Summary
SIVQ-LCM é uma abordagem inovadora que utiliza um algoritmo de computador, espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ), para conduzir o processo a laser microdissection captura (LCM). O fluxo de trabalho SIVQ-LCM melhora a velocidade e precisão da microdissecção, com aplicações tanto na pesquisa e na clínica.
Abstract
SIVQ-LCM é uma nova metodologia que automatiza e simplifica o, o processo de dissecação de laser mais tradicional dependente do usuário. O objetivo é criar uma, rapidamente personalizável tecnologia laser avançada plataforma de dissecção. Neste relatório, nós descrevemos a integração do software de análise de imagem e espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ) sobre o instrumento ArcturusXT. O sistema contém um ArcturusXT infravermelho (IV) e ultravioleta (UV) de laser, permitindo celular específico ou grandes dissecações da área. O objetivo principal é melhorar a velocidade, precisão e reprodutibilidade da dissecção de laser para aumentar a produtividade de amostras. Esta nova abordagem facilita microdissection de animais e tecidos humanos em investigação e fluxos de trabalho clínicos.
Introduction
Originalmente desenvolvido em meados dos anos 1990, a captura a laser microdissecção (LCM), permite ao usuário capturar com precisão células específicas ou regiões celulares de uma secção de tecido histológico via visualização microscópica 1, 2. Muitos estudos comparando a análise molecular de LCM contra arranhões tecido ilustrar o valor do método 3-12. Além disso, há três publicações de protocolo de vídeo sobre a tecnologia que está disponível para visualização 13, 14. No entanto, apesar de seu valor comprovado, LCM pode ser tedioso e trabalhoso quando o alvo de interesse é uma população de células dispersas em uma seção de tecido heterogêneo, ou quando um grande número de células são necessárias para aplicações a jusante específicas, como a proteômica. A carga colocada sobre o operador humano nos levou a desenvolver uma abordagem dissecação semi-automatizado para LCM pela combinação de um algoritmo de análise de imagem poderosa para orientar o processo LCM 15.
<p class = "jove_content"> Em colaboração com a Universidade de Michigan, nosso laboratório no NIH estendeu o previamente desenvolvido e relatado espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) algoritmo de forma a permitir que ele semi-automatizar o processo de seleção de tecido intrínseco à guiados microdissection, tornando assim disponível uma ferramenta com o patologista ou cientista vida em mente. Espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) é um algoritmo que permite que o usuário simplesmente "clicar" sobre uma característica histológica de interesse para criar um vetor de toque (recurso de imagem predicado) que pode ser usado para procurar toda a imagem histológica, o ajuste do limiar estatístico conforme necessário 16-21. O mapa de calor resultante exibe a qualidade de jogos para o recurso inicial imagem predicado e é posteriormente convertido em uma única cor (vermelho) mapa anotação que pode ser importado para o instrumento LCM. O software de seleção automatizada, AutoScanXT, é então usada para desenhar um mapa com basena anotação do SIVQ guiar a captura das células alvo da amostra de tecido. O protocolo detalhado abaixo descreve a implementação de SIVQ no fluxo de trabalho microdissection.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo descrito foi utilizado em conformidade com as normas do NIH sobre a utilização de amostras de tecidos humanos.
1. Preparação de Tecidos
- Antes do início, obter amostras de tecidos humanos de acordo com a Institutional Review Board (IRB) protocolos.
- Escolha o tipo de bloco de tecido / célula e correspondente método de processamento [fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE), congelados ou fixo-etanol (EFPE) incluído em parafina]. Fixação formalina fornece histologia ideal, com fixação de etanol e flash congelado. No entanto, métodos de transformação e de fixação do tecido podem afectar o ADN, ARN, e a quantidade de proteína e de qualidade para análise molecular e a jusante devem ser considerados.
- Corte as seções do bloco de tecido / célula para o tipo de slide (vidro, vidro da membrana, ou membrana estrutura de metal) de escolha. Análise SIVQ funciona igualmente bem em todos os três tipos de slides. Por favor, note que o método pseudo-lamela (descrito abaixo) com xilenos e Ethanol não pode ser realizado nas lâminas de membrana de armação de metal uma vez que a lâmina tem de ser invertida no palco.
- Selecione uma mancha tecido química ou com base em IHC para identificar as células de interesse do fundo. Note-se que os métodos de coloração pode também afectar o ADN, ARN, e qualidade e quantidade de tecido de proteína. Teste o tecido após coloração para avaliar a qualidade da linha de base de biomoléculas, antes de prosseguir com o protocolo. SIVQ-LCM foi realizada em lâminas de tecido / citologia coradas com: imuno-histoquímica (IHQ) com DAB 15, imunofluorescência, vermelho rápido, de novo vermelho, azul de toluidina e hematoxilina e eosina (H & E) (dados não publicados).
2. Specimen Imagem
- Carga desliza no palco motorizado do instrumento microdissection e lançar o software relacionado. Marque as caixas de seleção para designar as posições das lâminas carregadas e garantir que os arquivos de imagens captadas devem ser salvos no formato jpeg.
- Otimizar o imqualidade idade, ajustando o brilho eo foco da imagem na tela, usando o anel de foco manual ou através do software do instrumento de dissecação.
- Usando a caixa de ferramentas Imagem no software do instrumento de dissecação, definir o ganho de brilho da lâmpada e câmera de forma adequada. Exemplo de valores de brilho são = 60 = 220 e ganho, com o difusor.
- Concentre-se manualmente ou com o recurso de foco automático no software.
- Capturar uma imagem panorâmica miniatura do slide para fornecer um roteiro para o processo de dissecação.
- Para melhor qualidade de imagem de um slide de uncoverslipped, utilizar o difusor abaixo do condensador sobre o instrumento, ou, adicionar uma pequena quantidade (~ 30 mL) de etanol ou xilenos para melhorar o índice refratário (pseudo-lamela). Ao utilizar xilenos, estar ciente de que eles são deve ser utilizado medidas de segurança adequadas e tóxicas, incluindo o uso de um exaustor e jaleco de proteção, óculos de proteção dos olhos, e luvas.
- NÃO coloque a tampa da LCM no slide até a solução de etanol ou xilenos foi completamente limpo ou o polímero na tampa será distorcida.
- Navegue o slide e capturar imagens das áreas a serem dissecados em 10X, 20X ou 40X de ampliação. Se necessário, melhorar a imagem com software como AutoCorreção (no Microsoft Office Picture Manager), como descrito anteriormente 22. As imagens devem ser capturadas em formato jpeg, que lhes permitam ser re-importado para o software de seleção automática.
3. Algoritmo Análise da Imagem
- Transferência de imagens capturadas a partir do instrumento microdissection para a pasta SIVQ. Instalar e abrir os pacotes de software ArcturusXT, AutoScan e SIVQ no computador conectado ao instrumento de dissecação. Para ter acesso ao software SIVQ, por favor, entre em contato com o Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Abrir SIVQ e carregar a imagem capturada (jpeg) de interesse. </ Li>
- Navegar para a área de interesse e / ou ajustar o tamanho das janelas de visor de visualização (5 e 6). No software SIVQ, Viewport 5 mostra a imagem de pré-processamento e Viewport 6 mostra a imagem pós-processamento 16.
- Escolher o tamanho do vector de anel e o número de anéis de ser utilizados.
- Selecione o recurso de imagem predicado a ser capturada pelo botão direito sobre ele na Viewport 6.
- Clique em "Scan" para analisar a imagem.
- Ajustar a probabilidade estatística da imagem correspondente, utilizando as duas barras deslizantes. A barra superior ajusta a especificidade global do vetor, e é utilizado para excluir a área a partir da pesquisa inicial (com sensibilidade, tal como definido pela variável selecionado "Dados") que podem representar excessiva área incluída. Por outro lado, a barra inferior é utilizado para aumentar a sensibilidade, depois de uma análise é executada, com a intenção de aumentar a área que é classificada como sendo um jogo. Ambos os controles deslizantes utilize a variável "Dados", como o limiar de sensibilidade ao início do estudo.
- Para salvar a imagem, clique em "salvar como jpeg" (imagem agora está salvo na pasta c :/ vq_test / fotos).
- Analisar a imagem com o algoritmo. A saída do algoritmo de análise deve resultar numa imagem anotada para que possa ser utilizado em SIVQ-LCM. No momento, a versão atual do motor central SIVQ está em testes beta versão com a expectativa de que a versão de produção total (disponível Q1 2014) irá incorporar um kit de desenvolvimento de software completo (SDK) e uma interface de programação de aplicativo (API) para a integração simplificada de filtros espaciais gerados por usuários e as etapas de processamento de dados de fluxo de trabalho a jusante com o motor correspondente anel central. Este SDK será distribuído com um conjunto completo de documentação.
- Verifique se o heatmap SIVQ é alterado para uma cor vermelha uniforme.
- Exporte a imagem. É essencial para a re-inserir as coordenadas de posição do post-análise de imagem JPEG usando um editor de HEX para colar no cabeçalho do arquivo a partir da imagem instrumento dissecção originais. Os dados apropriados podem ser encontradas entre o "Início da Imagem" marcador (0xFF, 0xD8) eo primeiro "Definir Quantização Table" marcador (0xFF, 0xDB).
4. Microdissecção
- Coloque a tampa LCM no centro da região de interesse, onde as imagens foram capturadas para análise SIVQ.
- Calibrar e Controle de Qualidade (CQ) os lasers UV / IR e otimizar os parâmetros, incluindo a energia, a duração, locais de laser, e velocidade de corte UV (como recomendado pelo fabricante). Execute estas calibrações antes de voltar a importar a imagem analisada.
- Abrir AutoScanXT (software seleção automática) e importar a imagem analisada a partir de c :/ vq_test pasta / pics.
- Treinar o software de selecção automática para reconhecer a anotação SIVQ e criar o mapa de dissecação.
- Para criar um training arquivo, selecione quatro regiões de interesse (marcadas por "círculos azuis") sobre a "tinta vermelha" da imagem analisada SIVQ.
- Selecione as áreas de fundo (marcadas por "quadrados vermelhos") que não estão a ser dissecado.
- Clique no botão "Analisar" para gerar o arquivo de treinamento, que pode ser guardado para usos posteriores.
- Realizar microdissecção usando o apropriado infravermelho (IR) e / ou ultravioleta (UV) lasers.
- Copie as áreas selecionadas para a imagem "ao vivo".
- Na caixa de ferramentas "microdissect", selecione a captura IR apropriado ou botões de corte UV.
- Após a dissecção é completa, mova a tampa de LCM para a estação de QC e capturar uma imagem dos tecidos / células dissecadas. Outra abordagem é o de colocar a tampa sobre uma área vazia do slide antes de movê-lo para a estação de QC, o que permite ao usuário tirar fotos em várias ampliações.
- Capturar uma imagem da área de tecido de interesse após microdissecção para avaliar ainda mais levantando a eficiência.
- Se as células desejadas foram dissecados com êxito, clique no botão "estágio atual" no software ArcturusXT e retire a tampa LCM dar início ao processo de extração molecular para análise de downstream.
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Representative Results
A secção de tecido FFPE materno foi histoquímica para citoqueratina AE1/AE3 usando um protocolo padrão IHC 23. Após a coloração, o tecido foi colocado deslizante na fase ArcturusXT e o protocolo SIVQ-LCM foi iniciado como descrito acima. Uma vez que o tecido não pode ser lamínulas por microdissecção, as células coradas + IHC pode ser difícil de discernir visualmente (Figura 1A). Assim, para proporcionar um melhor índice correspondente e uma melhoria da imagem, xilenos foram adicionados à secção de tecido para criar um pseudo-lamela 15 (Figura 1B). Uma imagem JPEG foi então capturado da área de pseudo-lamínulas e importados para SIVQ para a análise de algoritmos. Uma característica imagem predicado (marrom escuro mancha DAB) selecionado pelo usuário iniciou o algoritmo SIVQ para analisar a imagem (Figura 1C). O heatmap SIVQ foi então convertida para uma "tinta vermelha", que é reconhecido pelo software de selecção automatizada (Figura 1D). Os xilenos foram autorizados a evaporar ea heatmap SIVQ foi importado para o software de selecção automática (Figura 1E) e as células marcadas foram dissecados com o laser infravermelho. A tampa LCM foi, então, mudou-se para a estação de QC do instrumento ArcturusXT e inspeccionados visualmente para avaliar a eficiência de dissecção (Figura 1F). O tecido restante também foi inspecionada (Figura 1G) ea heatmap SIVQ foi re-importado para avaliar a eficiência microdissecção (Figura 1H).
Figura 1. SIVQ-LCM de IHC manchado FFPE tecido mamário. A) imagem Uncoverslipped de citoqueratina AE1/AE3 manchado FFPE tecido mamário. B) imagem Xylenes revestido (pseudo-lamínulas) do painel A.
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Discussion
Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de SIVQ-LCM para microdissect células epiteliais imunoistoquímica de FFPE tecido mamário humano. O uso de um algoritmo de análise de imagem, tal como SIVQ, reduz a quantidade de mão-de tempo necessário para o processo de microdissecção. Este é um avanço potencialmente importante para o campo de tempo e uma vez que o esforço do operador é tipicamente o passo limitante da velocidade para a dissecção precisa das células de interesse. No presente protocolo, especificamente adaptado nosso procedimento para o instrumento ArcturusXT, embora ele provavelmente vai ser possível adaptar SIVQ e outros algoritmos para outros instrumentos microdissection comercialmente disponíveis também. Além de melhorar a eficiência, esta nova abordagem pode permitir que os usuários que são especialistas não-histopatologia para realizar microdissection. Finalmente, o uso de um algoritmo para orientar o processo de microdissecção pode permitir maior reprodutibilidade no site-to-site, eliminando a subjetividade do usuário em células que identificam o f interesse.
Enquanto SIVQ exibe ampla adaptabilidade a várias classes de imagem objecto, incluindo a histologia, é importante reconhecer que não se destina a servir como uma ferramenta de processamento de imagem / segmentação universal, mas sim, como uma alta eficiência de selecção de primeira passagem do primeiro plano ferramenta. Usado desta capacidade, tem grande utilidade para prever se uma determinada classe de assunto imaginário é adequado para abordagens numéricas de segmentação. Quando SIVQ for bem sucedida, há alto poder preditivo que: a) a abordagem de imagem análise / segmentação mais refinada e alvo será muito bem sucedido e / ou b) um otimizado, selecionou-máquina SIVQ vetor será eficaz na prestação de um clínico- solução de workflow-pronto. Em qualquer circunstância, o uso de SIVQ serve como uma ferramenta de triagem eficaz para identificar as imagens objecto que apresenta soluções computacionalmente tratável em termos de segmentability primeiro plano.
ntent "> Enquanto que anteriormente descrito o uso do protocolo SIVQ-LCM apenas para experiências de expressão de mRNA de microarray 15, acreditamos que o protocolo é aplicável à maior parte dos ensaios moleculares a jusante, e podem ser particularmente úteis para os ensaios moleculares que exigem um grande número de células, como proteômica. Para estes estudos, grandes quantidades de células precisam ser adquiridos, devido à incapacidade para amplificar proteínas. Além disso, o advento de novas tecnologias, como a Next-Gen Sequencing (NGS), enfatiza a necessidade de começar como puro de uma amostra quanto possível. A capacidade para SIVQ-LCM para isolar as células através de ambas as características morfológicas e / ou de qualidades de coloração pode permitir que a capacidade de isolar facilmente mais populações de células puras.É fundamental ter tecido devidamente preparado para resultados reprodutíveis, tanto para a análise SIVQ e microdissecção. Para as condições ideais para LCM é melhor para executar disseca em um quarto de baixa umidade e manter adequadamente desidrataçãodratado tecido. Além disso, assegurar que a coloração do tecido é reprodutível. Finalmente, a familiaridade com o instrumento de dissecção é essencial para o sucesso SIVQ-LCM.
O protocolo SIVQ-LCM aqui apresentado é o primeiro passo para microdissection semi-automatizado, que pode ter aplicações no futuro testes clínicos desde que os métodos de dissecação atuais não são facilmente capazes de lidar com grandes cargas de trabalho. Em resumo, acreditamos que SIVQ-LCM é uma nova incursão no campo da microdissecção automatizado e fornece um ponto de partida a partir do qual os pesquisadores e desenvolvedores de algoritmo pode melhorar ainda mais a tecnologia.
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Disclosures
Michael R. Emmert-Buck é um inventor de patentes NIH-realizadas cobrindo captura de microdissecção a laser e recebe pagamentos baseados em direitos autorais por meio do Programa de Transferência de Tecnologia NIH.
Acknowledgments
O estudo foi financiado em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al.
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
