Summary
SIVQ-LCM er en innovativ tilnærming som utnytter en datamaskin algoritme, Romlig Invariant Vector Quantization (SIVQ), å drive laser-fangst microdissection (LCM) prosess. Den SIVQ-LCM arbeidsflyt forbedrer hastigheten og nøyaktigheten av microdissection, med anvendelser i både forskning og klinisk innstillinger.
Abstract
SIVQ-LCM er en ny metode som automatiserer og effektiviserer mer tradisjonelle, brukeravhengig laser disseksjon prosess. Det har som mål å skape et avansert, raskt tilpasses laser disseksjon plattformteknologi. I denne rapporten beskriver vi integrering av bildeanalyse programvare Romlig Invariant Vector Quantization (SIVQ) på ArcturusXT instrument. Den ArcturusXT Systemet inneholder både en infrarød (IR) og ultrafiolett (UV) laser, noe som åpner for bestemt celle eller stort område disseksjoner. Hovedmålet er å forbedre hastighet, nøyaktighet og reproduserbarhet av laser disseksjon å øke prøvekapasitet. Denne romanen tilnærming forenkler microdissection av både dyr og menneskelige vev i forskning og kliniske arbeidsflyter.
Introduction
Opprinnelig utviklet på midten av 1990-tallet, laser capture microdissection (LCM) gjør det mulig for brukeren å presist fange spesifikke celler eller cellulære regioner fra en histologisk vevsnitt.F.eks via mikroskopisk visualisering 1, 2. Mange studier som sammenligner molekylær analyse av LCM versus vev skraper illustrere verdien av metoden 3-12. I tillegg er det tre videoprotokoller publikasjoner på den teknologi som er tilgjengelig for visning 13, 14.. Men til tross for sin bevist verdien, kan LCM være kjedelig og arbeidskrevende når målet om interesse er en spredt cellepopulasjon i et heterogent vev delen, eller når et stort antall celler er nødvendig for spesifikke nedstrøms applikasjoner som proteomikk. Den belastningen på den menneskelige operatøren ledet oss til å utvikle en semi-automatisert disseksjon tilnærming for LCM ved å kombinere en kraftig bildeanalyse algoritme for å veilede LCM prosess 15.
<p class = "jove_content"> I samarbeid med Universitetet i Michigan, vårt laboratorium ved NIH utvidet tidligere utviklet og rapportert Romlig invariant vektor kvantisering (SIVQ) algoritme på en måte å la den semi-automat vevet utvelgelsesprosessen egenverdi for guidet microdissection, og dermed gjør tilgjengelig et verktøy med patologen eller livsvitenskapsmann i tankene. Romlig invariant vektor kvantisering (SIVQ) er en algoritme som gjør at brukeren kan ganske enkelt "klikk" på en histologisk funksjon av interesse å lage en ring vektor (predikat bildefunksjonen) som kan brukes til å søke i hele histologiske bildet, justere statistisk terskel som trengs 16-21. Den resulterende varmekartet viser kvaliteten på kampene til den opprinnelige predikatet bildefunksjon og er senere omgjort til en enkelt farge (rød) merknad kart som kan importeres inn i LCM instrument. Den automatiserte utvalg programvare, AutoScanXT, blir så brukt til å tegne et kart basertpå SIVQ sin merknad guiding fangst av målcellene fra vevsprøve. Den detaljerte protokollen nedenfor beskriver gjennomføringen av SIVQ inn i microdissection arbeidsflyten.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den beskrevne protokollen ble ansatt i henhold til NIH regler om bruk av menneskelige vevsprøver.
En. Vevpreparerina
- Før begynnelsen, få menneskelige vev prøver i henhold til Institutional Review Board (IRB)-protokoller.
- Velg den type vev / celleblokk og tilhørende prosesseringsmetode [formalinfiksert parafin-embedded (FFPE), frossen, eller etanol-fast parafininnleiret (EFPE)]. Formalin fiksering gir optimal histologi, etterfulgt av etanol fiksering og flash-frosset. Imidlertid kan fiksering og vev bearbeidingsmetoder påvirke DNA, RNA og protein kvantitet og kvalitet for nedstrøms molekylær analyse, og bør tas i betraktning.
- Skjær vev / celleblokkseksjoner på lysbildet type (glass, membran glass eller metall ramme membran) av valget. SIVQ analyse fungerer like godt på alle tre glide typer. Vær oppmerksom på at pseudo-dekk metode (beskrevet nedenfor) med xylener og ethanol kan ikke utføres på metallrammen membran lysbilder siden raset må byttes om på scenen.
- Velg en kjemisk-eller IHC-baserte vev flekken for å identifisere celler av interesse fra bakgrunnen. Legg merke til at farvemetoder kan også påvirke DNA, RNA og protein kvaliteten og kvantiteten av vevet. Test vevet etter farging å vurdere baseline kvalitet av biomolekyler før du fortsetter med protokollen. SIVQ-LCM har blitt utført på vev / cytologi lysbilder farget med: immunhistokjemi (IHC) med DAB 15, immunfluorescens, rask rød, de novo rød, toluidinblått, og hematoxylin og eosin (H & E) (upubliserte data).
2. Specimen Imaging
- Load glir ut mot den motoriserte fasen av microdissection instrument og starte relatert programvare. Merk av i boksene for å utpeke posisjonene til de lastede lysbilder og sikre den fangede bildefiler skal lagres i JPEG-format.
- Optimalisere imalder kvaliteten ved å justere lysstyrken og fokus av bildet på skjermen, enten ved hjelp av den manuelle fokushjulet eller gjennom disseksjon instrumentets programvare.
- Bruke Image Toolbox innenfor disseksjon instrumentets programvare, sette lampen lysstyrke og kamera gevinst på riktig måte. Eksempelverdier er lysstyrke = 60 og gevinst = 220, med diffuser.
- Fokus enten manuelt eller med autofokus-funksjon i programvaren.
- Fang en oversikt miniatyrbilde av lysbildet for å gi et veikart for disseksjon prosessen.
- For optimal bildekvalitet av en uncoverslipped lysbilde, utnytte diffuser under kondensatoren på instrumentet, eller, legg en liten mengde (~ 30 mL) av enten etanol eller xylener å forbedre den ildfaste indeksen (pseudo-dekkglass). Ved bruk av xylener, være klar over at de må brukes giftige og riktige sikkerhetstiltak, herunder bruk av et avtrekksskap og laboratoriefrakk, vernebriller og hansker.
- IKKE plasser LCM cap på lysbildet til etanol eller xylener løsningen har helt ryddet eller polymeren på hetten vil bli forvrengt.
- Naviger raset og ta bilder av de områdene som skal dissekert på 10X, 20X, eller 40X forstørrelse. Hvis det er nødvendig, forbedre bildet med programvare som autokorrektur (i Microsoft Office Picture Manager) som tidligere beskrevet 22. Bildene må være tatt i jpeg format for å tillate dem å bli re-importert til automatisert valgprogrammet.
Tre. Algoritme Analyse av bilde
- Transfer tatt bilder fra microdissection instrument til SIVQ mappen. Installer og åpne ArcturusXT, autoscan og SIVQ programvarepakker på datamaskinen som er koblet til disseksjon instrument. For tilgang til SIVQ programvare, ta kontakt med Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Åpen SIVQ og laste tatt bilde (jpeg) av interesse. </ Li>
- Naviger til området av interesse og / eller justere størrelsen på utstillingsvinduene (view 5 & 6). I SIVQ programvare, View 5 viser pre-prosessering bilde og View 6 viser etterbehandling image 16.
- Velge størrelsen på ring vektor og antall ring som skal benyttes.
- Velg predikatet bildefunksjonen til å bli tatt til fange ved å høyreklikke på den i View seks.
- Klikk på "scan" for å analysere bildet.
- Juster den statistiske sannsynligheten for bildetilpasning ved hjelp av de to skyve barer. Den øvre bar justerer den totale vektor spesifisitet, og brukes til å ekskludere området fra første MR (med sensitivitet som er definert av den valgte "Stat" variable) som kan medføre overdreven inkludert området. Omvendt, er det nedre glideren benyttes for å øke følsomheten etter et scan utføres, med den hensikt å øke området som er klassifisert som et treff. Begge disse skyvekontrollene UTILize «Stat" variable som den innledende baseline sensitivitetsterskelen.
- For å lagre bildet, klikk "lagre som jpeg" (bildet er nå lagret i c :/ vq_test mappe / bilder).
- Analysere bildet med algoritmen. Utgangen fra algoritmen analysen må resultere i en annotert bilde for at det skal bli brukt i SIVQ-LCM. I dag er den gjeldende versjonen av SIVQ kjernemotoren er i beta-versjon testing med en forventning om at full produksjon versjon (tilgjengelig Q1 2014) vil innlemme en full software development kit (SDK) og programmeringsgrensesnitt (API) for forenklet integrasjon av brukergenererte romlige filtre og nedstrøms arbeidsflyt databehandlings trinn med kjernen ring matchende motor. Dette SDK vil bli distribuert med et komplett sett av dokumentasjon.
- Kontroller at SIVQ heatmap er endret til en ensartet rød farge.
- Eksportere bildet. Det er viktig å re-legge inn posisjonskoordinater i post-analyse jpeg bilde ved hjelp av en HEX-editor for å lime inn i filen heading fra den opprinnelige disseksjon instrument bildet. De aktuelle data kan finnes mellom "Start av Image" markør (0xFF, 0xD8) og den første "Define Quantization Table" markør (0xFF, 0xDB).
4. Microdissection
- Plasser LCM cap i sentrum av regionen av interesse, der bildene ble tatt for SIVQ analyse.
- Kalibrere og kvalitetskontroll (QC) UV / IR lasere og optimalisere parametrene, inkludert strøm, varighet, laser steder, og UV skjærehastighet (som anbefalt av produsenten). Utfør disse kalibreringer før re-importere analysert bildet.
- Åpen AutoScanXT (automatisert utvalg programvare) og importere den analyserte bildet fra c :/ vq_test mappe / pics.
- Tren den automatiserte utvalg programvare for å gjenkjenne SIVQ merknader og skape kartet disseksjon.
- Slik lager du en opplæringning fil, velge fire regioner av interesse (merket med "blå sirkler") på "rød maling" av SIVQ analysert bildet.
- Velg bakgrunnsområder (merket med "røde firkanter") som ikke er til å bli dissekert.
- Klikk på "Analyze"-knappen for å generere trening fil, som kan lagres for senere bruk.
- Utfør microdissection med riktig infrarøde (IR) og / eller ultrafiolett (UV) lasere.
- Kopier de merkede områdene på "live" bilde.
- I "microdissect" verktøykasse, velger du den aktuelle IR-fangst eller UV kutte knapper.
- Etter disseksjon er fullført, flytter du LCM cap til QC stasjonen og ta et bilde av de dissekerte vev / celler. En annen tilnærming er å plassere hetten på et tomt område i lysbildet før du flytter den til QC stasjonen, gir dette brukeren for å ta bilder på forskjellige forstørrelser.
- Ta et bilde av vevet område av interesse i det mikrodisseksjon å vurdere løfte effektiviteten ytterligere.
- Hvis de ønskede celler har blitt dissekert vellykket, klikker du på "nåværende stadium"-knappen i ArcturusXT programvare og fjern LCM cap å initiere den molekylære utvinning prosedyre for genetisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En FFPE menneskelig brystvev delen ble immunostained for cytokeratin AE1/AE3 ved hjelp av en standard IHC protokoll 23. Etter farging ble vevet glide plassert på ArcturusXT scenen og SIVQ-LCM-protokollen ble initiert som beskrevet ovenfor. Ettersom vevet ikke kan coverslipped for mikrodisseksjon, kan IHC + fargede celler er vanskelig å skjelne visuelt (figur 1A). Derfor, for å gi bedre indekstilpasning og en forbedret bilde, ble xylen tilsatt til vev-delen for å skape et pseudo-dekkglass 15 (figur 1B). Et JPEG-bilde ble deretter tatt av pseudo-coverslipped området og importert til SIVQ for algoritmen analyse. Et predikat bildefunksjon (mørk brun DAB flekken) valgt av brukeren initiert SIVQ algoritme for å analysere bildet (figur 1C). Den SIVQ heatmap ble deretter omgjort til en "rød maling" som er anerkjent av den automatiserte utvalg programvare (Figur 1D). De xylener fikk lov til å fordampe og SIVQ heatmap ble importert til den automatiserte utvalg programvare (figur 1E) og de markerte cellene ble dissekert med IR-laser. LCM cap ble deretter flyttet til QC stasjon på ArcturusXT instrument og kontrolleres visuelt for å vurdere disseksjon effektivitet (figur 1F). Den gjenværende vev ble også inspisert (figur 1G) og SIVQ heatmap ble gjeninnføres for å vurdere microdissection effektivitet (figur 1H) videre.
Figur 1. SIVQ-LCM av IHC farget FFPE brystvev. A) Uncoverslipped bilde av cytokeratin AE1/AE3 farget FFPE brystvev. B) Xylener røket (pseudo-coverslipped) bilde av panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en protokoll for anvendelse av SIVQ-LCM å microdissect immunfargete epitelceller fra FFPE menneskelig brystvev. Bruken av en bildeanalyse-algoritmen, slik som SIVQ, reduserer mengden av praktisk nødvendige tid for mikrodisseksjon prosessen. Dette er en potensielt viktig fremskritt i feltet siden operatøren tid og anstrengelse er typisk det hastighetsbegrensende trinnet for nøyaktig disseksjon av celler av interesse. I den foreliggende protokoll, vi spesielt tilpasset for vår fremgangsmåte til ArcturusXT instrument, selv om det trolig vil være mulig å tilpasse SIVQ og andre algoritmer til andre kommersielt tilgjengelige mikrodisseksjon instrumenter også. I tillegg til å forbedre effektivitet, kan denne nye tilnærmingen tillate brukere som er ikke-histopatologi eksperter for å utføre microdissection. Til slutt, kan bruk av en algoritme for å drive microdissection prosessen muliggjøre økt reproduserbarhet fra site-til-site ved å fjerne bruker subjektivitet i å identifisere celler o f interesse.
Mens SIVQ oppviser bred tilpasning til flere klasser av bildegjenstanden, inkludert histologi, er det viktig å erkjenne at det ikke er ment å tjene som en universell bildeprosessering / segmentering verktøyet, men snarere som en høyeffektiv first-pass forgrunnen valg verktøyet. Brukes i denne kapasiteten, har det høy nytte for å forutsi hvorvidt en bestemt klasse av bilder emnet er egnet for numeriske segmentering tilnærminger. Når SIVQ er vellykket, er det høy prediktiv kraft som enten: a) en mer raffinert og målrettet bildeanalyse / segmentering tilnærming vil være svært vellykket, og / eller b) en optimalisert, maskin-valgt SIVQ vektor vil være effektive i å gjengi et klinisk- arbeidsflyt-klar løsning. I begge omstendighet, bruk av SIVQ fungerer som et effektivt triaging verktøy for å identifisere billed fagstoffet som utgjør beregnings medgjørlig løsninger i form av forgrunnen segmentability.
ntent "> Mens vi tidligere beskrevet bruk av SIVQ-LCM-protokoll for mRNA ekspresjon microarray eksperimenter 15 mener vi at protokollen er anvendelig for de fleste nedstrøms molekylære assays, og kan være spesielt nyttig for molekylære analyser som krever et stort antall celler, slik som proteomforskning. For disse studiene, store mengder celler må anskaffes på grunn av den manglende evne til å forsterke proteiner. Videre bruk av nyere teknologier, slik som Neste generasjon Sekvense (NGS), understreker behovet for til å begynne med som ren av en prøve som mulig. Muligheten for SIVQ-LCM å isolere celler via både morfologiske funksjoner og / eller flekker kvaliteter kan gjøre det mulig muligheten til å lettere isolere rene cellepopulasjoner.Det er avgjørende å ha skikkelig forberedt vev for reproduserbare resultater for både SIVQ analyse og microdissection. For optimale forhold for LCM er det best å utføre dissekerer i en lav luftfuktighet rom og vedlikeholde riktig dehydrated vev. I tillegg sørge for at farging av vevet er reproduserbar. Til slutt, er avgjørende for å lykkes SIVQ-LCM kjennskap til disseksjon instrument.
Den SIVQ-LCM protokoll som presenteres her er de første skrittene mot semi-automatisert microdissection, noe som kan ha anvendelser i fremtiden klinisk testing siden dagens disseksjon metoder er ikke lett stand til å håndtere store arbeidsmengder. Oppsummert mener vi at SIVQ-LCM er et nytt steg inn i feltet av automatiserte microdissection og gir et utgangspunkt for etterforskere og algoritmen utviklere kan ytterligere forbedre teknologien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michael R. Emmert-Buck er en oppfinner på NIH holdte patenter som dekker laser capture microdissection og mottar royalty-basert betaling gjennom NIH Technology Transfer Program.
Acknowledgments
Studien ble støttet i en del av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al.
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
