Summary
SIVQ-LCM è un approccio innovativo che sfrutta un algoritmo informatico, spazialmente invarianti quantizzazione vettoriale (SIVQ), a guidare il processo di microdissezione laser (LCM). Il flusso di lavoro SIVQ-LCM migliora notevolmente la velocità e la precisione di microdissezione, con applicazioni sia nella ricerca e cliniche.
Abstract
SIVQ-LCM è una nuova metodologia che automatizza e semplifica il più tradizionale, il processo di dissezione laser user-dipendente. Esso mira a creare un avanzato, la tecnologia della piattaforma dissezione laser rapidamente personalizzabile. In questo rapporto, descriviamo l'integrazione del software di analisi dell'immagine spazialmente invarianti quantizzazione vettoriale (SIVQ) sullo strumento ArcturusXT. Il sistema ArcturusXT contiene sia un infrarossi (IR) e ultravioletti (UV) laser, consentendo cella specifica o grandi dissezioni zona. Lo scopo principale è quello di migliorare la velocità, la precisione e la riproducibilità della dissezione laser per aumentare la produttività del campione. Questo nuovo approccio facilita la microdissezione sia di tessuti umani nella ricerca e flussi di lavoro clinici e animale.
Introduction
Originariamente sviluppato a metà degli anni 1990, microdissezione laser (LCM) permette all'utente di catturare con precisione le cellule specifiche regioni o cellulari da una sezione di tessuto istologico via visualizzazione microscopica 1, 2. Molti studi confrontando analisi molecolare di LCM contro graffi tessuto illustrano il valore del metodo 3-12. In aggiunta, ci sono tre pubblicazioni protocollo video sulla tecnologia che sono disponibili per la visualizzazione 13, 14. Tuttavia, nonostante il suo valore dimostrato, LCM può essere noioso e laborioso quando il bersaglio di interesse è una popolazione cellulare dispersa in una sezione di tessuto eterogeneo, o quando un gran numero di cellule sono necessari per successivi utilizzi specifici come proteomica. L'impatto con l'operatore umano ci ha portato a sviluppare un approccio dissezione semi-automatico per LCM combinando un algoritmo di analisi di immagine potente per guidare il processo LCM 15.
<p class = "jove_content"> In collaborazione con l'Università del Michigan, il nostro laboratorio presso il NIH ha esteso il già sviluppato e riportato spazialmente invariante quantizzazione vettoriale algoritmo (SIVQ) in modo tale da consentirgli di semi-automatizzare il processo di selezione del tessuto intrinseco guidata microdissezione, rendendo così disponibile uno strumento con il patologo o scienziato vita in mente. Spazialmente invariante quantizzazione vettoriale (SIVQ) è un algoritmo che permette all'utente di semplice "click" su una caratteristica istologica di interesse per creare un vettore anello (caratteristica immagine predicato) che può essere utilizzato per verificare l'intera immagine istologica, regolando la soglia statistica se necessario 16-21. La mappa di calore risultante mostra la qualità di partite alla funzione iniziale dell'immagine predicato e viene successivamente convertito in un singolo colore (rosso) annotazione mappa che può essere importato nello strumento LCM. Il software di selezione automatica, AutoScanXT, viene poi utilizzato per disegnare una mappa basatasulla nota di SIVQ guidare la cattura delle cellule bersaglio del campione di tessuto. Il protocollo dettagliato di seguito descrive l'implementazione del SIVQ nel flusso di lavoro microdissezione.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il protocollo descritto è stato assunto alle norme NIH sull'uso di campioni di tessuto umano.
1. Tissue Preparazione
- Prima di iniziare, di ottenere campioni di tessuto umani secondo Institutional Review Board (IRB) protocolli.
- Scegliere il tipo di blocco tessuti / cellule e il corrispondente metodo di lavorazione [fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE), congelati, o etanolo-fisso incluso in paraffina (EFPE)]. Fissazione in formalina fornisce istologia ottimale, seguito da etanolo fissazione e flash congelati. Tuttavia, la fissazione e del tessuto metodi di lavorazione possono influenzare il DNA, RNA, e la quantità di proteine e di qualità per l'analisi molecolare a valle e devono essere considerati.
- Tagliare le sezioni di blocco di tessuto / cellule sul vetrino tipo (vetro, vetro membrana o membrana struttura in metallo) di scelta. Analisi SIVQ funziona altrettanto bene su tutti e tre i tipi di diapositive. Si prega di notare che il metodo pseudo-coprioggetto (descritto di seguito) con xileni e Ethanolo non può essere eseguita sui vetrini membrana struttura in metallo poiché il vetrino deve essere invertita sulla scena.
- Selezionare una macchia tessuto-chimica o basata su IHC per identificare le cellule di interesse dallo sfondo. Si noti che i metodi di colorazione possono anche influenzare DNA, RNA, e la qualità e quantità del tessuto proteina. Testare il tessuto dopo colorazione per valutare la qualità di base di biomolecole prima di procedere con il protocollo. SIVQ-LCM è stata eseguita su vetrini di tessuto / citologici colorati con: immunoistochimica (IHC) con DAB 15, immunofluorescenza, rosso veloce, de novo rosso, blu di toluidina, e ematossilina ed eosina (H & E) (dati non pubblicati).
2. Campione Imaging
- Caricare scivola sul palco motorizzato dello strumento microdissezione e lanciare il software relativo. Selezionare le caselle di controllo per indicare le posizioni dei vetrini caricati e assicurare che i file immagine catturati devono essere salvati in formato jpeg.
- Ottimizzare l'imqualità età regolando la luminosità e la messa a fuoco dell'immagine sullo schermo, utilizzando la ruota messa a fuoco manuale o tramite software dello strumento di dissezione.
- Utilizzo degli immagine nel software dello strumento dissezione, impostare la luminosità della lampada e la fotocamera guadagno adeguato. I valori di esempio sono luminosità = 60 e il guadagno = 220, con il diffusore.
- Mettere a fuoco manualmente o con la funzione autofocus nel software.
- Catturare un'immagine panoramica miniatura della diapositiva per fornire una tabella di marcia per il processo di dissezione.
- Per una qualità d'immagine ottimale di uno scivolo uncoverslipped, utilizzare il diffusore sotto il condensatore sullo strumento, o, aggiungere una piccola quantità (~ 30 ml) di etanolo o xileni a migliorare l'indice refrattario (pseudo-vetrino). Quando si utilizza xileni, essere consapevoli del fatto che sono devono essere utilizzate misure di sicurezza tossici e propri, compreso l'uso di una cappa aspirante e camice protettivo, occhiali e guanti.
- NON collocare il tappo LCM sulla diapositiva fino a quando la soluzione di etanolo o xileni ha completamente eliminato o il polimero sul tappo sarà distorta.
- Passare il vetrino e catturare le immagini delle aree da sezionati a 10X, 20X, 40X o ingrandimento. Se necessario, migliorare l'immagine con software come Correzione automatica (in Microsoft Office Picture Manager), come descritto in precedenza 22. Le immagini devono essere acquisite in formato jpeg per consentire loro di essere re-importati nel software di selezione automatica.
3. Algoritmo analisi dell'immagine
- Trasferimento immagini catturate dallo strumento microdissezione alla cartella SIVQ. Installare e aprire i pacchetti software ArcturusXT, scansione automatica e SIVQ sul computer collegato allo strumento dissezione. Per l'accesso al software SIVQ, si prega di contattare il Dott. Ulisse Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Aprire SIVQ e caricare l'immagine catturata (jpeg) di interesse. </ Li>
- Passare alla zona di interesse e / o regolare le dimensioni delle finestre di visualizzazione (viewport 5 & 6). Nel software SIVQ, Viewport 5 mostra l'immagine di pre-elaborazione e Viewport 6 mostra l'immagine post-processing 16.
- Scegliere la dimensione del vettore anello e il numero di anelli da utilizzare.
- Selezionare la funzione immagine predicato di essere catturato facendo clic destro su di esso nella Viewport 6.
- Fare clic su "scan" per analizzare l'immagine.
- Regolare la probabilità statistica di immagine abbinamento con le due barre di scorrimento. La barra superiore regola la specificità complessiva vettore, ed è utilizzato per escludere area dalla scansione iniziale (con sensibilità come definito dalla variabile selezionato "Stat") che può rappresentare eccessivo zona compresa. Al contrario, il dispositivo di scorrimento inferiore è utilizzata per aumentare la sensibilità, dopo aver eseguito una scansione, con l'intento di Superficie crescente che è classificato come una corrispondenza. Entrambi questi controlli a cursore UtiLize la variabile "Stat" come soglia iniziale sensibilità di base.
- Per salvare l'immagine, fare clic su "salva come jpeg" (immagine viene salvato in c :/ vq_test cartella / foto).
- Analizzare l'immagine con l'algoritmo. L'output dell'analisi algoritmo deve generare un'immagine commentato per poter essere utilizzato in SIVQ-LCM. Allo stato attuale, la versione attuale del motore di base SIVQ è in versione beta test con l'aspettativa che la versione di produzione completa (disponibile Q1 2014) incorporerà un kit di sviluppo software completo (SDK) e l'interfaccia di programmazione delle applicazioni (API) per l'integrazione semplificata di filtri spaziali generati dagli utenti e valle fasi di elaborazione dei dati di flusso di lavoro con il motore principale anello di corrispondenza. Questo SDK sarà distribuito con una serie completa di documentazione.
- Assicurarsi che il heatmap SIVQ viene modificato in un colore rosso uniforme.
- Esportare l'immagine. È essenziale incorporare nuovamente le coordinate posizionali nella post-analisi delle immagini jpeg utilizzando un editor HEX per incollare nell'intestazione del file dall'immagine originale strumento di dissezione. I dati appropriati possono essere trovati tra "Start dell'Immagine" marcatore (0xFF, 0xD8) e la prima "Definisci quantizzazione Table" marcatore (0xFF, 0xDB).
4. Microdissezione
- Posizionare il tappo LCM al centro della regione di interesse, in cui sono stati catturati immagini per l'analisi SIVQ.
- Calibrare e Controllo Qualità (QC) i laser UV / IR e ottimizzare i parametri, tra cui il potere, la durata, sedi laser, e la velocità di taglio UV (come consigliato dal costruttore). Eseguire queste calibrazioni prima di ri-importare l'immagine analizzata.
- Aprire AutoScanXT (software di selezione automatica) e importare l'immagine analizzata da c :/ vq_test cartella / foto.
- Addestrare il software di selezione automatica per riconoscere l'annotazione SIVQ e creare la mappa dissezione.
- Per creare un traifile di ning, selezionare quattro regioni di interesse (contrassegnate da "cerchi blu") in merito alla "vernice rossa" dell'immagine analizzata SIVQ.
- Selezionare le aree di sfondo (contrassegnate da "piazze rosse") che non devono essere sezionato.
- Fare clic sul pulsante "Analizza" per generare il file di allenamento, che può essere salvato per usi successivi.
- Eseguire microdissezione usando l'appropriato infrarossi (IR) e / o con raggi ultravioletti (UV) laser.
- Copiare le aree selezionate sulla immagine "live".
- Nella casella degli strumenti "microdissect", selezionare i pulsanti di taglio UV cattura IR appropriato o.
- Dopo la dissezione è completa, spostare il tappo LCM alla stazione di controllo di qualità e catturare un'immagine dei sezionato tessuti / cellule. Un altro approccio è quello di mettere il tappo su un'area vuota della diapositiva prima di passare alla stazione QC, questo permette all'utente di scattare foto a vari ingrandimenti.
- Acquisire un'immagine dell'area tessuto di interesse dopo microdissezione per valutare ulteriormente sollevamento efficienza.
- Se le cellule desiderati sono stati sezionati con successo, fare clic sul pulsante "fase attuale" nel software ArcturusXT e rimuovere il tappo LCM di avviare il procedimento di estrazione molecolare per l'analisi a valle.
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Representative Results
Una sezione di tessuto mammario umano FFPE è stato immunostained per citocheratina AE1/AE3 utilizzando un protocollo IHC standard 23. Dopo la colorazione, la diapositiva tessuto è stato posto sul piatto ArcturusXT e il protocollo SIVQ-LCM è stato avviato come descritto sopra. Poiché il tessuto non può essere coprioggetto per microdissezione, le cellule colorate + IHC possono essere difficili da distinguere visivamente (Figura 1A). Così, per fornire una migliore corrispondenza dell'indice migliorare l'immagine, xileni sono stati aggiunti alla sezione di tessuto per creare una pseudo-coprioggetto 15 (Figura 1B). Una immagine jpeg fu poi catturato dell'area pseudo-coprioggetto e importato in SIVQ per l'analisi algoritmo. Una caratteristica immagine predicato (DAB macchia marrone scuro) selezionato dall'utente avviato l'algoritmo SIVQ per analizzare l'immagine (Figura 1C). La heatmap SIVQ è stato poi convertito in una "vernice rossa" che viene riconosciuto dal software di selezione automatica (Figura 1D). Gli xileni sono stati autorizzati a far evaporare e il heatmap SIVQ è stato importato nel software di selezione automatica (Figura 1E) e le celle evidenziate sono stati sezionati con il laser a infrarossi. Il tappo LCM è stato poi spostato nella stazione di controllo di qualità dello strumento ArcturusXT e ispezionato visivamente per valutare l'efficienza dissezione (Figura 1F). Il tessuto rimanente è stato anche controllato (Figura 1G) e la heatmap SIVQ è stato reimportato per valutare ulteriormente l'efficienza microdissezione (Figura 1H).
Figura 1. SIVQ-LCM di IHC macchiato tessuto mammario FFPE. Immagine A) immagine Uncoverslipped della citocheratina AE1/AE3 macchiato tessuto mammario FFPE. B) Xylenes rivestito (pseudo-coprioggetto), del pannello A.
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Discussion
Vi presentiamo un protocollo per l'applicazione di SIVQ-LCM per microdissect cellule epiteliali immunostained da FFPE tessuto mammario umano. L'uso di un algoritmo di analisi di immagine, come SIVQ, riduce la quantità di hands-on tempo necessario per il processo di microdissezione. Questo è un avanzamento potenzialmente importante per il campo da tempo e fatica dell'operatore è tipicamente il fattore limitante per la dissezione precisa di cellule di interesse. Nel presente protocollo, abbiamo specificamente adattato la nostra procedura per lo strumento ArcturusXT, anche se probabilmente sarà possibile adattare SIVQ e altri algoritmi ad altri strumenti di microdissezione disponibili in commercio pure. Oltre a migliorare l'efficienza, questo nuovo approccio può consentire agli utenti che sono esperti non-istopatologia per eseguire microdissezione. Infine, l'uso di un algoritmo per guidare il processo microdissezione può consentire una maggiore riproducibilità da sito a sito rimuovendo soggettività utente in cellule identificativi o interesse f.
Mentre SIVQ presenta un'ampia adattabilità a diversi tipi di immagini materia, comprese istologia, è importante riconoscere che non è destinato a servire come strumento di manipolazione / segmentazione di immagini universale, ma piuttosto, come ad alta efficienza di selezione di primo passaggio piano strumento. Utilizzato in questa veste, è ad alta utilità per predire se una particolare classe di oggetto immaginario è adatto per gli approcci di segmentazione numerici. Quando SIVQ è successo, vi è l'alto potere predittivo che: a) un approccio di analisi delle immagini / segmentazione più raffinata e mirata sarà di grande successo e / o b) un ottimizzato, selezionati macchina SIVQ vettore sarà efficace nel rendere una clinica- soluzione di workflow-ready. In entrambe le circostanze, l'uso di SIVQ serve come uno strumento efficace per identificare triaging immaginario oggetto che pone soluzioni computazionalmente trattabili in termini di segmentability primo piano.
S copi "> Mentre precedentemente descritto l'uso del protocollo SIVQ-LCM solo per esperimenti di espressione di mRNA microarray 15, riteniamo che il protocollo è applicabile alla maggior parte dei saggi molecolari a valle, e può essere particolarmente utile per saggi molecolari che richiedono un gran numero di cellule, come la proteomica. Per questi studi, grandi quantità di celle devono essere procurato a causa della incapacità di amplificare le proteine. Inoltre, l'avvento delle tecnologie più recenti, come Next-Gen Sequencing (NGS), sottolinea la necessità di cominciare come pura di un campione come possibile. La possibilità per SIVQ-LCM per isolare cellule attraverso sia le caratteristiche morfologiche e / o qualità di colorazione potrebbe consentire la possibilità di isolare più facilmente popolazioni cellulari puri.E 'fondamentale per avere tessuto adeguatamente preparato per ottenere risultati riproducibili sia per l'analisi SIVQ e microdissezione. Per le condizioni ottimali per LCM è meglio eseguire sviscera in una stanza bassa umidità e mantenere correttamente deidrodisidratati tessuto. Inoltre, assicurarsi che la colorazione del tessuto è riproducibile. Infine, la familiarità con lo strumento di dissezione è essenziale per il successo SIVQ-LCM.
Il protocollo SIVQ-LCM qui presentato è il primo passo verso microdissezione semi-automatico, che possono avere applicazioni in futuro sperimentazione clinica in quanto i metodi di dissezione attuali non sono facilmente in grado di gestire grandi carichi di lavoro. In sintesi, riteniamo che SIVQ-LCM è una nuova incursione nel campo della microdissezione automatizzata e fornisce un punto di partenza dal quale ricercatori e sviluppatori di algoritmi in grado di migliorare ulteriormente la tecnologia.
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Disclosures
Michael R. Emmert-Buck è un inventore sui brevetti NIH-detenuti che coprono cattura microdissezione laser e riceve pagamenti basati free attraverso il Programma di trasferimento NIH Technology.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto in parte dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
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