나의 엔드 포인트 분석의 한계를 극복 시간에 침략의 속도, 변화의 결정을 할 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 엔드 포인트 (그림 2), 예를 들면, 3 시간에 다른 암 세포 라인의 침입 데이터를 검사, KGN과 OVCA433 세포가 훨씬 더 침략 OVCA429 세포보다이었다 잘못된 결론에 LED가 있습니다. 이 기술의 또 다른 장점은 RTCA 악기 전기 임피던스의 변화를 측정한다는 것이다. 이 분석은 세포 페닐에 의도하지 않은 영향을 미칠 수있는 외생 에이전트와 세포를 라벨없이 실행할 수 있다는 것을 의미합니다otype 또는 함수입니다. 그들의 생체 활동이 반영되지 않는 분자 및 표현형 변화를 도입 피하기 위하여 최소한의 조작을 계속하는 것이 필수적이다있는 악성 복수, 유래 차 난소 암 세포를 연구 할 때 특히 중요하게된다. 또한, RTCA 악기의 사용은 시간 경과 현미경과 관련된 분석을 소모를 방지뿐만 아니라 분석의 최적화를위한 주요 실험 윈도우의 신속한 결정을 가능하게뿐만 아니라 실시간에 정량적 인 데이터의 수집을 가능하게합니다. 회전 타원체의 침공에 대한 다양한 요인의 영향을 비교할 때 이것은 특히 유용합니다, 같은 다른 요인은 다른 timepoints 또는 시간이 지남에 따라 크게 다른 프로필과 자신의 최대한의 효과를 발휘할 수있다. 이 프로토콜은 변경 (예컨대, 의무이지만 상이한 ECM 행렬, 다른 암 세포주 또는 상이한 타겟 CEL 사용이렇게하면 LS), 다양한 실험 조건은 우선 최적화되어야한다는 것을주의하는 것이 중요하다. 예를 들어, 이전에 회전 타원체의 내습 시험을 시작으로, 암 세포 / CIM 플레이트의 최적의 수는 물론 첫번째 단층 배양에서 세포 수의 적정 분석에 의해 결정되어야한다. 웰 당 사용하는 구 상체의 최적의 수는 다음이 분석에 기초한다. 처음으로 생성 될 때 예를 들어, 현재의 방법에서는, 구 상체는 각 약 3000 세포를 포함한다. 초기 세포 수의 적정은 단일 층에 30,000 세포 분석 침략의 검출을위한 최적의 것을 나타냅니다 경우, 10 상체가 잘 CIM 플레이트 당 추가됩니다. 공동 배양 실험을 수행 할 때 또한, 별도 이들 세포는이 결과를 혼동 할 수 있으므로, 본질적으로 침습 여부를 판정하기 위해 '타겟'세포 단층의 행동을 연구하는 것이 중요하다. 설명 된 예에서, 암은 상체 LP9 셀 monola 위에 도금된다FBS와와없는 YER은 화학 유인 물질뿐만 아니라 아래에 추가. 병행 LP9 세포는 각각의 처리 조건에서, 단독으로 배양된다. 세포 및 상체의 침습 용량을 연구 할 때 마찬가지로, 그것은이 동작을 (이주되지 않는 동안, 즉 침입 ECM 장벽의 단백질 분해 소화를 요구)를 구별하기 위해서뿐만 아니라 자신의 이동성 용량을 조사하는 것이 중요하다. 이를 위해, ECM 장벽을 생략 (3.1.1 단계 - 3.1.3) 그 자리에 ECM 장벽과 병렬로 분석을 실시하고 있습니다. 원하는 경우 후자의 '침략'법안은, 전 '마이그레이션'측정을 보정 할 수있다. 세포가 바닥 챔버 내로 침입 한 후에 자신의 어태치먼트, 확산, 및 멤브레인의 밑면에 증식의 변동의 변화에 기여할 수있다 : 마지막으로, 전기 임피던스의 측정으로부터 얻은 정보가 범위에 한정된다는 점에 유의하는 것이 중요 임피던스 정말이에요종소리. 종합적으로 구형 세포의 행동을 평가하기 위해 구형 세포 생존, 접착, 이동 및 형태의 다른 분석과 함께 사용하면 따라서,이 방법은 대부분의 정보를합니다. 회전 타원체 형태 및 건강의 질적 평가는 침입 정량적 RTCA 분석법과 평행 할 수 있도록 예를 들어, 이상적으로는, 완전 구형-중피 상호 작용을 이해하기 위해, 분리 된 공동 배양은 또한 표준 위상 현미경 하에서 주기적으로 묘화한다. 선택적 라벨링 공정이 수행되는 경우에 그들이 타원체로부터 해리하는 및 비 표지 중피 세포와 상호 작용할 때, 다음 번의 암세포의 행동은 형광 현미경 하에서 결정될 수있다. 제 2 셀 타입과 함께 공동 배양 될 때 형광 암세포 라벨의 추가 장점은 오직 암 세포가 세포와 ECM 장벽을 통해 침입 한 것을 확인하는 것이 가능하다는 것이다.
Acknowledgments
이 작품은 CASS 기초 과학 및 의학 부여에 의해 지원되었다; (MB); 호주 프로젝트 그랜트의 국립 보건 의학 연구위원회 (KLS, 338,516); 그리고 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램 (호주)에 의해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
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