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Biology

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

Published: July 23, 2014 doi: 10.3791/51662
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1, 1, 1, 2
1Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen.

Abstract

SIVQ-LCM ist eine neue Methode, die automatisiert und rationalisiert die traditionelle, benutzerabhängige Laser Dissektion Prozess. Es zielt darauf ab, eine fortschrittliche, schnell anpassbar Laser Dissektion Plattform-Technologie erstellen. In diesem Bericht beschreiben wir die Integration der Bildanalyse-Software ortsinvariantem Vektor Quantisierung (SIVQ) auf die ArcturusXT Instrument. Die ArcturusXT System enthält sowohl eine Infrarot-(IR) und Ultraviolett-(UV) Laser, so dass für bestimmte Zelle oder große Fläche Dissektionen. Das Hauptziel ist es, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Laser-Dissektion, Probendurchsatz zu erhöhen verbessern. Dieser neue Ansatz ermöglicht Mikrodissektion von tierischen und menschlichen Geweben in der Forschung und der klinischen Arbeitsabläufe.

Introduction

Ursprünglich in der Mitte der 1990er Jahre entwickelt, die Laser Mikrodissektion (LCM) ermöglicht dem Benutzer, genau zu erfassen spezifische Zellen oder Zellbereiche von einem histologischen Gewebeschnitt mittels mikroskopischer Visualisierung 1, 2. Viele Studien, die molekulare Analyse von LCM gegen Kratzer Gewebe veranschaulichen den Wert der Methode 12.3. Darüber hinaus gibt es drei Videoprotokoll Veröffentlichungen über die Technologie, die für die Anzeige von 13, 14 verfügbar sind. Doch trotz seiner bewährten Wert, LCM kann langwierig und mühsam sein, wenn das Ziel von Interesse ist eine verteilte Zellpopulation in einer heterogenen Gewebeschnitt, oder wenn eine große Anzahl von Zellen sind für bestimmte Downstream-Anwendungen wie Proteomics erforderlich. Die Belastung für den menschlichen Bediener platziert führte uns zu einer halbautomatischen Präparation Ansatz für LCM durch die Kombination eines leistungsfähigen Bildanalyse-Algorithmus, um die LCM-Verfahren 15 führen zu entwickeln.

<p class = "jove_content"> In Zusammenarbeit mit der University of Michigan, unserem Labor am NIH erweitert die bereits entwickelten und berichtete ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ)-Algorithmus in einer Art und Weise, um es in semi-automatisiert das Gewebe Auswahlprozess, damit Eigen geführt Mikrodissektion, wodurch ein Werkzeug zur Verfügung mit dem Pathologen oder Lebenswissenschaftler im Auge. Ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ) ist ein Algorithmus, der Benutzer einfach "Klick" auf einem histologischen Merkmal von Interesse, um einen Ring-Vektor (Prädikat Bild Funktion), die verwendet werden können, um den gesamten histologischen Bild erstellen zu suchen, die Anpassung der statistischen Schwelle erlaubt nach Bedarf 16-21. Die entstehende Wärme Karte zeigt die Qualität der Übereinstimmungen mit dem Anfangsbild Prädikat-Funktion und wird anschließend in einer einzigen Farbe (rot) Beschriftungskarte, die in das LCM Instrument importiert werden können umgewandelt. Anschließend wird die automatisierte Auswahl-Software, AutoScanXT, verwendet, um eine Karte zu ziehen Basisauf SIVQ Anmerkungs Führung der Erfassung der Zielzellen aus der Gewebeprobe. Das detaillierte Protokoll beschreibt die Umsetzung der in den SIVQ Mikrodissektion Workflow.

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Protocol

Das beschriebene Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den NIH Regeln für die Verwendung von menschlichen Gewebeproben verwendet.

1. Gewebepräparation

  1. Vor Beginn erhalten menschlichen Gewebeproben nach Institutional Review Board (IRB)-Protokolle.
  2. Wählen Sie die Art des Gewebes / der Zellenblock und die entsprechenden Verarbeitungsverfahren [Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), gefroren, oder Ethanol-fixierten und in Paraffin eingebetteten (Efpe)]. Formalin-Fixierung sorgt für eine optimale Histologie, gefolgt von Ethanol-Fixierung und schockgefroren. Jedoch kann die Fixierung und Gewebebearbeitungsmethoden DNA, RNA und Protein-Menge und Qualität für nachfolgende molekulare Analyse beeinflussen und sollten berücksichtigt werden.
  3. Schneiden Sie die Gewebe / Zellblockabschnitte auf den Objektträger Art (Glas, Glas-Membran-oder Metallrahmen Membran) der Wahl. SIVQ Analyse funktioniert genauso gut auf allen drei Folientypen. Bitte beachten Sie, dass die Pseudo-Deckglas-Methode (siehe unten) mit Xylol und Ethanol kann auf den Metallrahmen Membran Objektträgern durchgeführt werden, da der Schieber muss auf der Stufe invertiert werden.
  4. Wählen Sie ein oder chemisch-IHC-basierte Gewebe Fleck auf Zellen von Interesse aus dem Hintergrund zu identifizieren. Beachten Sie, dass Färbeverfahren können auch auf DNA-, RNA-und Protein-Qualität und Quantität des Gewebes. Testen Sie das Gewebe nach dem Färben auf die Grundlinie Qualität von Biomolekülen, bevor Sie fortfahren mit dem Protokoll zu beurteilen. Immunhistochemie (IHC) mit DAB 15, Immunfluoreszenz, schnell rot, de-novo-, Toluidinblau und Hämatoxylin und Eosin (H & E) (unveröffentlichte Daten): SIVQ-LCM hat sich auf Gewebe / Zytologie Folien mit Buntdurchgeführt worden.

2. Specimen Imaging

  1. Last gleitet auf den Motortisch des Mikrodissektionsgerät und starten Sie die zugehörige Software. Wählen Sie die Kontrollkästchen, um die Positionen der geladenen Folien bestimmen und sicherzustellen, dass die aufgenommenen Bilddateien sind im JPEG-Format gespeichert werden.
  2. Optimieren Sie die imAlter Qualität durch die Anpassung der Helligkeit und Schärfe des Bildes auf dem Bildschirm, entweder mit dem manuellen Fokus-Rad oder über die Software der Dissektion Instruments.
    1. Mit der Bild-Toolbox-Software innerhalb der Dissektion Instruments, stellen Sie die Helligkeit der Lampe und Kamera-Gewinn entsprechend. Beispiel Werte sind Helligkeit = 60 und Gain = 220, mit dem Diffusor.
    2. Konzentrieren Sie sich entweder manuell oder mit der Autofokus-Funktion in der Software.
  3. Nehmen Sie ein Thumbnail-Übersicht Bild von der Folie, um einen Fahrplan für die Dissektion Prozess zu ermöglichen.
    1. Für eine optimale Bildqualität eines uncoverslipped Rutsche, nutzen Sie den Diffusor unterhalb des Kondensators auf das Instrument, oder, eine kleine Menge (~ 30 ul) entweder Ethanol oder Xylole um die feuerfeste Index (pseudo-Deckglas) zu verbessern. Bei der Verwendung von Xylol, bewusst sein, sie sind giftig und ordnungsgemäße Sicherheitsmaßnahmen verwendet werden müssen, einschließlich der Verwendung von einer Abzugshaube und Schutzlaborkittel, Schutzbrille und Handschuhe.
    2. Stellen Sie den LCM Kappe auf der Folie, bis das Ethanol oder Xylole Lösung wurde komplett gelöscht oder das Polymer auf der Kappe verzerrt.
  4. Navigieren Sie die Folie und die Aufnahmen der Bereiche zu 10X, 20X oder 40X Vergrößerung seziert werden. Wenn nötig, das Image mit einer Software wie Autokorrektur (in Microsoft Office Picture Manager) wie zuvor beschrieben 22. Die Bilder müssen im JPEG-Format, um sie in den automatisierten Auswahlsoftware wieder importiert werden, damit erfasst werden.

3. Algorithmus Analyse der Bild

  1. Über aufgenommenen Bilder von der Mikrodissektionsgerät auf die SIVQ-Ordner. Installieren und öffnen Sie die ArcturusXT, Autoscan und SIVQ Softwarepakete auf dem Computer auf die Dissektion Gerät angebracht sind. Für den Zugriff auf die Software SIVQ, kontaktieren Sie bitte Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
  2. Offene SIVQ und laden Sie das aufgenommene Bild (jpeg) von Interesse. </ Li>
  3. Navigieren Sie zu dem Bereich von Interesse und / oder die Größe der Anzeigefenster (Viewport-5 & 6). In der SIVQ Software Viewport 5 zeigt die Vorverarbeitung Bild-und Viewport-6 zeigt die Post-Processing-Bild 16.
  4. Wählen Sie die Größe des Rings und der Anzahl der Vektor-Ringe zu verwenden.
  5. Wählen Sie das Prädikat Bild-Funktion, um mit der rechten Maustaste darauf in Viewport 6 erfasst werden.
  6. Klicken Sie auf "Scan", um das Bild zu analysieren.
  7. Stellen Sie die statistische Wahrscheinlichkeit Bildabgleich mit den beiden Gleitschienen. Der obere Balken stellt die Gesamt Vektor Spezifität und wird verwendet, um Bereich von der ersten Scan auszuschließen sind (mit Sensibilität, wie durch die ausgewählten Variablen "Stat" definiert), die übermäßige enthalten Bereich darstellen kann. Umgekehrt ist der untere Schieber verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, nachdem eine Prüfung durchgeführt wird, mit der Absicht der Erhöhung der Fläche, die als eine Übereinstimmung klassifiziert wird. Beide Schieberegler utiren den "Stat"-Variable als Anfangsgrundlinie Empfindlichkeitsschwelle.
  8. Um das Bild zu speichern, klicken Sie auf "Speichern als jpeg" (Bild wird nun im Ordner c :/ vq_test / Bilder gespeichert).
  9. Analyse des Bildes mit dem Algorithmus. Der Ausgang des Analysealgorithmus muss in einer kommentierten Bild führen, damit es in SIVQ-LCM verwendet werden. Derzeit ist die aktuelle Version des SIVQ Kerntriebwerk in der Beta-Version Testen mit der Erwartung, dass die volle Produktionsversion (verfügbar ab Q1 2014) wird eine vollständige Software Development Kit (SDK) und Application Programming Interface (API) für die vereinfachte Integration von nehmen User-generierten Raumfilter und nachgelagerten Workflow Datenverarbeitungsschritte mit dem Kernring passenden Motor. Das SDK wird mit einem kompletten Satz der Dokumentation verteilt werden.
    1. Sicherzustellen, dass die SIVQ heatmap wird auf eine gleichmäßige rote Farbe verändert.
  10. Exportieren Sie das Bild. Es ist wichtig, wieder einzubetten, die die Positionskoordinaten in der pOST-Analyse-JPEG-Bild mit Hilfe eines HEX-Editor, um in der Datei-Header aus dem Originalbild Dissektionsinstrument einfügen. Die entsprechenden Daten können zwischen "Start of Image"-Marker (0xFF, 0xD8) und dem ersten "Define Quantisierung Table"-Marker (0xFF, 0xDB) gefunden werden.

4. Microdissection

  1. Platzieren Sie den LCM Kappe in der Mitte der Region von Interesse, wo die Bilder wurden für die Analyse eingefangen SIVQ.
  2. Kalibrieren und Qualitätskontrolle (QC) die UV / IR-Laser und die Parameter, einschließlich Energie, Dauer-, Laser-Standorten und UV Schnittgeschwindigkeit (wie vom Hersteller empfohlen) optimieren. Führen Sie diese Kalibrierungen vor dem erneuten Import der Bild analysiert.
  3. Offene AutoScanXT (automatisierte Auswahl-Software) und importieren Sie die analysierte Bild von c :/ vq_test Ordner / Bilder.
  4. Trainieren Sie die automatisierte Software, um die Auswahl SIVQ Annotation erkennen und schaffen die Dissektion der Karte.
    1. Um ein Trai erstellenning-Datei, wählen vier Regionen von Interesse (durch "blaue Kreise" gekennzeichnet) auf der "rote Farbe" der SIVQ analysierte Bild.
    2. Wählen Sie die Hintergrundbereiche (durch das "rote Quadrate" gekennzeichnet), die nicht seziert werden.
    3. Klicken Sie auf "Analyze"-Taste, um die Trainingsdatei, die für die spätere Verwendungen gespeichert werden können, zu erzeugen.
  5. Führen Mikrodissektion mit der entsprechenden Infrarot-(IR) und / oder Ultraviolett (UV)-Laser.
    1. Kopieren Sie die ausgewählten Bereiche auf die "Live"-Bild.
    2. In der "microdissect" Toolbox, wählen Sie die entsprechende Capture IR-oder UV-Schneid Tasten.
  6. Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, bewegen Sie den LCM Kappe an der QC-Station und erfassen ein Bild der präparierten Gewebe / Zellen. Ein weiterer Ansatz ist die Kappe auf einen leeren Bereich der Folie vor dem Verschieben in den QC-Station zu platzieren, ermöglicht dies dem Benutzer, Bilder bei verschiedenen Vergrößerungen zu nehmen.
  7. Nehmen Sie ein Bild der Gewebebereich von Interesse nach Mikrodissektion zur weiteren Beurteilung Hebeeffizienz.
  8. Wenn die gewünschten Zellen wurden erfolgreich seziert wurde, klicken Sie auf den "gegenwärtigen Zeitpunkt" in der ArcturusXT Software und entfernen Sie die LCM Kappe, um die molekulare Extraktionsverfahren für Downstream-Analyse zu starten.

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Representative Results

Ein FFPE menschlichen Brustgewebeschnitt wurde für Zytokeratin AE1/AE3 mit einem Standard-IHC-Protokoll 23 immun. Nach dem Färben wurde das Gewebe auf dem Objektträger ArcturusXT Stufe angeordnet, und die SIVQ LCM-Protokoll wurde, wie oben beschrieben eingeleitet. Da das Gewebe nicht für die Mikrodissektion Deckglas versehen werden, die IHC + gefärbten Zellen schwierig sein, visuell zu erkennen (Abbildung 1A). Um somit eine bessere Indexanpassung und ein verbessertes Bild bereitzustellen, Xylole wurden in den Gewebeabschnitt hinzugefügt, um eine Pseudo-Deckglas 15 (1B) zu schaffen. Ein JPEG-Bild wurde dann von den Pseudo-Deckglas-Bereich eingefangen und in SIVQ für den Algorithmus Analyse importiert. Ein Prädikat Bild-Funktion (dunkelbraun DAB-Färbung) durch den Benutzer ausgewählt initiierte die SIVQ Algorithmus, um das Bild (Abbildung 1C) zu analysieren. Die SIVQ heatmap wurde dann in einen "roten Farbe", die von der automatischen Selektion Software (Fig. 1 erkannt wird umgewandeltD). Die Xylole wurden verdampfen gelassen, und die SIVQ heatmap wurde in die automatische Auswahlsoftware (1E) eingeführt und die markierten Zellen wurden mit dem IR-Laser präpariert. Das LCM Kappe wurde dann auf den QC Station der ArcturusXT Instrument bewegt und visuell auf Dissektion Effizienz (1F) zu bewerten. Die verbleibende Gewebe wurde auch geprüft (1G) und die SIVQ Heatmap wurde wieder eingeführt, um eine weitere Bewertung der Mikrodissektion Effizienz (1H).

Figur 1
Abbildung 1. SIVQ-LCM von IHC gefärbt FFPE Brustgewebe. A) Uncoverslipped Bild von Cytokeratin AE1/AE3 gefärbt FFPE Brustgewebe. B) Xylenes beschichtet (pseudo-Deckglas) Bild von der Abdeckung A. D) Die Heatmap wurde zu einer einzigen Farbe (rot) umgewandelt gefangen genommen. In der ArcturusXT wurde die AutoScanXT Software geschult, um die rote Beschriftung erkennen E.) Die Mikrodissektion Karte von der AutoScanXT-Algorithmus. F) Bild der mikrodissezierten Brust-Epithelzellen auf der LCM Kappe. G) Bild des Gewebes auf der Folie erzeugt nach Mikrodissektion. H) Überlappung der Mikrodissektion Karte (Panel E) auf der Gewebebereich, der seziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Wir stellen ein Protokoll für die Anwendung SIVQ-LCM auf immun Epithelzellen aus FFPE menschlichem Brustgewebe microdissect. Die Verwendung eines Bildanalysealgorithmus, wie SIVQ, reduziert die Menge der Handhabungszeit für die Mikrodissektion Prozess erforderlich. Dies ist eine potentiell wichtige Neuerung, da Bediener Zeit und Mühe ist typischerweise der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die präzise Präparation von Zellen von Interesse. In dem vorliegenden Protokoll, die wir speziell angepasste unser Verfahren an die ArcturusXT Instrument, obwohl es wahrscheinlich möglich sein, SIVQ und andere Algorithmen zu anderen im Handel erhältlichen Mikrodissektion Instrumente sowie anzupassen. Neben der Verbesserung der Effizienz, kann dieser neue Ansatz können Benutzer, die nicht-Histopathologie Experten sind Mikrodissektion durchzuführen. Schließlich ist die Verwendung eines Algorithmus, um die Mikrodissektionsverfahren fahren kann größer Reproduzierbarkeit von Site-to-Site-Benutzer, indem Subjektivität in der Identifizierung von Zellen ermöglichen o f Interesse.

Während SIVQ zeigt breite Anpassungsfähigkeit, mehrere Klassen von Bildgegenstand, einschließlich Histologie, ist es wichtig zu erkennen, dass es nicht beabsichtigt ist, als ein universelles Bildverarbeitungs / Segmentierung Werkzeug dienen, sondern vielmehr als eine Hocheffizienz-First-Pass-Vordergrund-Auswahl Tool. In dieser Eigenschaft verwendet, hat es hohen Nutzen für die Vorhersage, ob eine bestimmte Klasse von Bildgegenstand ist für numerische Segmentierungsansätze. Wenn SIVQ erfolgreich ist, besteht eine hohe Vorhersagekraft, die entweder: a) eine verfeinerte und gezielte Bildanalyse / Segmentierungsansatz wird sehr erfolgreich sein und / oder b) eine optimierte Maschinen ausgewählt SIVQ Vektor wirksam sein wird bei der Wiedergabe einer klinischen Workflow-Lösung bereit. In jedem Umstand, dient der Einsatz von SIVQ als wirksame Selektierung Werkzeug, um Bilder, die rechnerisch Gegenstand gefügig Lösungen in Bezug auf Segmentierbarkeit Vordergrund stellt identifizieren.

ntent "> Während wir zuvor beschrieben die Verwendung der SIVQ LCM-Protokoll nur für die mRNA-Expression Microarray-Experimenten 15, glauben wir, ist das Protokoll für die meisten nachgeschalteten molekularer Assays und können besonders nützlich für die molekulare Assays, die eine große Zahl von Zellen erfordern, wie Proteomics. Für diese Studien werden große Mengen von Zellen müssen aufgrund der Unfähigkeit, um Proteine ​​zu verstärken beschafft werden. Darüber hinaus ist die Einführung neuer Technologien, wie zum Beispiel Next-Gen Sequencing (NGS), betont die Notwendigkeit, mit so beginnen reinen einer Probe wie möglich. Die Fähigkeit für SIVQ LCM-, Zellen über beide morphologischen Merkmalen und / oder Färbung Qualitäten isolieren könnte die Fähigkeit, mehr leicht zu isolieren reine Zellpopulationen zu ermöglichen.

Es ist wichtig, richtig vorbereitet Gewebe für reproduzierbare Ergebnisse sowohl für die Analyse und SIVQ Mikrodissektion aufweisen. Für optimale Bedingungen für LCM ist es am besten, seziert in einem Raum mit niedriger Luftfeuchtigkeit durchführen und pflegen richtig dehydrated Gewebe. Darüber hinaus gewährleisten, dass die Färbung des Gewebes ist reproduzierbar. Schließlich ist die Vertrautheit mit der Dissektion wichtiges Instrument zur erfolgreichen SIVQ-LCM.

Die SIVQ-LCM-Protokoll hier präsentiert wird, ist die ersten Schritte zur halbautomatischen Mikrodissektion, die Anwendungen in zukünftigen klinischen Tests haben können, da die aktuellen Dissektion Methoden sind nicht leicht in der Lage, den Umgang mit großen Workloads. Zusammenfassend glauben wir, dass SIVQ-LCM ist ein neuer Vorstoß in den Bereich der automatisierten Mikrodissektion und bietet einen Ausgangspunkt, von dem Ermittler und Algorithmus-Entwickler können weitere Verbesserung der Technologie.

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Disclosures

Michael R. Emmert-Buck ist ein Erfinder auf NIH-statt Patente für Laser Mikrodissektion und erhält lizenzbasierten Vergütungen durch die NIH Technologie-Transfer-Programm.

Acknowledgments

Die Studie wurde zum Teil durch die Interne Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive Charged Glass Slides Thermo Scientific 4951Plus-001
Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis  Sigma Aldrich 247642 CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous The Warner-Graham Company 6.505E+12 CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Arcturus CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
ArcturusXT Laser Microdissection Instrument Life Technologies ARCTURUSXT
AutoScanXT Software Life Technologies An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.
Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) University of Michigan This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]

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References

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