Summary
Рак яичников вторжение клеток в мезотелиальной прокладки брюшины представляет собой динамический процесс с течением времени. Используя настоящий анализатор времени, инвазивный потенциал клеток рака яичников в сфероида-мезотелиальной модели со-культуры клеток может быть определена количественно в течение длительных периодов времени, обеспечивая понимание факторов, регулирующих метастатического процесса.
Abstract
Яичников метастазировать, пролив в перитонеальной жидкости и рассеивания в дистальных сайтов в брюшину. Однослойные культуры не точно смоделировать поведение раковых клеток в пределах неадгезивных окружающей среды, как раковые клетки по своей природе агрегировать в многоклеточных структур, которые способствуют метастатического процесса путем присоединения к и в брюшинную прокладку с образованием вторичных опухолей. Для моделирования этого важного этапа яичников метастазирования рака, многоклеточные агрегаты, или сфероидов, могут быть получены из установленных яичников линий раковых клеток, составленных в соответствии прилипших условиях. Для имитации в брюшную микроокружение которыми сталкиваются опухолевых клеток в живом организме, сфероид-мезотелиальной модель совместное культивирование было установлено, в котором предварительно сфероиды высевают на верхней части мезотелиальной монослоя клеток человека, образованный над внеклеточного матрикса барьера. Методы Затем были разработаны с использованием анализатора в реальном времени клеток для проведения количественного реальноеИзмерения времени из инвазивной способности различных яичников клеток рака линий, выращенных как сфероидах. Такой подход позволяет для непрерывного измерения вторжения в течение длительных периодов времени, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными анализов конечных точек и более трудоемкий реального времени микроскопии изображение анализов. Короче говоря, этот метод позволяет быстро, определение факторов, которые регулируют взаимодействие между раком яичников сфероида клеток вторжения через мезотелиальных и матричных барьеров во времени.
Introduction
Рак яичников имеет самый высокий уровень смертности всех гинекологических раков 1. Во всем мире насчитывается ~ 230000 случаев и свыше 100000 случаев смерти в результате заболевания каждый 1 год. Большинство пациентов (> 75%) диагностируется после рак уже метастазы, когда лечение осложняется повышенной устойчивостью к химиотерапии и прогноз плохой 2. У больных в стадии III-IV болезни метастатическим есть 5 летняя выживаемость составляет всего 30-40% 3. Таким образом, существует настоятельная потребность в лучшем понимании клеточных поведения, лежащих в основе яичников метастазы рака в целях эффективного лечения поздней стадии заболевания.
Нынешняя модель яичников метастазов рака предлагает несколько шагов в метастатического процесса, каждый из которых происходит в отдельной микросреды, который влияет на поведение опухоли. Метастазирования рака яичников клетки изначально опадает от первичной опухоли и выжить в nonadherЛОР государство в перитонеальной жидкости в виде отдельных клеток или трехмерных многоклеточных структур, называемых многоклеточные агрегаты или сфероидов 2,4,5. Клетки, которые не образуют сфероидов в суспензии, более восприимчивы к anoikis 2,4,5. Сфероиды также проявляют повышенную устойчивость к химиотерапии, способствуя остаточной болезни и последующего рецидива 2,4,5 рака. Второй важный шаг в яичников метастазов рака является переход агрегатов от свободно плавающих кластеров с установленными вторичных опухолей в пределах брюшной стенки и сальника 5,6. Клетка-клетка и клетка-субстрат взаимодействия были вовлечены в образование агрегатов, выживание, и соблюдение внеклеточного матрикса (ECM) производимого мезотелиальной накладки из брюшины 4-11. Пока эти процессы мало изучены.
Для определения механизмов, участвующих в распространении рака яичников, сфероиды может быть сгенерированоованные от установленных линий раковых клеток с использованием неадгезивных культуры методами, поддержания клеток в суспензии либо путем добавления метилцеллюлозы к культуральной среде 12,13 или путем культивирования клеток на низкой крепежных пластин 2,14. При культивировании таким образом, клеток рака яичников собираться в многоклеточных сфероидов или агрегатов, которые демонстрируют сходные клеточные, молекулярные и биохимические свойства в тех опухолевых агрегатов найдено в естественных условиях 2,14. После образования сфероиды могут быть впоследствии собирают из неадгезивных среды и высевали на различных твердых поверхностей для дальнейших функциональных исследований. Это представляет собой шаг вперед по сравнению анализов в монослойной культуре, которая не точно моделировать поведение клеток рака яичников метастазирующих в неадгезивных среде, такой как внутрибрюшинного жидкости.
Инвазивный потенциал сфероидах рака можно оценить в традиционных анализов конечных точек в Бойдена камер 2 15,16; Однако анализ данных длительной записи занимает много времени и может быть субъективной. При этом быстрый, количественный метод оценки инвазивных поведения яичников сфероидах рака в реальном времени описывается. Во-первых, модель сотового сфероид-мезотелиальных была создана который представляет собой этап яичников метастазирования рака, когда многоклеточные сфероиды приложить к и вторгнуться в брюшную подкладку с образованием вторичных опухолей. Тогда методика сотового Analyzer в режиме реального времени (RTCA, см. таблицу материалов для деталей компании) был адаптирован для проведения количественных измерений в реальном времени инвазивной способности различных яичников клеток рака линий, выращенных как сфероидах и проверенных в этой модели.
В RTCA вприборной, клеточные ответы контролируются непрерывно в течение анализе, без необходимости экзогенных этикеток, путем измерения изменений в электрическом импедансе. Специально разработанные культуральные планшеты иметь золото с покрытием микроэлектродов, расположенные под микропористой мембраны на границе раздела между верхней и нижней камер 2 на камеры хорошо (CIM '' пластин). Расположение электродов в нижней камере позволяет измерять изменения в электрическом импедансе как клетки проникают через ECM или ECM / сотового барьера. Мембрана интерфейс между 2 камерами каждой пластины скважины CIM будет сначала покрывают ECM компонента, представляющего интерес. В сфероида-мезотелиальных модельной системе клеток, интерфейс покрыта слоем Матригель (см. таблицу материалов для деталей компании), чтобы имитировать сложный ECM, лежащую в основе мезотелиальной слизистую оболочку брюшины, а затем сливной монослоя человека мезотелиальной " целевые "клетки. Наконец, заготовок из яичников Сфероиды рака являются объявлениеДед. Рак яичников сферические клетки должны активно вторгаются через слой клеток-мишеней и матрицы для достижения нижнюю камеру и изменить показания электрического сопротивления. Клетки-мишени сами по себе также оцениваются для того, чтобы они не проникают через матричный слой и пригодны для использования в данном анализе.
Protocol
1. Подготовка клеток, Медиа и реактивы
- Получение метилцеллюлозы среде, содержащей
- Растворить 1,5 г метилцеллюлозы в 100 мл стерильной Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) (без добавок) в 250 мл колбу.
- Нагрейте раствор на низкий в микроволновой печи в течение 5 мин; заботиться, чтобы избежать при кипении.
- После того, как метилцеллюлозы порошок является полу-растворится, добавляют чистую магнитную мешалку и СМИ принять объем до 125 мл.
- Смешать, инвертный, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч с последующим перемешиванием при 4 ° С в течение ночи.
- Разделите решение в равной степени на четыре 50 мл пробирки и центрифуги в течение 1,5 ч при 2300 х г.
- Соберите ясно, высоковязкой супернатант (примерно 90-95% акций), Алиготе в стерильных 50 мл пробирок, и хранить при температуре 4 ° С на срок до 3 месяцев.
- Культура и маркировки клеток
- Поддерживать рака яичников клеточных линий в монослоя в тиSSUE культура инкубатор при 37 ° С, 5% СО 2 в соответствующей ростовой среде (DMEM для KGN клеток 17 и MCBD110: M199 для OVCA429 и OVCA433 клеточных линий 18) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ L -глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина.
- Поддерживать LP9 мезотелиальной клеток человека в M199: ветчины F12 средах, содержащих 15% FBS, 10 нг / мл эпидермальный фактор роста (EGF) и 400 нг / мл гидрокортизона, в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2.
- Семенной клеток в нужный размер колбы и вырасти до примерно 75% слияния. Урожай клеток обработкой трипсином с использованием 0,05% трипсина / EDTA, вращение на 186 мкг в течение 5 мин и промывают осадок клеток дважды PBS.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра.
- Дополнительный флуоресцентный метод мечения клеток
- Раковые Ресуспендируйте клетки в конечной концентрации 1 х 10 6 клеток / мл в 1 мл нагретого PBS с 0,1% БСА.
- Добавить 2 мкл 5 мМ акции сотового Трас решение CSFE (или другой предпочтительной меткой клетка, которая сохраняется на длительный период) с клетками при конечной концентрации 10 мкМ и инкубировать при 37 ° С в течение 10-15 мин на водяной бане.
- Реакцию останавливают с помощью 1 мл охлажденного льдом среде, содержащей 10% FBS и повторное осадок центрифугированием. Ресуспендируют в 10 мл предварительно нагретой соответствующей ростовой среде (см. Шаг 1.2.1).
- Семенной клеток в 75 см 2 фильтра вершины колбу и культуры при 37 ° С, 5% СО 2.
- Проверьте клетки под флуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться, что уровень флуоресценции маркировки достаточно для обнаружения. После того, как клетки достигают примерно 75% слияния, урожай и считать, как на этапах 1.2.3 и 1.2.4 выше.
2. Генерация сфероидов в метилцеллюлозы
- Рассчитайте объем клеток рака яичников из раздела 1, необходимых для сфероида поколения (в общей сложности 300 000 клеток, необходимое для каждого полного эксперимента 96-луночного планшета). НетTE: при использовании различных клеточных линий, чем представленный здесь, плотность клеток равномерной генерации сфероида, возможно, должны быть оптимизированы для каждой строки.
- Для расчета разбавления клеток в метилцеллюлозы СМИ, в первую очередь вычесть объем клеток, необходимое (шаг 2.1) от 15 мл.
- Добавить 3 мл исходного раствора метилцеллюлозы (чтобы сделать 20% метилцеллюлозы окончательный) до объема культуральной среды, подходящей для каждой клеточной линии, равный 15 мл минус объема клеток и тщательно перемешать, осторожно инверсии.
- Добавить 300000 клеток в среде, содержащей метилцеллюлозы и тщательно перемешивают путем осторожного обращения.
- Внесите 150 мкл смеси клеток / метилцеллюлозы / СМИ (в общей сложности 3000 клеток / лунку) в каждую лунку 96-а вогнутой нижней пластины культуры и культуры при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 1-4 дней или до однородности сфероиды не образуют (1 сфероид / а, как правило, наблюдается).
3. RTCA Сотовые Invasion Анализы
НЕТTE: показания сопротивление выражаются в виде сотового Index (CI), безразмерного параметра, который является относительное изменение измеренного сопротивления клеток, представляющих состояние клеток. Для анализа, импорт данных в электронную таблицу, например, Microsoft Excel.
- Тарелка Подготовка
- Работая в группах по четыре лунки в то время, добавить 50 мкл матрицы (разбавленный 1:10 в бессывороточной культуральной среде) в каждую лунку верхней камере пластины 16 и RTCA CIM чтобы гарантировать, что общая площадь поверхности покрыта . Удалить 30 мкл матрицы сразу, а медленно, чтобы избавиться от любой лишней жидкости.
- Инкубируют планшет при 37 ° С в течение 4 часов перед использованием в инкубаторе для тканевых культур.
- Добавить 30 мкл бессывороточной среде (SFM), подходящие для каждой клеточной линии рака в верхнюю камеру и 160 мкл среды с или без сыворотки (в соответствии с вашим эксперимента) в нижнюю камеру.
- Соберите CIM пластину, нажав на нижнюю камеру в верхнюю камеру и эквилибрели в 37 ° C инкубаторе в течение 1 ч в инкубаторе для тканевых культур.
- Программирование RTCA инструмент
- Откройте программу RTCA и выберите вкладку «Макет». Выделите все экспериментальные скважины.
- Щелкните правой кнопкой мыши на скважинах и выберите 'Включите скважин "; затем заполнить экспериментальных условиях и имена ячеек по желанию.
- Чтобы добавить шаги или подэтапы в программу, выбрать вкладку "Расписание" и правой кнопкой мыши на 'Добавить шаг ». Первым шагом является запрограммированный фон развертки, которая автоматически включены в программу, как только 'добавить шаг "выбирается.
- Введите желаемое описание программ на стадии 2 программы RTCA, который будет записывать показания во время установления монослоя LP9. Добавить интервалы времени между показаниями импеданса, выбрав вкладку "Интервал" и введя '15 мин. Добавить экспериментальную продолжительность выбрав 'Длительность' вкладка апд ввода времени между 12-24 час.
- Чтобы добавить последующие шаги, выберите вкладку «Расписание» и щелкните правой кнопкой мыши на 'Добавить шаг »и ввести подробную информацию о дополнительных шагах, как указано выше. Шаг 3 программы RTCA направит инструмент, чтобы взять показания во время сфероида вторжения; введите '5 мин 'под' Interval 'закладке и '48 часа' на вкладке 'Продолжительность'.
- Выберите 'Plate' в строке меню и сохранить.
- Генерация LP9 монослоя и измерении Сфероид Invasion
- Наведите CIM пластину в RTCA инструмента и открытой программы, начиная с шага 3.2 выше. Перед добавлением клеток, выберите 'Выполнить' в строке меню, а затем "Пуск". Фон развертки автоматически выполняться (Шаг 1 в инструкции программных RTCA).
- Снимите CIM пластину из инструмента после фона развертки и место в капот культуры ткани.
- Тарелка 50,000 LP9 клетки приостановлено в 160 мкл SFM в горницу каждого CIM пластины хорошо.
- Место пластины в приборе RTCA и снимать показания каждые 15 мин в то время как монослой LP9 создает в течение ночи (шаг 2 из программы RTCA).
- Сфероиды раковые Harvest генерируется при шаге 2 "Поколение сфероидов в метилцеллюлозы", выше.
- Консерванта, вырезать 1 мм от верхней части кончика пипетки на 1 мл и использовать осторожно извлечь содержимое каждой лунки. Переезд в стерильную пробирку.
- Центрифуга Spheroids при 120 мкг в течение 8 мин, и удалить метилцеллюлозы, содержащий среду, осторожно аспирации.
- Вымойте сфероидов еще дважды PBS, центрифугирования при 120 мкг в течение 8 мин для осаждения сферических частиц после каждого мытья.
- Для каждой экспериментальной скважины, ресуспендируют в общей сложности 10 сфероидов в 160 мкл среды без FBS.
- Пауза эксперимент RTCA, выбрав пункт "Выполнить" в строке меню и проверка &# 8216; Пауза ". Снимите CIM пластину из инструмента, и поместите в капот культуры ткани. Аспирируйте от СМИ из каждой лунки и заменить сфероида-средах (10 сфер в 160 мкл) или свежей прессы для LP9 только контрольные лунки.
- Вернуться пластину к инструменту RTCA. Выберите "Выполнить" в строке меню и проверьте 'Прервать шаг'. Программа будет двигаться к следующему шагу автоматически. Чтобы возобновить эксперимент, выберите 'Выполнить' в строке меню и проверьте "Пуск / Продолжить". Шаг 3 в программе RTCA будет инициировать.
- Анализ данных
- Чтобы определить уровень сфероида инвазивности клеток, вычесть значения, полученные для LP9 монослоя только от отдельных показаний, полученных для яичников линий раковых клеток при каждой временной точке.
- Для построения 'сфероида вторжение', нормализовать все значения в момент времени, при котором сфероиды были добавлены к плите, на SEtting этот момент времени в '0 '.
Representative Results
Яичников сфероиды рака могут быть получены из многих типов клеточных линий культивированием их в виде суспензии или путем сбора первичной опухоли клетки от злокачественных асцита 2,14. Здесь два эпителиального рака яичников клеточные линии, OVCA433 и OVCA429 и яичников линии опухоли клеток гранулезы, КГН, были использованы для создания сферических частиц (рис. 1а). В этом способе клетки культивируют в U-дном лунок в то время как суспендируют в среде, которое было сделано вязкий добавлением метилцеллюлозы. В этих условиях многие клеток рака яичников проявляют врожденной способностью к агрегации с образованием сфероидов 13. После ночной культуры, суспендированного в метилцеллюлоза / сред, все три клеточные линии сформированы компактные сфероида структуры примерно 400-500 мкм в диаметре (рис. 1А). Между тем, RTCA CIM пластина получается, во-первых, покрывая пористую интерфейс мембраны с матрицы и затем сливной монослоя человека месothelial клетки (рис. 1b). После образования сфероиды, которые затем передаются на подготовленную CIM пластины. Собранные сфероиды рака высевают на верхней части монослоя LP9 и оценены, как описано ниже. Изображения при стандартных фазовых микроскопии (или под флуоресцентной микроскопии, если следовать необязательный шаг мечения клеток) параллельных культур взяты периодически, чтобы помочь в интерпретации данных RTCA (рис. 1в).
Это является информативным для оценки как базального уровня вторжения в раковой клеточной линии, а также хемоаттрактантных вызванной вторжением. Как правило, базальный инвазивность измеряется путем добавления SFM с обеих верхних и нижних камерах. Полной среде (10% FBS), который содержит множество потенциальных хемоаттрактанты, используется в данном примере для изучения 'хемоаттрактантных-индуцированной' вторжение (рис. 2). Параллельные исследования только LP9 мезотелиальной клетки подтвердил, что эти клетки являются минимально вvasive в течение 2 дней до или базальный или "хемоаттрактанта 'индуцированные условия и, таким образом, были хорошим типом клеток для использования в совместной культуре анализов с клеток рака яичников (фиг.2А и 2В). В противоположность этому, яичников сфероиды рака, полученные с помощью любого из трех клеточных линий выставлены способность к вторжению хемоаттрактанта (FBS) (фиг.2А-2С). Основное преимущество использования RTCA в реальном времени по сравнению с традиционными инструментами анализов конечных точек является то, что изменения в поведении клеток / сфероида может быть определена количественно с течением времени. За 2 дня анализа, КГН, OVCA429, и клеточные линии OVCA433 все выставлены способность вторгаться к хемоаттрактанта (обозначается увеличение индексов клеток), но низких базальных уровней вторжения (рис. 2в). Клеточные линии выставлены аналогичные показатели инвазии, как показано параллельных наклона кривых (фиг. 2С); Однако, кривая OVCA429 выставлены более высокую верхнюю асимптоту,что указывает более высокий максимальный уровень инвазии по сравнению с другими клеточных линий. Кроме того, клеточные линии выставлены различия в их раз в начале вторжения, с клетки KGN быстро вторжения клетки и матричные барьеров и OVCA433 и OVCA429 клетки, принимая 3-5x больше к вторжению, соответственно (фиг. 2D). Важно отметить, что их поведение в начале вторжения не были прогнозировать их общей способности к инвазии (рис. 2в, 2г). Это говорит о том различные присущие возможности линий раковых клеток, но и может означать, что различные факторы могут регулировать ранние и поздние инвазивных поведения сфероидах.
Рисунок 1 Сфероид поколения и модель экспериментальной установки A:.. Ямаги в рамках этапа контрастной микроскопии сфероидов, образующихся в метилцеллюлоза / медиа (вверху) и согласующего клеточной линии, выращенной в виде монослоя (внизу) B:. Схематическое изображение RTCA 2 камерные CIM пластина хорошо настроен, в котором предварительно сформированных рака яичников сфероиды высевают на верхней части монослоя в LP9 мезотелиальной слоя / матрицы барьера в верхней камере и медиа ± FBS в качестве хемоаттрактанта добавляется в нижнюю камеру. Электроды под интерфейс 2 камер меры увеличением электрического импеданса как все больше клетки проникают через барьеры в нижнюю палату C:. Образы к.г.н. сфероидах в верхней части монослоя LP9 рамках этапа контрастной микроскопии (слева) или флуоресцентной микроскопии (справа). Масштабные бары = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
.. Рисунок 2 в режиме реального времени данные яичников сфероид рака вторжения - B: Представитель результаты от вторжения анализа RTCA, проведенного с и без FBS в нижней палате тарелку CIM скважины. Вторжение сотовый КГН сравнивается с LP9 мезотелиальных клеток. Результаты показаны в виде средней ± стандартное отклонение Cell Index от трех лунок на 24 часами временной точки (А) и более всего периода двухдневный анализа (B) C - D:. Сравнение инвазивной мощностью KGN, OVCA429 и OVCA433 клеток Линии, изображенные в течение 24 ч периода (С) и в более подробного образом в течение периода времени 2,5 ч (D).
Discussion
Вторжение клеток рака яичников взаимодействовать с различными типами клеток на поверхности брюшины, в том числе фибробласты, адипоциты и мезотелиальных клеток и двунаправленная связь между раковыми клетками и перитонеальных клеток, как полагают, играют ключевую роль в стимулировании метастатического процесса 2. После того, как освоили, протокол, описанный здесь, легко адаптируется к изучению этих взаимодействий в брюшную микросреды, например, путем добавления экзогенных цитокинов, факторов роста, или специфических ингибиторов в верхних или нижних палат пластины CIM скважины или генетических манипуляций рака или перитонеальных клеточных линий. Кроме того, этот метод может быть использован с первичными яичников опухолевых клеток, собранных недавно от злокачественных асцит и / или первичных перитонеального клеток, чтобы получить прямые понимание регуляторных сигналов и клеточных взаимодействий, которые регулируют создание метастатического поражения в брюшной полости Использование прибора RTCA для измерения инвазивного потенциала отдельных клеток или сфероидов имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными одиночными анализов конечных точек и покадровой анализ изображения. Прибор RTCA измеряет сотовой вторжение через определенные промежутки времени непрерывно в течение анализе, который может быть несколько часов или дней. Это позволяет определить изменения в размере вторжения с течением времени, что позволяет преодолеть ограничения отдельных анализов конечных точек. Например, рассматривая данные вторжения из разных линий раковых клеток при одной конечной точки (рис. 2), например, 3 часа, могло бы привести к ошибочному выводу, что КГН и OVCA433 клетки были намного более агрессивны, чем OVCA429 клеток. Еще одно преимущество этой технологии в том, что прибор RTCA измеряет изменения электроимпедансной. Это означает, что анализы могут быть запущены без маркировки клеток с экзогенной агента, который мог иметь непредвиденные последствия для клеток Phenotype или функция. Это становится особенно важным при изучении первичных клеток рака яичников, полученные из злокачественных асцит, с которым крайне важно, чтобы держать манипуляции к минимуму, чтобы избежать введения молекулярных и фенотипические изменения, которые не отражают их природе в естественных 2. Кроме того, использование прибора RTCA позволяет коллекцию количественных данных в реальном времени, которая не только позволяет избежать затрат времени анализы, связанные с покадровой микроскопии, но и дает возможность быстро определить ключевых экспериментальных окон для оптимизации анализа. Это особенно полезно при сравнении эффекты от ряда факторов на сфероида вторжения, так как различные факторы могут оказывать свое максимальные эффекты в различных временных точках или с существенно различными профилями с течением времени. Хотя этот протокол поддается изменениям (например, использование различных ECM матрицы, различных линий раковых клеток, или иной целевой челLs), если это так, то важно отметить, что различные экспериментальные условия первого должны быть оптимизированы. Например, до начала исследования сфероида вторжения, оптимальное количество раковых клеток / пластину CIM также должен сначала быть определена путем количественного определения числа клеток титрования в монослойной культуре. Оптимальное количество сфероидов, чтобы использовать каждую лунку затем на основе этого анализа. Например, в текущем методе, сфероиды содержать около 3000 клеток каждый, когда первый генерируется. Если начальные числа клеток титрования показывают, что 30 000 клеток в монослое являются оптимальными для обнаружения в вторжения анализирует, то 10 Сфероиды добавляются в CIM пластины хорошо. Кроме того, при проведении совместного культивирования эксперименты, важно изучить поведение в "целевой" клеточный монослой отдельно, чтобы определить эти клетки по своей природе являются ли инвазивными, так как это может смешивать результаты. В примере продемонстрировал, сфероиды раковые высевают на верхней части клетки Monola LP9Ер, с и без FBS добавляются в нижнюю также хемоаттрактанта. Параллельно LP9 клетки культивируют в покое, при каждом условии лечения. Точно так же, при изучении инвазивной способности клеток и сфероидов, это также важно, чтобы изучить их миграционные способности, а для того, чтобы различать два поведения (то есть вторжение требует протеолитического расщепления в ECM барьер в то время как миграция не делает). Для этого, опустите ECM барьер (Шаги 3.1.1 - 3.1.3) и провести анализ параллельно с ECM барьера в месте. Последний "вторжение" мера может быть исправлена с бывшим «миграции» меры, если это необходимо. Наконец, важно отметить, что информация, полученная от мер электрического импеданса ограничен: как только клетки вторглись в нижней камере, изменения в их прикрепления, распространение и пролиферации на нижней стороне мембраны может способствовать изменениям в сопротивление REAвмятины. Таким образом, эта методика является наиболее информативными при использовании в сочетании с другими анализов сфероида жизнеспособности клеток, адгезии, миграции и морфологии для того, чтобы всесторонне оценить сфероида поведение клеток. Например, в идеальном случае, для того чтобы полностью понять сфероида-мезотелиальной взаимодействий, отдельные со-культуры должны также быть отображены периодически по стандарту фазовой микроскопии так, что качественные оценки морфологии сфероида и здоровья может быть сделано параллельно с количественным RTCA анализов вторжения. Если необязательный шаг маркировка выполняется, то поведение отдельных раковых клеток может быть определена в соответствии с флуоресцентной микроскопии, как они разбивку от сфероида и взаимодействовать с немеченых мезотелиальных клеток. Дополнительным преимуществом флуоресцентно маркировки раковых клеток при совместном культивировании со вторым типом клеток является то, что затем можно утверждать, что только раковые клетки захвачена через клеточные барьеры и ECM.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом науки CASS и медицины Гранта; (МБ); Национальный здравоохранения и Совет по медицинским исследованиям Австралии грантового проекта (КЛС, 338516); и Оперативной программы Инфраструктура поддержки викторианской правительства (Австралия).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
