Summary
SIVQ-НОК является инновационным подходом, который использует компьютерную алгоритм пространственно инвариантные квантования (SIVQ), для привода микродиссекции лазерного захвата (НОК) процесса. Рабочий процесс SIVQ-НОК значительно улучшает скорость и точность микродиссекции, с приложениями как в научно-исследовательских и клинических условиях.
Abstract
SIVQ-НОК является новая методология, которая автоматизирует и оптимизирует более традиционный, удобный для пользователя зависит процесс лазерного рассечение. Его целью является создание усовершенствованного быстро настраиваемый технологию лазерного рассечения платформы. В этом докладе мы описываем интеграции программного обеспечения для анализа изображений Пространственно инвариантный вектор квантования (SIVQ) на прибор ArcturusXT. Система ArcturusXT содержит как инфракрасный (ИК) и ультрафиолетовое (УФ) лазер, что позволяет конкретной ячейке или в большой площади вскрытия. Основная цель состоит в том, чтобы повысить скорость, точность и воспроизводимость лазерного рассечения, чтобы увеличить пропускную способность. Этот новый подход облегчает микродиссекции как тканях животных и человека в научных исследованиях и клинических рабочих процессов.
Introduction
Первоначально разработанная в середине 1990-х, лазерная захвата микродиссекции (НОК) позволяет пользователю точно захватить специфические клетки или клеточные регионов из раздела гистологического ткани с помощью микроскопического визуализации 1, 2. Многие исследования, сравнивающие молекулярный анализ LCM против тканей царапин проиллюстрировать значение метода 3-12. Кроме того, имеются три публикации протокола видео по технологии, которые доступны для просмотра 13, 14. Тем не менее, несмотря на его проверенной значения, НОК может быть утомительным и трудоемким, когда цель интересный дисперсной клеточной популяции в разделе гетерогенной ткани, или когда большое количество клеток, необходимых для конкретных последовательных применений, таких как протеомики. Нагрузка ложится на человека-оператора привело нас к разработке полуавтоматического подход рассечение для LCM путем объединения мощный алгоритм анализа изображений для руководства процессом LCM 15.
<р = класса "jove_content"> В сотрудничестве с Университетом штата Мичиган, наша лаборатория в NIH продлен ранее разработаны и сообщил Пространственно инвариантной векторного квантования (SIVQ) алгоритм таким образом, чтобы позволить ему полуавтомат процесс выбора тканей присущую руководствоваться микродиссекции, что делает доступной инструмент с патологоанатомом или жизни ученого в виду. Пространственно инвариант векторное квантование (SIVQ) представляет собой алгоритм, который позволяет пользователю просто "щелчок" на гистологической особенностью интерес для создания кольцевой вектор (предикат функцию изображение), который может быть использован для поиска по всему гистологическое изображение, регулируя статистический порог При необходимости 16-21. Полученный тепловая карта отображает качество матчей в исходное функции предикат изображения и затем превращают в один цвет (красный) аннотации карте, которые могут быть импортированы в LCM инструмента. Автоматизированная программа выбора, AutoScanXT, затем используется, чтобы нарисовать карту, основаннуюна аннотации SIVQ в руководстве захват клеток-мишеней из образца ткани. Подробный протокол ниже описывается реализация SIVQ в микродиссекции процесса.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанный протокол был использован в соответствии с правилами NIH по использованию образцов тканей человека.
1. Подготовка ткани
- До начала получения образцов тканей человека в соответствии с Institutional Review Board (IRB) протоколов.
- Выберите тип блока ткани / клеток и соответствующий метод обработки [формалином залитых парафином (FFPE), замороженные, или этанол-залитых парафином (EFPE)]. Формалин фиксация обеспечивает оптимальную гистологию, а затем фиксации этанола и вспышкой заморожены. Тем не менее, фиксация и тканевые методы обработки может повлиять ДНК, РНК, и количество белка и качество для последующей молекулярного анализа и должны быть рассмотрены.
- Разрежьте разделы ткани / клеток блок на типа слайд (стекло, мембрана стеклянной или металлический каркас мембраны) выбора. Анализ SIVQ одинаково хорошо работает на всех трех типов слайдов. Пожалуйста, обратите внимание, что метод псевдо-покровное (см. ниже) с ксилолы и Итанол не может быть выполнена на мембране слайдов металлического каркаса с слайд должен быть инвертирован на сцене.
- Выбор химико-или IHC основе ткани пятно идентифицировать клетки, представляющие интерес от фона. Обратите внимание, что методы окраски также может влиять на ДНК, РНК и качество белка и количество ткани. Проверьте ткани после окрашивания для оценки базового качества биомолекул прежде чем приступить к протоколу. SIVQ-НОК была выполнена на ткани / цитологических слайдов, окрашенных: иммуногистохимии (IHC) с DAB 15, иммунофлюоресценции, быстрый красной, заново красной, толуидиновым синий, и гематоксилином и эозином (H & E) (неопубликованные данные).
2. Образцы изображений
- Нагрузка скользит на моторизованной этапе микродиссекции инструмента и запустить соответствующее программное обеспечение. Установите флажки для обозначения позиции загруженных горками и обеспечить захваченного файлы изображений должны быть сохранены в формате JPEG.
- Оптимизация внутримышечнокачество, регулируя яркость и фокус изображения на экране, либо с помощью ручной фокусировки колесо или с помощью программного обеспечения вскрытия прибора возраст.
- Использование элементов изображения в программное обеспечение вскрытия прибора, установите усиление яркости лампы и камеры соответственно. Пример значения яркости = 60 и усиления = 220, с диффузором.
- Фокус либо вручную, либо с функцией автофокуса в программном обеспечении.
- Захват обзор миниатюрами изображение слайда, чтобы обеспечить дорожную карту для процесса вскрытия.
- Для оптимального качества изображения в uncoverslipped слайда, используют диффузор ниже конденсатора на инструменте, либо, добавить небольшое количество (~ 30 мкл) либо этанол или ксилолы, чтобы улучшить огнеупорного индекс (псевдо-покровное). При использовании ксилолы, знайте, что они токсичны и надлежащие меры безопасности должны быть использованы, в том числе использование вытяжной шкаф и защитной халате, глаза очки, и перчатки.
- Не устанавливайте LCM колпачок на слайде, пока этанол или ксилолы решение полностью прошло или полимер на крышке будут искажены.
- Перейдите слайд и захвата изображений из областей, которые будут расчлененных на 10X, 20X, или 40-кратном увеличении. При необходимости повысить имидж с программным обеспечением, таким как автозамены (в Microsoft Office Picture Manager), как описано выше 22. Изображения должны быть отражены в JPEG формате, чтобы дать им возможность быть повторно импортированы в автоматизированной программе подбора.
3. Алгоритм Анализ изображения
- Передача отснятых фотографий от микродиссекции инструмента в папку SIVQ. Установка и открыть программные пакеты ArcturusXT, автоматического сканирования и SIVQ на компьютере, подключенном к рассечение инструмента. Для доступа к программному обеспечению SIVQ, пожалуйста, свяжитесь с доктором Улисс Балис (ulysses@med.umich.edu).
- Открыть SIVQ и загрузить захваченное изображение (JPEG), представляющие интерес. </ Li>
- Перейдите к области интересов и / или регулировать размер витринах (окно 5 и 6). В программном обеспечении SIVQ, Viewport 5 показывает изображение предварительной обработки и Viewport 6 показано изображение 16 пост-обработки.
- Выбор размера кольцевой вектора и числа звонков, которые будут использоваться.
- Выберите функцию предикат нимаемая щелкнув правой кнопкой мыши на нем в окне просмотра 6.
- Нажмите кнопку "сканирование", чтобы проанализировать изображение.
- Отрегулируйте статистическую вероятность согласования изображений с помощью двух раздвижных бары. Верхний бар регулирует общую вектор специфичность, и используется для исключения область от первоначального сканирования (с чувствительностью, как это определено выбранной переменной "Stat"), которые могут представлять чрезмерный включенный области. Наоборот, чем меньше слайдер используется для повышения чувствительности, после проверки выполняется, с намерением увеличением площади, которая классифицируется как матч. Оба из этих элементов управления ползунок ИМПLize переменная "Stat" в качестве исходной базовой порога чувствительности.
- Чтобы сохранить изображение, нажмите "Сохранить как JPEG» (изображение теперь сохраняется в C :/ vq_test папке / фото).
- Анализ изображения с алгоритмом. Результаты анализа алгоритма должно привести к аннотированной изображения для того, чтобы использоваться в SIVQ-LCM. В настоящее время, текущая версия основного двигателя SIVQ находится в стадии бета версии испытания с ожиданием, что полное производство версия (доступны Q1 2014) будет включать комплект разработчика полный программного обеспечения (SDK) и интерфейс прикладного программирования (API) для упрощенного интеграции создаваемого пользователями пространственные фильтры и вниз по течению этапов обработки данных рабочий процесс с основной кольцо соответствующий двигатель. Этот SDK будет распространяться с полным набором документации.
- Убедитесь, что Тепловая карта SIVQ изменяется на единой красного цвета.
- Экспорт образа. Важно, чтобы повторно вставлять позиционных координат в рОст-анализ JPEG изображений с помощью редактора HEX, чтобы вставить в заголовке файла из исходного рассечение инструментов изображения. Соответствующие данные могут быть найдены между "Начало Image« маркера (0xFF, 0xD8) и первого "Определить квантования таблицу" маркера (0xFF, 0xdb).
4. Микродиссекция
- Поместите LCM колпачок в центре области, представляющей интерес, где изображения были захвачены для анализа SIVQ.
- Калибровка и контроль качества (КК) в УФ / ИК лазеры и оптимизировать параметры, в том числе мощность, длительность, лазерных местах, и скорость УФ резки (в соответствии с рекомендацией производителя). Выполняйте эти калибровки до повторного импорта анализируемого изображения.
- Открыть AutoScanXT (автоматизированное программное обеспечение выбор) и импортировать анализируемого изображения от C :/ vq_test папке / картинки.
- Поезд автоматизированное программное обеспечение выбора признать SIVQ аннотации и создать рассечение карту.
- Чтобы создать TrãiНин файл, выбрать четыре зоны интереса (отмечены "синими кругами") на "красной краской" анализируемого SIVQ изображения.
- Выберите фоновые области (отмечены «красных квадратов"), которые не должны быть расчленены.
- Нажмите на кнопку "Анализ" для создания файла обучение, которые могут быть сохранены для последующего использования.
- Выполните микродиссекции используя соответствующий Инфракрасный (ИК) и / или ультрафиолетового (УФ) лазеры.
- Копирование выделенных областей на «живом» изображении.
- В «microdissect" инструментария, выберите соответствующий захват ИК или кнопки УФ резания.
- После вскрытия завершена, переместить LCM крышку к QC станции а также захватить картинку из расчлененных тканей / клеток. Другой подход заключается в размещении колпачок на пустой области слайда до переместив его в QC станции, это позволяет пользователю делать снимки при различных увеличениях.
- Запись образа области ткани интереса после микродиссекции для дальнейшей оценки подъема эффективности.
- Если желаемые клетки были успешно рассеченные, нажмите на кнопку "современном этапе" в программном обеспечении ArcturusXT и снимите LCM крышку, чтобы инициировать процедуру молекулярной экстракции для последующей анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FFPE раздел человеческого ткани молочной железы была иммуноокрашиванию для Цитокератин AE1/AE3 с использованием стандартного протокола IHC 23. После окрашивания ткани слайд был сделан на этапе ArcturusXT и протокол SIVQ-НОК был инициирован, как описано выше. Поскольку ткань не может быть coverslipped для микродиссекции, то + окрашенных клеток IHC может быть трудно различить визуально (Фигура 1А). Таким образом, чтобы обеспечить лучшее согласование индекса и улучшенную изображение, ксилолы были добавлены в срезе ткани, чтобы создать псевдо-покровное 15 (фиг. 1b). JPEG изображение был захвачен псевдо-coverslipped области и импортировать в SIVQ для анализа алгоритма. Особенностью изображение предикат (темно-коричневые пятна DAB), выбранный пользователем инициируется алгоритм SIVQ проанализировать изображение (рис. 1в). SIVQ Тепловая карта была затем преобразуется в "красной краской", которая признана автоматизированной программе подбора (рис. 1D). Ксилолы были испаряется и SIVQ Тепловая карта была импортирована в автоматизированного программного обеспечения отбора (рис. 1E) и выделенные клетки были вскрыты с ИК-лазера. НОК крышка была затем переехал в QC станции прибора ArcturusXT и визуально оценить эффективность рассечение (рис. 1F). Остальные ткань также осмотрел (рис. 1G) и SIVQ Тепловая карта была вновь импортирован для дальнейшей оценки эффективности микродиссекции (Рисунок 1H).
Рисунок 1. SIVQ-НОК IHC окрашенных FFPE ткани молочной железы. А) Uncoverslipped образ цитокератина AE1/AE3 окрашенных FFPE ткани молочной железы. Б) Ксилолы покрытием (псевдо-coverslipped) образ панели А.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы приводим протокол для применения SIVQ-LCM чтобы microdissect иммуноокрашиванию эпителиальные клетки из FFPE человеческой ткани молочной железы. Использование алгоритма анализа изображений, таких как SIVQ, уменьшает количество практический времени, необходимого для процесса микродиссекции. Это потенциально важным достижением для области, так как времени и усилий оператора, как правило, лимитирующей стадией для точного рассечения клеток, представляющих интерес. В настоящем протоколе, мы специально адаптировали свою процедуру для инструмента ArcturusXT, хотя это, вероятно, можно будет адаптировать SIVQ и другие алгоритмы для других коммерчески доступных микродиссекция инструментов, а также. В дополнение к повышению эффективности, этот новый подход может позволить пользователям, которые являются экспертами, не гистопатология выполнять микродиссекции. Наконец, использование алгоритма для управления процессом микродиссекции может обеспечить большую воспроизводимость от сайт-сайте, удалив пользователя субъективность в выявлении клеток о е интерес.
В то время как SIVQ демонстрирует широкую приспособляемость к нескольким классам изображения предмета, в том числе гистологии, важно понимать, что оно не предназначено, чтобы служить в качестве универсального Image Processing / сегментации инструмента, а скорее в качестве высокоэффективного выбора первого прохода переднего плана инструмент. Используется в этом качестве, оно имеет высокую полезность для прогнозирования или нет конкретный класс снимков предмета подходит для численных подходов сегментации. Когда SIVQ успешно, существует высокая прогностическая сила, которая либо: а) более изысканным и целенаправленный подход анализа изображений / сегментация будет очень успешным, и / или б) оптимизирован, машина-выбран SIVQ вектор будет эффективным в оказании клинико- Рабочий процесс-готовое решение. В любом обстоятельстве, использование SIVQ служит в качестве эффективного инструмента сортировке выявления образность предмет которое представляет вычислительно сговорчивым решения с точки зрения переднем плане segmentability.
ntent "> В то время как мы ранее описал использование протокола SIVQ-LCM только для экспрессия мРНК микрочипов экспериментов 15, мы считаем, что протокол применим для большинства последующих молекулярных анализов, и может быть особенно полезным для молекулярных анализов, которые требуют большого количества клеток, таких как протеомики. Для этих исследований, большое количество клеток должны быть закуплены в связи с невозможностью для усиления белков. Кроме того, появление новых технологий, таких как Next-Gen Секвенирование (NGS), подчеркивает необходимость для начала, как чистая образца, как это возможно. Способность к SIVQ-LCM изолировать клетки с помощью обоих морфологических особенностей и / или окрашивания качеств может предоставить возможность более легко изолировать чистые клеточные популяции.Очень важно иметь правильно подготовленную ткань для воспроизводимых результатов как для анализа SIVQ и микродиссекции. Для оптимальных условий для LCM лучше выполнять рассекает в помещении с низкой влажностью и поддерживать должным дегидратацииdrated ткани. Кроме того, убедитесь, что окрашивание ткани воспроизводимым. Наконец, знакомство с рассечение инструмента необходимо успешного SIVQ-LCM.
Протокол SIVQ-НОК, представленные здесь, первые шаги к полу-автоматизированной микродиссекции, которые могут иметь применение в будущей деятельности клинических испытаний с современные методы рассечение не легко способен обрабатывать большие нагрузки. Таким образом, мы считаем, что SIVQ-НОК новый набег в области автоматизированного микродиссекции и является отправной точкой, с которой следователи и разработчики алгоритмов могут дальнейшего совершенствования технологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Майкл Р. Эммерт-Бак является изобретателем на NIH-состоявшихся патентов лазерного захвата микродиссекции и получает роялти, основанные на акциях в рамках Программы Transfer NIH Technology.
Acknowledgments
Исследование было частично поддержана исследовательской программы Интрамурального из Национального института здоровья, Национальный институт рака, Центр по исследованию рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al.
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
