Summary
SIVQ-LCM är en innovativ strategi som utnyttjar en datoralgoritm, Rumsligt Invariant Vektorkvantisering (SIVQ), för att driva lasern capture microdissection (LCM) process. Den SIVQ-LCM arbetsflöde förbättrar avsevärt hastigheten och noggrannheten i microdissection, med tillämpningar inom både forskning och kliniska inställningar.
Abstract
SIVQ-LCM är en ny metod som automatiserar och effektiviserar den mer traditionella, användarberoende laser dissektion process. Den syftar till att skapa ett avancerat, snabbt anpassningsbar laser dissektion plattformsteknik. I denna rapport beskriver vi integrationen av bildanalys programvara Rumsligt Invariant Vektorkvantisering (SIVQ) på ArcturusXT instrumentet. Den ArcturusXT systemet innehåller både en infraröd (IR) och ultraviolett (UV) laser, vilket möjliggör specifik cell eller med stor area dissektioner. Det huvudsakliga målet är att förbättra den hastighet, noggrannhet och reproducerbarhet hos laser dissekering för att öka provgenomströmning. Denna nya metod underlättar microdissection av både djur och mänskliga vävnader i forskning och kliniska arbetsflöden.
Introduction
Ursprungligen utvecklades i mitten av 1990-talet, laser capture microdissection (LCM) gör det möjligt för användaren att exakt fånga specifika celler eller cellulära regioner från en histologisk vävnadssnitt via mikroskopisk visualisering 1, 2. Många studier som jämför molekylär analys av LCM versus vävnads skrapar illustrerar värdet av metoden 3-12. Dessutom finns det tre videoprotokoll publikationer om den teknik som finns tillgängliga för visning 13, 14. Men trots sin beprövade värde, kan LCM vara jobbigt och tidskrävande när målet av intresse är en spridd cellpopulation i en heterogen vävnad avsnitt, eller när ett stort antal celler krävs för specifika tillämpningar nedströms såsom proteomik. Belastningen på den mänskliga operatören ledde oss att utveckla en halvautomatisk dissektion strategi för LCM genom att kombinera en kraftfull bildanalys algoritm för att styra LCM processen 15.
<p class = "jove_content"> I samarbete med University of Michigan, vårt laboratorium vid NIH förlängde tidigare utvecklat och rapporteras Rumsligt invariant vektorkvantisering (SIVQ) algoritm på ett sätt som gör det möjligt att delvis automatisera urvalet vävnadsprocessen inneboende guidad microdissection, vilket gör tillgängliga verktyg med patologen eller livsforskare i åtanke. Rumsligt invariant vektorkvantisering (SIVQ) är en algoritm som tillåter användaren att helt enkelt "klick" på en histologisk del av intresse för att skapa en ring vektor (predikat bild funktion) som kan användas för att söka i hela histologiska bilden, justera den statistiska tröskeln som behövs 16-21. Den resulterande värmekartan visar kvaliteten på matcherna till den ursprungliga predikatet bildfunktionen och därefter omvandlas till en enda färg (röd) annotering karta som kan importeras till LCM instrumentet. Den automatiserade val programvara, AutoScanXT, används sedan för att rita en karta baseradpå SIVQ s anteckning vägledande fångst av mål-celler från vävnadsprovet. Den detaljerade protokoll nedan beskriver genomförandet av SIVQ i microdissection arbetsflöde.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den beskrivna protokollet användes enligt NIH regler för användningen av vävnadsprover mänskliga.
1. Vävnadsberedning
- Före början, få humana vävnadsprover enligt Institutional Review Board (IRB) protokoll.
- Välj den typ av vävnad / cell block och motsvarande bearbetningsmetod [formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE), frysta, eller etanolfixerade paraffininbäddade (EFPE)]. Formalin fixering ger optimal histologi, följt av etanolfixering och blixt frusen. Emellertid kan fixering och vävnadsbearbetningsmetoder påverka DNA, RNA och protein kvantitet och kvalitet för nedströms molekylära analyser och bör övervägas.
- Skär blockdelar av vävnad / cell har laddats in i typ slide (glas, membranglas, eller metallram membran) i valet. SIVQ analys fungerar lika bra på alla tre bildtyper. Observera att den pseudo-täckglas-metoden (beskriven nedan) med xylener och etanol kan inte utföras på metallram membran diabilder eftersom bilden måste inverteras på scenen.
- Välj en kemisk-eller IHC-baserade vävnad fläcken för att identifiera celler av intresse från bakgrunden. Observera att färgningsmetoder kan också påverka DNA, RNA och protein kvalitet och kvantitet av vävnaden. Testa vävnaden efter färgning för att bedöma utgångs kvalitet på biomolekyler innan du fortsätter med protokollet. SIVQ-LCM har utförts på vävnaden / cytologi objektglas som färgats med: immunohistokemi (IHC) med DAB 15, immunofluorescens, snabbt rött, de novo rött, toluidinblått, och hematoxylin och eosin (H & E) (opublicerade data).
2. Prov Imaging
- Ladda glider in på den motordrivna skede av microdissection instrumentet och starta tillhörande programvara. Markera kryssrutorna för att ange positionerna för de laddade bilderna och se den tagna bildfiler ska sparas i jpeg-format.
- Optimera imålderskvaliteten genom att justera ljusstyrka och fokus av bilden på skärmen, antingen med manuell fokusering hjulet eller genom dissektion instrumentets programvara.
- Använda Bild Toolbox i dissektion instrumentets mjukvara, ställa in lampans ljusstyrka och kamera vinst på lämpligt sätt. Exempelvärden är ljusstyrkan = 60 och vinst = 220, med diffusorn.
- Fokusera manuellt eller med autofokus funktionen i programvaran.
- Fånga en miniatyröversikt bild av bilden för att ge en färdplan för dissekering processen.
- För optimal bildkvalitet på en uncoverslipped slide, utnyttja diffusorn under kondensorn på instrumentet, eller, tillsätt en liten mängd (~ 30 l) av antingen etanol eller xylener för att förbättra den eldfasta index (pseudo-täckglas). Vid användning av xylener, vara medvetna om att de är giftiga och ordentliga säkerhetsåtgärder måste användas, inklusive användning av ett dragskåp och skyddslabbrock, skyddsglasögon och handskar.
- Placera INTE LCM locket på bilden tills etanol eller xylener lösningen har helt rensat eller polymeren på locket kommer att snedvridas.
- Navigera bilden och ta bilder av de områden som ska dissekeras vid 10X, 20X eller 40X förstoring. Om det behövs, förbättra bilden med program som Autokorrigering (i Microsoft Office Picture Manager) som tidigare beskrivits 22. Bilder måste fångas i jpeg-format så att de kan återimporteras till den automatiserade datorprogram.
3. Algoritm Analys av bild
- Överföring tagna bilder från microdissection instrumentet till SIVQ mappen. Installera och öppna programvaror ArcturusXT, Autoscan och SIVQ på datorn ansluten till dissekering instrumentet. För tillgång till SIVQ programvara, kontakta Dr Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Öppna SIVQ och ladda den tagna bilden (jpeg) av intresse. </ Li>
- Navigera till intresseområde och / eller justera storleken på skyltfönstren (View 5 & 6). I SIVQ programvara, View 5 visar förbehandlings bilden och View 6 visar efterbearbetnings image 16.
- Välj storlek på ring vektor och antalet ringsignaler som ska användas.
- Välj predikatet bildfunktionen för att fångas genom att högerklicka på den i Viewport 6.
- Klicka på "scan" för att analysera bilden.
- Justera den statistiska sannolikheten för bildmatchning med användning av de två glidstänger. Den övre bar justerar den totala vektor specificiteten, och används för att undanta området från första MRI (med känslighet som definieras av den valda "Stat" variabel) som kan representera driven ingår området. Omvänt är det nedre reglaget används för att öka känsligheten, efter en genomsökning, med avsikt att öka område som är klassat som en match. Båda dessa skjutreglage tillvaLize den "Stat" variabel som det initiala utgångskänslighetströskeln.
- För att spara bilden, klicka på "spara som jpeg" (bilden är nu sparat i C :/ vq_test mapp / bilder).
- Analysera bilden med algoritmen. Utsignalen från den algoritm analys behöver resultera i en kommenterad bilder för att den kan användas i SIVQ-LCM. För närvarande är den aktuella versionen av SIVQ kärnmotorn i beta-version att testa med förväntningen att den fulla produktionsversionen (tillgängligt Q1 2014) kommer att innehålla en utveckling fullt programutvecklingspaket (SDK) och programmeringsgränssnitt (API) för förenklad integration av användargenererade rumsliga filter och nedströms arbetsflöde databehandlingssteg med kärnringen matchningsmotor. Detta SDK kommer att distribueras med en komplett uppsättning av dokumentation.
- Säkerställ att SIVQ heatmap ändras till en enhetlig röd färg.
- Exportera bilden. Det är viktigt att åter bädda positions koordinaterna i pOST-analys JPEG-bild med hjälp av en HEX editor för att klistra in i filen header från den ursprungliga dissektion instrumentbild. De lämpliga uppgifter kan hittas mellan "Start av bild" markör (0xFF, 0xD8) och den första "Definiera kvantiseringstabellen" markör (0xFF, 0xDB).
4. Microdissection
- Placera LCM locket vid centrum av det intressanta området, där de bilder fångades för SIVQ analys.
- Kalibrera och kvalitetskontroll (QC) i UV / IR-lasrar och optimera parametrarna, inklusive ström, varaktighet, laserplatser och UV skärhastighet (som rekommenderas av tillverkaren). Utför dessa kalibreringar innan du importerar den analyserade bilden.
- Öppna AutoScanXT (automatisk val programvara) och importera den analyserade bilden från c :/ vq_test mapp / bilder.
- Träna den automatiserade urvalsprogrammet att identifiera SIVQ anteckning och skapa dissekering kartan.
- För att skapa en utbildning fil väljer fyra regioner av intresse (markerade med "blå cirklar") på "röd färg" av SIVQ analyserade bilden.
- Välj bakgrundsområden (markerade med "röda rutor") som inte ska dissekeras.
- Klicka på knappen "Analyze" för att generera träningsfilen, som kan sparas för senare bruk.
- Utför mikrodissektion användning av lämplig infraröd (IR) och / eller ultraviolett (UV) laser.
- Kopiera de markerade områdena på "live" bild.
- I "microdissect" verktygslåda, välj lämplig IR fånga eller UV skär knappar.
- Efter dissektion är klar, flytta LCM locket till QC stationen och ta en bild av de dissekerade vävnaden / cellerna. Ett annat tillvägagångssätt är att placera locket på ett tomt område på bilden innan du flyttar det till QC stationen, ger detta att användaren kan ta bilder i olika förstoringsgrader.
- Ta en bild av vävnaden intresseområde efter microdissection att ytterligare bedöma lyft effektivitet.
- Om de önskade cellerna har dissekerat lyckat, klicka på "nuläget" i ArcturusXT programvaran och ta bort LCM locket för att initiera den molekylära extraktionsmetod för efterföljande analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En FFPE human bröstsektionen vävnad immunostained för cytokeratin AE1/AE3 med en vanlig IHC-protokoll 23. Efter färgning ades vävnaden glida ut på ArcturusXT steget och SIVQ-LCM-protokollet initierades såsom beskrivits ovan. Eftersom vävnaden inte kan täckglas för mikrodissektion kan IHC + färgade celler vara svåra att urskilja visuellt (Figur 1A). Således, för att ge bättre indexanpassande och en förbättrad bild, var xylener sattes till vävnadssektionen för att skapa en pseudo-täckglas 15 (Figur 1B). En JPEG-bild sedan fångas av pseudo-täck området och importeras till SIVQ för algoritmanalys. Ett predikat bildfunktionen (mörkbrun DAB-färgning) som valts av användaren initierade SIVQ algoritm för att analysera bilden (Figur 1C). Den SIVQ heatmap omvandlades sedan till en "röd färg" som är erkänd av den automatiserade val mjukvara (Figur 1D). De xylener fick avdunsta och SIVQ heatmap importerades till det automatiska valet programvara (figur 1E) och de markerade cellerna dissekerades med IR-laser. LCM mössa sedan flyttades till QC stationen i ArcturusXT instrumentet och inspekteras visuellt för att bedöma dissektion effektivitet (Figur 1F). Den återstående vävnaden också inspekteras (figur 1G) och SIVQ heatmap återimporteras för att ytterligare bedöma microdissection effektivitet (figur 1H).
Figur 1. SIVQ-LCM av IHC färgades FFPE bröstvävnad. A) Uncoverslipped bild av cytokeratin AE1/AE3 färgade FFPE bröstvävnad. B) Xylener bestruket (pseudo-täckglas) bild av panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar ett protokoll för tillämpning av SIVQ-LCM att microdissect immunostained epitelceller från FFPE human bröstvävnad. Användningen av ett bildanalysalgoritm, såsom SIVQ, minskar mängden praktisk tid som krävs för mikrodissektion processen. Detta är ett potentiellt viktigt framsteg för fältet eftersom operatören tid och ansträngning är normalt det hastighetsbegränsande steget för exakt dissekering av celler av intresse. I det nuvarande protokollet, särskilt anpassade vi vårt förfarande till ArcturusXT instrument, även om det sannolikt kommer att vara möjligt att anpassa SIVQ och andra algoritmer till andra kommersiellt tillgängliga microdissection instrument också. Förutom att förbättra effektiviteten, kan denna nya strategi att användare som är icke-histopatologi experter att utföra mikrodissektion. Slutligen kan användningen av en algoritm för att driva microdissection processen möjliggör ökad reproducerbarhet från plats-till-plats genom att ta bort användar subjektivitet i identifiera celler o f intresse.
Medan SIVQ uppvisar bred anpassningsförmåga till flera klasser av bilden ämne, inklusive histologi, är det viktigt att inse att det inte är tänkt att fungera som en universell bildbehandling / segmentering verktyg, utan snarare som en högeffektiv första passage förgrunden val verktyg. Används i denna egenskap, den har hög användbarhet för att förutsäga huruvida en viss klass av bildspråk ämnet är lämplig för numerisk segmente metoder. När SIVQ är framgångsrik, det är hög prognosförmåga som antingen: a) en mer förfinad och målinriktad bildanalys / segmentering strategi kommer att vara mycket framgångsrika och / eller b) en optimerad, maskin-valda SIVQ vektorn kommer att vara effektiva i att göra en klinisk- workflow-klar lösning. I endera omständighet, användning av SIVQ fungerar som ett effektivt triaging verktyg för att identifiera bildspråk ämne som utgör beräknings tractable lösningar i form av förgrunds segmentability.
ntent "> Medan vi tidigare beskrivit användning av SIVQ-LCM-protokollet endast för mRNA-uttryck microarray experiment 15, tror vi att protokollet är tillämpligt på de flesta nedströms molekylära analyser, och kan vara särskilt användbart för molekylära analyser som kräver ett stort antal celler, såsom proteomik. För dessa studier, stora mängder celler måste upphandlas på grund av oförmågan att förstärka proteiner. Dessutom tillkomsten av nyare teknik, såsom nästa generations sekvensering (NGS), betonas behovet av att börja med så rent av ett prov som möjligt. Möjligheten för SIVQ-LCM att isolera celler via både morfologiska egenskaper och / eller färgnings egenskaper kan göra det möjligt möjligheten att lättare isolera rena cellpopulationer.Det är viktigt att ha väl förberedda vävnad för reproducerbara resultat för både SIVQ analys och mikrodissektion. För optimala förhållanden för LCM är det bäst att utföra dissekerar i en låg fuktighet och bibehålla korrekt dehydratidrated vävnad. Dessutom, se till att färgning av vävnad är reproducerbar. Slutligen är viktigt för en framgångsrik SIVQ-LCM förtrogenhet med dissektion instrumentet.
Den SIVQ-LCM-protokoll som presenteras här är de första stegen mot halvautomatiska microdissection, som kan ha tillämpningar i framtida kliniska tester eftersom nuvarande dissektion metoder är inte lätt kan hantera stora arbetsbelastningar. Sammanfattningsvis anser vi att SIVQ-LCM är en ny razzia i området automatiserad microdissection och ger en utgångspunkt för utredare och algoritmutvecklare kan ytterligare förbättra tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michael R. Emmert-Buck är en uppfinnare på NIH-innehas patent för laser capture microdissection och erhåller royaltybaserade betalningar via NIH Technology Transfer Program.
Acknowledgments
Studien har finansierats delvis av Interna forskningsprogram av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al.
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
