Summary
SIVQ-LCM是一种创新的方法，运用计算机算法，空间不变的矢量量化（SIVQ），驱动激光捕获显微切割（LCM）的过程。该SIVQ-LCM流程大大提高显微切割的速度和精度，以在这两个研究和临床应用中的设置。
Abstract
SIVQ-LCM是一种新的方法，它可以自动和简化了较为传统的，依赖于用户的激光剥离过程。它的目的是建立一个先进的，快速定制的激光剥离技术平台。在这份报告中，我们描述了图像分析软件空间不变的矢量量化（SIVQ）整合到ArcturusXT仪器。该ArcturusXT系统包含一个红外（IR）和紫外（UV）激光，允许特定的细胞或大面积解剖。主要目标是提高速度，精度，激光剥离，以提高样品通量的重现性。这种新方法有利于动物和在研究和临床工作流程人体组织的显微切割。
Introduction
最初开发于90年代中期，激光捕获显微切割（LCM）使用户通过微观可视化1，2，精确捕捉从组织学组织切片特定的细胞或细胞区域。比较LCM的分子分析与组织擦伤许多研究说明了该方法3-12的值。此外，也有关于可用于观看13,14的技术3视频协议的出版物。然而，尽管它被证明价值，LCM可以是繁琐和费力的，当感兴趣的目标是一个分散的细胞群体中的异质组织切片时，或者当需要进行特定的下游应用，如蛋白质组学大量的细胞。放置在操作人员的负担，导致我们结合一个强大的图像分析算法，以指导对LCM进程15制定LCM半自动夹层的方法。
<P类=“jove_content”>在与密歇根大学合作，我们的实验室在NIH扩展先前制定和报告的空间不变的矢量量化（SIVQ）算法的方式，使其到半自动化的组织选择过程中固有的引导显微切割，从而使可用在头脑里的病理学家或生命科学家的工具。空间不变的矢量量化（SIVQ）是一种算法，允许用户简单地“点击”感兴趣的组织学特征来创建一个环载体（谓词图像特征），可以用来搜索整个组织学图像，调整阈值的统计根据需要16-21。由此产生的热图显示匹配的质量初始谓词图像特征，并随后被转换成一个单一的颜色，可以导入到LCM仪器（红色）标注地图。自动选型软件，AutoScanXT，然后用于绘制地图的基础上SIVQ的注解引导从组织样品中的靶细胞的捕获。下面详细的协议描述的实施SIVQ进入显微切割工作流程。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所描述的协议是采用按照关于使用人体组织样本的美国国立卫生研究院的规则。
1，组织准备
- 前年初，根据机构审查委员会（IRB）的协议得到人体组织标本。
- 选择组织/细胞块的类型和相应的处理方法[福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），冷冻，或乙醇固定，石蜡包埋（EFPE）]。福尔马林固定提供了最佳的组织学，随后用乙醇固定，并快速冷冻。然而，固定和组织处理方法可影响DNA，RNA和蛋白质的数量和质量的下游分子分析，并应予以考虑。
- 切割组织/细胞块切片上选择的滑动型（玻璃，膜玻璃，或金属框架的膜）。 SIVQ分析同样适用于所有三种类型的幻灯片。请注意，（如下所述）用二甲苯和乙伪盖玻片方法醇不能在金属框架膜幻灯片进行由于滑动，必须在舞台上被颠倒。
- 选择一个化学或免疫组织化学为基础的组织染色，以确定所关注的细胞的背景。需要注意的是染色方法也可影响DNA，RNA和蛋白质的质量和组织的数量。在进行染色与协议前评估生物分子的基准质量测试后的组织中。免疫组织化学（IHC）与民建联15，免疫荧光，快红， 从头红，甲苯胺蓝，苏木精伊红（H＆E）（未发表资料）：SIVQ-LCM已对组织/细胞学载玻片沾满了被执行。
2。标本成像
- 负载滑动到显微切割工具的机动阶段，并启动相关的软件。选中相应的复选框来指定加载幻灯片的位置，并确保所拍摄的图像文件将被保存为JPEG格式。
- 优化IM通过调整图像的亮度和聚焦在屏幕上，并使用本手动对焦轮或通过解剖仪器的软件年龄质量。
- 使用解剖仪器的软件中的图像工具箱，适当地将灯泡的亮度和摄像机的增益。示例值有亮度= 60和增益= 220，与扩散器。
- 手动或使用该软件中的自动对焦功能对焦。
- 捕捉幻灯片提供一个路线图解剖过程的缩略图概览图像。
- 对于一个uncoverslipped滑动的最佳的图像质量，利用仪器上的冷凝器下方的扩散器，或者，添加乙醇或二甲苯少量（约30微升）以提高耐火指数（伪盖玻片）。当使用二甲苯，要知道他们必须用有毒的和适当的安全措施，包括使用通风橱和防护实验室外套，护目镜和手套。
- 请勿在投影片上的LCM帽，直到乙醇或二甲苯溶液中完全清除或盖上的聚合物会被扭曲。
- 导航在10X，20X，40X或放大要解剖方面的幻灯片，拍摄的图像。如果有必要，加强与软件，如自动更正（在Microsoft Office图片管理器）图像如前所述22。图像必须被捕获JPEG格式，让他们重新导入到自动选型软件。
3，算法的图像分析
- 转让从捕获显微切割仪图像到SIVQ文件夹。安装并打开ArcturusXT，自动扫描和SIVQ软件包安装到解剖仪器的电脑上。用于访问SIVQ软件，请联系尤利西斯巴里斯博士（ulysses@med.umich.edu）。
- 开SIVQ并加载所捕获的图像的兴趣（JPEG）。</ LI>
- 导航到感兴趣的区域和/或调节的显示窗口（视口5＆6）的大小。在SIVQ软件，视口5示出了预处理的图像和视口6示出了后处理的图像16。
- 选择环矢量和环要使用的数字的大小。
- 选择要通过右击视口6抓获其上的谓词图像特征。
- 点击“扫描”来分析图像。
- 采用两个滑动杆调节图像匹配的统计概率。上部杆调整整体矢量特异性，并用于从初始扫描（具有灵敏度由选定的“统计”变量的定义），以排除区域可表示包含过多的区域。相反，较低的滑块被用于增加灵敏度，之后进行的扫描，与被分类为是匹配增加面积的意图。这两个滑块控件的UTI丽泽的“统计”变量作为初始基线灵敏度阈值。
- 保存图像，点击“保存为JPEG”（图像已保存在C :/ vq_test文件夹/图片）。
- 分析与算法的图像。算法分析的输出需要产生一个带注释的图像为它在SIVQ-LCM中使用。目前，SIVQ核心引擎的当前版本是beta版测试，并期望在满负荷生产版本（2014年第一季度上市），将包括一个完整的软件开发工具包（SDK）和应用程序编程接口（API），用于简化集成用户生成的空间滤波器，并与核心环匹配引擎的下游流程的数据处理步骤。该SDK将分发了一套完整的文档。
- 确保SIVQ热图改变为均匀的红色。
- 导出图像。至关重要的是，在p重新嵌入的位置坐标通过使用一个十六进制编辑器从原来的解剖仪器的图像文件头粘贴OST分析JPEG图像。相应的数据可能会“启动图像”标记（0xFF的，为0xD8）和第一“定义量化表”标记（0xFF的，为0xDB）之间发现。
4。显微切割
- 放置在LCM盖在感兴趣的区域，其中所述图像捕获为SIVQ分析的中心。
- 校准和质量控制（QC）的紫外/红外激光器和优化参数，包括功率，持续时间，激光的位置，和UV切割速度（如制造商推荐的）。之前重新导入所分析的图像进行这些校准。
- 打开AutoScanXT（自动选型软件），并从C :/ vq_test文件夹/图片导入所分析的图像。
- 列车自动选择软件来识别SIVQ注释和创建解剖图。
- 要创建一个寨宁文件，对“红色漆”的SIVQ分析图像选择感兴趣的四个区域（标记为“蓝色圆圈”）。
- 选择的背景区域（标记为“红方块”），它们不被解剖。
- 单击“分析”按钮，生成培训文件，该文件可以保存供日后使用。
- 使用适当的红外（IR）和/或紫外（UV）激光器进行显微解剖。
- 选定区域复制到“活”的形象。
- 在“microdissect”工具箱中，选择适当的红外捕捉或UV切割按钮。
- 剥离完成后，将LCM盖到QC站和捕捉解剖组织/细胞的图像。另一种方法是把帽上之前，将其移动到QC站幻灯片的空白区域，这允许用户在拍摄照片以不同的放大倍率。
- 捕获感兴趣的组织区域的图像显微切割后，进一步评估起重效率。
- 如果所需的细胞已被成功地解剖，点击在ArcturusXT软件的“现阶段”按钮，删除该LCM帽发起的分子提取程序用于下游分析。
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Representative Results
一个FFPE人体乳腺组织切片的免疫染色用标准IHC协议23细胞角蛋白AE1/AE3。染色后，将组织切片放置在ArcturusXT阶段，如上述的SIVQ-LCM协议发起。自组织不能盖玻片为显微切割的IHC +染色的细胞可以是难以辨别视觉（ 图1A）。因此，为了提供更好的折射率匹配和改进的图像，二甲苯加入到该组织部分来创建一个伪盖玻片15（ 图1B）。 JPEG图像，然后拍摄的伪盖片面积并导入到SIVQ的算法分析。由用户选择谓词图像特征（深褐色DAB显色）发起SIVQ算法来分析图像（ 图1C）。那么SIVQ热图转化为一个“红色漆”是由自动选择软件（ 图1认可D）。二甲苯被允许蒸发和SIVQ热图被导入到自动选型软件（ 图1E），并突出显示单元格进行解剖与红外激光。然后，LCM帽被移到了ArcturusXT仪器的质控站和目视检查，以评估清扫效率（ 图1F）。其余的组织也被检查（ 图1G）和SIVQ热图被重新进口，以进一步评估其显微切割效率（ 图1H）。
免疫组化图1。SIVQ-LCM染色FFPE乳腺组织。面板A. 的）细胞角蛋白AE1/AE3的Uncoverslipped形象染色FFPE乳腺组织B）二甲苯涂层（伪盖玻片）图像
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Discussion
我们提出了一个协议，用于SIVQ-LCM的应用，以microdissect从FFPE人体乳腺组织免疫染色上皮细胞。使用图像分析算法，如SIVQ，降低了实际操作所需的显微切割过程的时间的量。这对于该领域的潜在的重要进步，因为操作者的时间和精力，通常为所关注的细胞的精确解剖中的限速步骤。在本协议中，我们特别适合我们的程序到ArcturusXT仪器，虽然它很可能将有可能适应SIVQ等算法其他市售的显微仪器，以及。除了提高效率，这种新的方法可以允许用户谁非病理专家进行显微解剖。最后，使用算法来驱动显微切割过程中可以通过识别细胞中移除使用者的主观性实现更高的可重复性从站点到站点Ø f兴趣。
虽然SIVQ表现出广泛的适应性，多个类像题材，包括组织学类型，它认识到，它不打算作为一个通用的图像处理/分割工具是很重要的，而是作为一个高效率的第一通前景选择工具。用在这方面的能力，具有较高的实用程序，用于预测一个特定的类意象题材是否适合数值分割方法。当SIVQ是成功的，有高的预测能力，要么：1）更精致和有针对性的图像分析/分割方法将是非常成功的和/或b）优化，机器选择SIVQ载体将有效地渲染临床工作流程就绪解决方案。在任一情况下，使用SIVQ的作为一种有效的会审工具来识别的图像题材，会对计算上易处理的解决方案中的前景segmentability方面。
ntent“>虽然我们前面介绍的使用SIVQ-LCM协议仅适用于mRNA表达微阵列实验15，我们认为该协议是适用于最下游分子检测，并且可以用于需要大量的细胞分子检测特别有用，如蛋白质组学。在这些研究中，需要大量的细胞由于无法放大蛋白质进行采购。此外，较新的技术，如新一代测序（NGS）的问世，强调需要首先为纯的样品尽可能。同时通过形态特征和/或染色的质量来分离细胞的能力为SIVQ-LCM可以使能够更容易地分离出纯的细胞群的能力。关键是要具有为可再现的结果为两者SIVQ分析和显微切割适当制备的组织。用于LCM的最佳条件，最好是在低湿度房间进行剖析，并保持适当的脱氢drated组织。此外，确保了组织的染色重现性。最后，熟悉解剖仪器是必不可少的成功SIVQ-LCM。
这里提出的SIVQ-LCM协议是朝着半自动化显微切割，可以具有在未来的临床试验的应用，因为电流解剖方法不容易能够处理大负荷的第一个步骤。综上所述，我们认为，SIVQ-LCM是一个新的进军自动化显微切割领域，提供了一个起点，调查人员和算法开发人员能够进一步提高技术。
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Disclosures
迈克尔·埃默特 - 巴克是美国国立卫生研究院持有的专利，涵盖激光捕获显微切割技术的发明者，并通过美国国家卫生研究院技术转让项目获得特许权为基础的支付。
Acknowledgments
这项研究是由美国国家癌症研究所癌症研究中心院内研究计划美国国立卫生研究院，部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
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