Introduction
Аммиак является повсеместное побочным продуктом белкового обмена 1. Поэтому измерение Аммиак может помочь врачам оценить различные болезни и оздоровительные государства 2. Тем не менее, аммиак трудно измерить точно, через кровь или дыхание, потому что это очень реактивными. Хотя обычно используется, анализы крови имеют многочисленные недостатки, в том числе основных опасений по поводу точности 3. Но главная проблема с анализов крови реальность, что они только когда-либо собирали эпизодически. Это важно, поскольку физиология аммиак, как и глюкозы в крови и многих других метаболических процессов, текучи и постоянно меняющейся 4. В отличие от этого, дыхание анализы полностью неинвазивным и быстрым, тем самым легко позволяет повторных измерений. Таким образом, измерение аммиака дыхание привлекателен тем, что он может обратиться серьезную неудовлетворенная потребность в уникальном пути.
Коллекция Дыхание, однако, представляет уникальные проблемы. В то время как кровопускание по своей сути несет JeoПарди ошибки в нескольких непредсказуемым образом (например, жгут времени, загрязнения пот, клетки крови гемолиз, задержки в лабораторных измерений и т.д. 5), исследователи измерения дыхания должны бороться с другой группой новых проблем: изменчивость в дыхании, загрязнения с устным слизистой или бактериальной аммиак, влияние окружающего воздуха и устройство влажности и температуры, и т.д. 6. В самом деле, было бы неразумно недооценивать задачу в соединении экспериментальное оборудование для людей с использованием экспериментальных процедур, чтобы обнаружить неизвестный биологию. Отчасти из-за этих препятствий, дыхание аммиак еще не встретил свой потенциал.
Здесь мы представляем наш протокол измерения аммиака дыхание для быстрых и точных результатов. Наш протокол имеет силу в трех областях: монитор, интерфейс сэмплер, и внимание к человеческим влияний. Монитор был построен коллегами в Университете Райса, как описано выше 7. Основой МЭСрения является кварц усиливается фотоакустическая спектроскопии (QEPAS) метод, который использует пьезоэлектрический кварцевый камертон в качестве акустического датчика. Фотоакустическая эффект возникает, когда акустические волны образуются в результате поглощения модулированного лазерного излучения целевых видов следовых газов. След газа определяется с помощью акустического ячейку, которая акустически резонансная модулированному частоты. Длина волны поглощения аммиака был выбран, свободной от спектральных помех от вмешательства видов в дыхании. Для целей измерения выдыхаемого воздуха человека, основные черты монитора включает в себя широкий диапазон измерений (от ~ 50 частей на миллиард, фунтов на баррель, по крайней мере 5000 частей на миллиард) и скорость (1 измерений сек). Скорость монитора позволяет временное разрешение на протяжении всего цикла дыхания.
Монитор, соединенный с специально разработанной дыхания пробоотборника. Пробоотборник состоит из датчика давления и капнографа. Он отображает и архивирует в режиме реального времениИзмерения давления рта и углекислого газа, а также концентраций аммиака, определенных с помощью датчика. Этот сэмплер, следовательно, позволяет технику оценить качество усилий дыхания, как дыхание собирается. Это дает нам возможность превышают рекомендации для анализа дыхания оксида азота (NO-Фе), предложенный Целевой группы Американского торакального общества / Европейского респираторного общества (ATS / ERS) 8. Для всех проб дыхания, одноразовые односторонним в линию клапан был использован на рот порту дыхания сэмплер.
Из-за скорости монитора и контроля качества предоставленной сэмплер, мы смогли тщательно оценить воздействия деятельности человека 9. Большинство предметов, например, изначально гипервентиляции, когда поручил дышать. Другие важные влияния, такие как устного рН и полоскания рта, температура в сэмплер, монитора и всех связанных трубки и режим дыхания, затем были изучены, и являются основой FOг иллюстративные эксперименты ниже.
Наконец, возможно, самое главное, необходимо подчеркнуть, что несколько высококвалифицированные группы измерения дыхания аммиак, используя совершенно разные датчики и процедуры измерения. Это может иметь важные преимущества и справедливость. Полное сравнение выходит за рамки настоящей работы 10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка инструментов
- Включите внешнего источника питания к аммиака оптическим датчиком платформы, лазерный диод контроллер, индивидуальному заказу управляющей электроники блока (КЕС), дыхание сэмплер, пневматический насос, и ноутбук.
- Убедитесь, что оба выхлопных газов и охлаждающие вентиляторы датчика аммиака работают. ПРИМЕЧАНИЕ: Один из них расположен в задней части датчика, второй находится в датчике, который легко доступен.
- Убедитесь, что модуль обнаружения и акустический температура клапан иглы, по крайней 38,0 ° С путем проверки цифровой дисплей, расположенный на боковой стороне коробки датчика аммиака. Подождите примерно 35 минут с момента датчик подается питание для стабилизации температуры.
- Установить впускной трубопровод и температуру мундштук до 55 ° С, нажав на имя значка "исправили" найти на рабочем столе дыхания сэмплер. Температура может быть изменено, нажав на стрелку вверх или вниз, затем, нажав кнопку "Актуалели Темп ". Нажмите "Exit", чтобы вернуться на рабочий стол. Позволяют системе не менее 5 минут для стабилизации температуры. Поддержание температуры пробоотборника и труб при 55 ° С минимизирует потери поверхности аммиака.
- Откройте программу на ноутбуке, который управляет датчик аммиака. Программа может осуществлять доступ в папку с именем "NH 3 Дыхание Программа Датчик" на рабочем столе. В этой папке, пользователь должен выбрать значок "Основной программный LabVIEW". Эта папка содержит несколько приложений, но пользователь должен выбрать "Mainsequence.vi" для доступа к нужному интерфейс. Выберите "Выполнить" в левом верхнем углу экрана. ПРИМЕЧАНИЕ: Это начинается линия блокировки калибровки. Лазерный из QEPAS монитора работает на оптимальном тока, который выбирается во время автоматизированной процедуры линии блокировки. Этот процесс займет около 25 мин.
- Создать новую сессию на сэмплер, так что еач предметом сессия имеет свой собственный файл, сохраненный к прилагаемой флэш-диск. ПРИМЕЧАНИЕ: Это осуществляется путем открытия программы "Дыхание Sampler" находится на рабочем столе сэмплер. Существует пространство для идентификации сессии соответственно. Все данные, полученные в ходе сессии будут сохранены на флэш-накопителе под этим идентификатором. Дата эксперимента обычно используется как часть имени файла. Впускной и температура мундштука должна быть скорректирована перед входом в программу дыхания дискретизации.
- Включить новый одноразовый мундштук во впускной трубе. Одноразовые перчатки, чтобы избежать загрязнения мундштук с аммиаком от пальцев.
2. Дыхание для сбора проб
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий Экспертный совет организации (Совет по этике) должен одобрить любое исследование, которое включает в себя людей в качестве субъектов. Есть много факторов, которые могут резко повлиять дыхание аммиак. Эти факторы могут изменить измерения аммиака дыхание непосредственноffecting системных уровень аммиака или путем воздействия на путешествие дыхания метаболитов из легких в инструментовке.
- Убедитесь, предметы прибыть в лабораторию в состоянии натощак, не потратив ни еды в течение примерно 12 часов по прибытии и что они воздержались от осуществления утром перед тестированием.
- Обеспечить вещество не была введена в полость рта по крайней мере 1 час до сбора данных. Убедитесь, что субъекты чистить зубы больше, чем 1 час до тестирования.
- Сиденья объект в перед датчиком аммиака. Поручить его держать входную трубу, и убедитесь, что они не касаются мундштук, чтобы избежать загрязнения аммиака.
- Нажмите кнопку "Пуск" на интерфейсе сэмплер. Были предметом выдох в трубку до тех пор, как они могут, или пока оператор не считает образца достаточным. ПРИМЕЧАНИЕ: Это один полный выдох, продолжительностью не менее 10 сек. Давление Рот измеряется в режиме реального времени в качестве суррогатадля расхода. Манометр цветом помогает подчиненную продукцию и поддержания желаемого выдоха давление 10 см воды, которая представляет собой скорость выдоха потока 50 мл / с. Эта скорость потока была выбрана, поскольку она была принята ОВД / ERS для протокола, чтобы определить Fe NO. Этот показатель выдох поток достижимо дети и взрослые. Аналогично три воспроизводимые выдохов должно быть получено, что отличаются менее чем на 10%.
- Нажмите кнопку "Стоп" на интерфейсе сэмплер, когда образец дыхания завершена.
3. Измерение образец дыхания
- После того, как образец дыхания был проанализирован, лаборант использовать монитор, то есть способность к анализу любой сегмент этого профиля дыхания. Часть дыхания, что представляет интерес является фаза сегмент III. Это характеризуется «плато» в концентрации углекислого газа и находится в середине, чтобы поздней стадии BREATH.
- Выберите фазы III части пробы, перетаскивая вертикальные линии на интерфейсе сэмплер, чтобы начать, когда плато углекислого газа и останавливаются прямо перед падением давления дыхания. См. рисунок 1 для разъяснений.
- Сохраните данные на флэш-накопитель, нажав кнопку "Store" на интерфейсе сэмплер с сенсорным экраном.
- После того как данные дыхание были сохранены, пользователь может выбрать "Пуск", чтобы начать новый образец дыхания.
4. Иллюстрирующую действие для полоскания полости рта и рН на дыхание аммиака
- Пример 3 вдохов, чтобы установить базовый уровень аммиака. Убедитесь, что вдохов взяты по крайней мере 5 мин друг от друга.
- Тщательно прополоскать рот с 30 мл аликвоты в воды в течение 60 секунд.
- Соберите образец дыхания в течение 60 секунд от полоскания (раздел 2). Сбор образцов дыхания в течение следующего часа наблюдать изменение аммиака с течением времени. ПРИМЕЧАНИЕ: СэмПлес могут быть приняты так часто, как каждую минуту, но более длительные интервалы обычно используются.
- Тщательно прополоскать рот с 30 мл аликвоты в основной раствор (бикарбоната натрия в воде) в течение 60 секунд и повторите 4.2.1.
- Тщательно прополоскать рот с 30 мл аликвоты кислотного раствора в течение 60 секунд в и повторите 4.2.1.
5. Иллюстрирующую действие впускных и Транспорт Tubing температур на дыхание аммиака
- Примеры три вдохов более в течение 15 мин с температурой на входе устанавливается ниже температуры тела, примерно 30 ° С.
- Увеличьте температуру на входе и транспортной трубы до 55 ° С соответственно с помощью значка на рабочем столе на интерфейс сенсорного экрана на дыхание сэмплер. Позвольте системе, по крайней мере 5 мин для достижения устойчивого состояния.
- Образец 3 вдохов, 5 мин, кроме в нагретой входе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Субъекты можно ожидать производить широкий спектр базовых уровнях аммиака дыхания. Здоровые люди могут начать день с дыхания измерения аммиака 100-1000 частей на миллиард. Полоскание рта с любой жидкости немедленно изменяет количество обнаруживаемых дыхания аммиака. Нейтральные и кислые жидкости обычно сократить количество наблюдаемой аммиака более чем на половину. Эти уровни затем вернуться к исходному уровню, как последствия полоскания прекратит свое действие. Эффекты воды, кажется, рассеиваются в течение 15 мин, в то время как кислота может держать обнаружению дыхание аммиака к минимуму в течение более 2 часов. Основной полоскание, такого как бикарбонат натрия, удвоится или утроится количество обнаруживаемых дыхания аммиака, прежде чем вернуться до исходного в течение периода 20 мин. Примечательно, что перекись водорода, кажется, не влияет выдыхаемом воздухе аммиака больше, чем другие полосканий; Таким образом, это не кажется, что бактерии полости рта в значительной мере способствовать измерения аммиака дыхания.
Как отметилБове, пробоотборник связан с датчиком аммиака обеспечивает непрерывные данные техник можно использовать для оценки качества образца дыхания. Давление Рот и углекислый газ являются две характеристики выдохе используется для проверки образец дыхания. Давление Рот служит в качестве суррогата к потоку воздуха из легких в сэмплер. Техник должен убедиться в том, что субъект оказывает достаточно поток альвеолярного воздуха, в котором содержится метаболит интерес, в мониторе. Техники должны ожидать нормальный диапазон давления рот от 9 до 10,5 см воды. Выдох должен быть достаточно устойчивым в течение 10-20 сек, что проявляется в стандартном отклонении давления рта. Стандартное отклонение качества дыхании должно быть менее 1 см воды.
Измерение Диоксид углерода также имеет важное значение, поскольку это позволяет ближе оценка процесса выдоха. В фазе I, выдох инициируется и состав выдыхаемого газа состоит из предварительнопреимущественно анатомическое мертвое пространство воздуха (~ 21% кислорода, 0,03% диоксида углерода, 78% азота и 0,5% воды), т.е.., воздух, который вдохнул в течение ингаляции фазы предыдущего цикла дыхания. Во время фазы II, альвеолярный газ проходит в анатомического мертвого пространства и смешивается с остаточной мертвого пространства воздухом, в результате чего концентрация углекислого газа увеличивается быстро. Концентрация углекислого газа в выдыхаемом воздухе продолжает расти, хотя и медленнее, в течение III фазы выдоха и пикового значения (конец приливная концентрация) соответствует концентрации углекислого газа в венозной крови. Это постепенное увеличение концентрации диоксида углерода в течение фазы III происходит из-за смешивания альвеолярных газов с остальной частью мертвого пространства воздуха и за счет медленного опорожнения альвеолярных мешочков. Состав дыхания в конце стадии III составляет около 13% кислорода, 5% диоксида углерода, 78% азота и 4% воды. Уровни углекислого газа при фазовом III части BREATH может варьироваться от 30-40 мм рт. Фаза III соответствует, где эти CO 2 уровня плато (1А-D).
Выдыхаемом воздухе, которые объединяют фаз III часть данных дыхания для различных условий Рисунок 1.. 1а) Типичный образец дыхания, которая интегрируется в III фазы часть данных дыхания. Зеленые и красные вертикальные линии установить срок, в котором линия должна быть проанализирована. Первые порции выдоха игнорируются. 1b) Эффект кислый ополаскиватель имеет на дыхание аммиака. Превращение NH 3 в NH 4 + резко снижает количество обнаруживаемого аммиака. Снижение потока приводит к уменьшению альвеолярной аммиака в выборку дыхания, как показано на 1с. Снижение потока делает пOT позволяют столько альвеолярного воздуха для отбора проб. 1г) дыхание образец, который объединяет фазы I, II, и III. Включение первого и второго этапов в анализе снижает аммиак и диоксид углерода значительно. Это неточно отражает системного аммиака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Большинство предметов в состоянии производить приемлемый дыхание с первой попытки. Тем не менее, некоторые предметы потребует повторения дыхании. Кроме того, как давление и диоксид углерода записаны, они могут также рассматриваться в анализе данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества неинвазивного процедуры, позволяющей обнаруживать следовые метаболитов в реальном времени очевидны. Тем не менее, область исследований дыхания изо всех сил, чтобы выполнить этот потенциал. Измерение Дыхание представляет собой динамический процесс уязвимым для многих сопутствующих факторов. Наш подход имеет важные преимущества: в частности, чувствительность и скорость Райс QEPAS монитора на основе аммиака, соединенного с дыханием сэмплер позволили нам оценить и определить дыхание факторы сбора уместны в точных измерений. Такой подход очень надежный: например, после некоторых предварительных экспериментов, каждый из почти 500 отдельных точек данных дыхания, собранных для недавних экспериментов согласуется с ожидаемым исходом 9.
До различные факторы, влияющие на выдыхаемого воздуха аммиак не более понятны, важно обеспечить тщательное и единые инструкции для субъектов до приезда гостя. В настоящее время мы обычно просят подданныхбыстро после полуночи для утреннего сбора, чистить зубы больше, чем 1 час до презентации, и избегать упражнений, курение, или заполнив автомобилей с нефтяного топлива. Хотя мы оценили различная еда Схемы накануне вечером сбора данных (например, с высоким содержанием клетчатки против низким содержанием клетчатки), мы не установлено, что диета убедительно воздействия исходные данные утром в день обследования. Утренние коллекции также минимизировать воздействие очевидных суточных вариаций, которые, кажется, происходят по неизвестным причинам 13.
Там могут быть другие, не менее действительные или улучшенные методы выдыхаемого воздуха коллекции аммиака. Это возможно, например, что стандартный полоскания на набор момент времени до сбора дыхания может привести к полезной измерения ротовой слизистой аммиака, который также может отражать системных уровней. Другой путь может быть отказаться от полости рта и измерить носовой аммиак или как 10,14. Этот последний подход может устранить необходимость FOг интерфейс сэмплер. Несмотря на это, любой метод должен тщательно рассмотреть различные технические факторы, имеющие отношение к этой нестабильной метаболита включая влажности, температуры, рН, расхода, а также ротоглотки биологии.
Естественно, предположения и убеждения о способе измерения имеют критическое отношение к анализу данных. Мы считаем, что давление и диоксид углерода из ключевых аспектов контроля качества. Тем не менее, он не уверен, например, аммиак, должен ли быть представлены как измерено, или диоксид углерода, скорректированных с единиц, таких как частей на миллиард или пкмоль. Чем больше опыта и уверенности приобретаются в различных технических источников ошибок, сложные соображения действующие в анализе данных вступит в большей нацеленности и будет двигать лучшее понимание этого очень сложной биологии. (Рис. 2: Случайные и неслучайные Ошибка измерения Правда Биологическая изменчивость в сравнении биологическом эпифеноменами или B Аномальная Дыхание...и Устные / Носовые Факторы или С и D. Оборудование Производительность.)
Рисунок 2. Диаграмма пациента к интерфейсу дыхания к монитору аммиака. А) тестируемых пациентов, а также самый непредсказуемый часть процесса сбора дыхание. Питание пациентов, физические упражнения и привычки к курению может иметь большое влияние на сбор данных. B) Дыхание выдохи являются переменными от человека к человеку, поэтому метод стандартизировать вдохов важно. Предоставление визуальный сигнал, чтобы обеспечить желаемый поток воздуха из легких хорошо работает, чтобы держать выдохов равномерным. C) аппарат интерфейс Дыхание тесно связано с B в этой последовательности дыхания является важным фактором при сравнении предметов. Дыхание сэмплер инrface позволяет пользователю просматривать различные параметры образец дыхания в режиме реального времени. D) Аммиак мониторы могут проявляться с различными технологиями. Кварцевый усиливается фотоакустическая спектроскопия имеет много врожденных преимуществ, которые мы считаем идеальным для анализа выдыхаемого воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Важные ограничения настоящего способа следует признать. В то время как пробоотборник является относительно недорогим и портативный монитор аммиака, как в настоящее время настроен, не является ни. В результате субъекты должны прийти к нашему преданному дыхания исследовательского пространства, поскольку мы не можем легко перемещать наше оборудование в клинику. Этот фактор, наряду с требованием, чтобы дыхание субъекта выдох один глубокий вдох, последствия которой субъекты могут быть изучены (т.е. больных пациентов с циррозом печени, ключевой целевой аудитории, зачастую практически исключается). Кроме того, поскольку у нас есть только один монитор, мы ограничены в ряде субъектов, которые могут быть реально изученных в данном протоколе. В свою очередь, это влияет на размер выборки и власть.
Как отмечалось выше, сбор оксида азота был стандартизирован совместными усилиями Американского торакального общества и Европейского респираторного общества. Там в настоящее время нет эквивалентного соглашения для дыхания аммиака, хотя несколько групп делают существенный вклад в улучшение положения измерения аммиака дыхания. Как литературы по трассировки дыхания измерения метаболита в целом и аммиака в частности продолжает развиваться 15 там конечно будет много изменений и улучшений в будущем. Мониторы, которые меньше, более портативными и дешевле имеют решающее значение для успешных многоцентровых клинических испытаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы признают, финансовая поддержка от Национального научного фонда (NSF) грант ЕЭС-0540832 под названием «Середина Инфракрасные технологии для здравоохранения и окружающей среды (MIRTHE)"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rice Ammonia Monitor System | N/A | N/A | Not available for commercial purchase |
| Loccioni Breath Sampler | Loccioni Humancare | N/A | Single breath version |
| Disposable Mouth Piece | WestPrime Healthcare | G011-200 | Manufacturer is AlcoQuant |
| Laptop | Lenovo | N/A | Old model no longer sold by manufacturer |
| Acid Rinse | N/A | N/A | Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc) |
| Base Rinse | N/A | N/A | Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda) |
| Neutral Rinse | N/A | N/A | Water |
References
- Adeva, M. M., Souto, G., Blanco, N., Donapetry, C.
- Auron, A., Brophy, P. D. Hyperammonemia in review: pathophysiology, diagnosis, and treatment. Pediatric nephrology. 27 (2), 207-222 (2012).
- Blanco Vela, C. I., Bosques Padilla, F. J. Determination of ammonia concentrations in cirrhosis patients-still confusing after all these years. Annals of hepatology. 10 Suppl 2, (2011).
- Mpabanzi, L., Ol de Damink, S. W. M., van de Poll, M. C. G., Soeters, P. B., Jalan, R., Dejong, C. H. C. To pee or not to pee: ammonia hypothesis of hepatic encephalopathy revisited. European journal of gastroenterology & hepatology. 23 (6), 449-454 (2011).
- Goggs, R., Serrano, S., Szladovits, B., Keir, I., Ong, R., Hughes, D. Clinical investigation of a point-of-care blood ammonia analyzer. Veterinary clinical pathology / American Society for Veterinary Clinical Pathology. 37 (2), 198-206 (2008).
- Huizenga, J. R., Tangerman, A., Gips, C. H.
- Lewicki, R., et al. Real time ammonia detection in exhaled human breath with a quantum cascade laser based sensor. 2009 Conference on Lasers and ElectroOptics and 2009 Conference on Quantum electronics and Laser Science Conference. 1, (2009).
- American Thoracic Society. European Respiratory Society. Recommendations for Standardized Procedures for the Online and Offline Measurement of Exhaled Lower Respiratory Nitric Oxide and Nasal Nitric Oxide. American journal of respiratory and critical care medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
- Solga, S. F., et al. Factors influencing breath ammonia determination. Journal of breath research. 7 (3), (2013).
- Schmidt, F. M., et al. Ammonia in breath and emitted from skin. Journal of breath research. 7 (1), (2013).
- Spaněl, P., Dryahina, K., Smith, D. A quantitative study of the influence of inhaled compounds on their concentrations in exhaled breath. Journal of breath research. 7 (1), (2013).
- Boots, A. W., van Berkel, J. J. B. N., Dallinga, J. W., Smolinska, A., Wouters, E. F., van Schooten, F. J. The versatile use of exhaled volatile organic compounds in human health and disease. Journal of breath research. 6 (2), (2012).
- Hibbard, T., Killard, A. J. Breath ammonia levels in a normal human population study as determined by photoacoustic laser spectroscopy. Journal of breath research. 5 (3), (2011).
- Wang, T., Pysanenko, A., Dryahina, K., Spaněl, P., Smith, D. Analysis of breath, exhaled via the mouth and nose, and the air in the oral cavity. Journal of breath research. 2 (3), (2008).
- Amann, A., Smith, D. Volatile Biomarkers. 1st Edition. , (2013).
