Summary
SIVQ-LCMは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のプロセスを駆動するために、コンピュータアルゴリズム、空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）を活かした革新的なアプローチである。 SIVQ-LCMのワークフローを大幅に研究と臨床現場の両方でアプリケーションと、マイクロダイセクションの速度と精度を向上させます。
Abstract
SIVQ-LCMは、より伝統的な、ユーザ依存レーザー解剖プロセスを自動化し、合理化する新たな方法論である。それは、高度な、急速にカスタマイズ可能なレーザー解剖プラットフォーム技術の創出を目指しています。本稿では、ArcturusXT機器に画像解析ソフトウエア空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）の統合について説明します。 ArcturusXTシステムは、特定の細胞や大面積の解剖を可能に赤外線（IR）、紫外線（UV）レーザーの両方が含まれています。主要な目標は、速度、精度、およびサンプルスループットを向上させるレーザー解剖の再現性を改善することである。この新しいアプローチは、研究と臨床のワークフローで動物およびヒト組織の両方のマイクロダイセクションを容易にします。
Introduction
もともと、1990年代半ばに開発されたレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、正確に微小な可視化1、2を介して組織学的組織切片から特定 の細胞または細胞領域をキャプチャすることを可能にする。組織の擦り傷に対してLCMの分子分析を比較する多くの研究は、方法3-12の値を示している。また、13、14を表示するために利用可能な技術の3つのビデオプロトコルの出版物があります。関心対象の標的が不均一組織切片中の分散細胞集団である場合、又は多数の細胞は、例えばプロテオミクスのような特定のダウンストリームアプリケーションに必要とされるときが、その実証された値にもかかわらず、LCMは、退屈で面倒であることができる。人間のオペレータの負担は、LCMプロセス15をガイドするために強力な画像解析アルゴリズムを組み合わせることで、LCMのための半自動化された解剖的なアプローチを開発するために私たちを導いた。
<ミシガン大学と共同で、Pクラスは= "jove_content">、NIHの研究室では、拡張され、以前に開発され、固有の組織選択プロセスを半自動化することを可能にするための方法で空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）アルゴリズムを報告したこのように念頭に置いて、病理学者や生命科学者で利用可能なツールとなり、マイクロダイセクションを導いた。空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）は、ユーザーが単純に統計的閾値の調整、全体の組織学的画像を検索するために使用することができ、リングベクトル（述語画像特徴）を作成し、目的の組織学的な特徴を「クリック」することを可能にするアルゴリズムです16〜21を必要に応じて実行します。得られた熱マップは初期述語画像特徴との一致の品質を表示し、その後に、LCM機器にインポートすることができ、単一の色（赤）の注釈マップに変換されます。自動化された選択ソフトウェア、AutoScanXTは、次に基づいてマップを描画するために使用されるSIVQの注釈に組織サンプルからの標的細胞の捕捉を案内する。以下の詳細なプロトコルは、マイクロダイセクションワークフローにSIVQの実装について説明します。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
記載されたプロトコルは、ヒト組織試料の使用に関するNIHルールに従って使用した。
1。組織標本
- 開始する前に、治験審査委員会（IRB）のプロトコルに従って、ヒト組織標本を得る。
- 組織/セルブロックとそれに対応する処理方法[ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）、冷凍、またはエタノール固定パラフィン包埋（EFPE）]の種類を選択します。ホルマリン固定はエタノール固定および急速冷凍した後、最適な組織像を提供しています。しかしながら、固定および組織処理方法は、下流の分子分析のためにDNA、RNA、およびタンパク質の量と質に影響を与えることができると考えるべきである。
- 選択したスライド型（ガラス、膜、ガラス、または金属フレーム膜）上に組織/細胞ブロック切片を切った。 SIVQ分析は、すべての3のスライド型に対しても同様に動作します。ご注意ください擬似カバースリップ法キシレンとイーサンに（後述）スライドステージ上で反転されなければならないのでオールメタルフレームメンブレンスライド上で行うことができない。
- 背景から目的の細胞を識別するために、化学またはIHCベースの組織染色を選択します。その染色方法はまた、DNA、RNA、および蛋白質および組織の量に影響を与えることができます。プロトコルを実行する前に、生体分子のベースラインの質を評価するために染色した後、組織をテストします。 DAB 15、免疫蛍光で免疫組織化学（IHC）、ファストレッド、 デノボレッド、トルイジンブルー、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）（未発表データ）：SIVQ-LCMを用いて染色した組織/細胞診スライド上で行われた。
2。試料イメージング
- 負荷は顕微解剖機器の電動ステージ上にスライドさせると関連するソフトウェアを起動します。ロードされたスライドの位置を指定し、撮影された画像ファイルはJPEG形式で保存されるべきであることを確認するためのチェックボックスをオンにします。
- IMを最適化年齢マニュアルフォーカスホイールまたは切開具のソフトウェアを介してのいずれかを用いて、画面上の画像の明るさ、焦点を調整することにより品質。
- 解剖器のソフトウェア内の画像のツールボックスを使用して、適切にランプの明るさやカメラのゲインを設定します。値の例は、ディフューザと、明るさ= 60とゲイン= 220である。
- 手動で、またはソフトウェアでのオートフォーカス機能でピント合わせ。
- 解剖プロセスのためのロードマップを提供するために、スライドのサムネイルの概要イメージをキャプチャします。
- uncoverslippedスライドの最適な画像品質を得るには、測定器、凝縮器下のディフューザーを使用する、または、耐火インデックス（擬似カバースリップ）を向上させるために、エタノールまたはキシレンのどちらかを少量（〜30μl）を加える。キシレンを使用する場合は、換気フード、保護白衣、アイゴーグル、手袋の使用を含め、これらは有毒で、適切な安全対策を使用しなければならないしていることに注意してください。
- エタノールまたはキシレン溶液が完全にクリアされたか、キャップ上のポリマーが歪みますまで、スライド上のLCMキャップを置かないでください。
- スライドを移動して、10X、20X、40Xまたは倍率で解剖されるべき領域の画像をキャプチャします。必要に応じて、以前に22を説明したように（マイクロソフトオフィスピクチャーマネージャーで）などの自動修正などのソフトウェアを使用してイメージを高める。画像は、彼らが自動化された選定ソフトに再インポートできるようにJPEG形式でキャプチャする必要があります。
画像の3。アルゴリズムの解析
- 転送はSIVQフォルダに顕微解剖機器からの映像を捕獲した。解剖器に接続されたコンピュータ上でArcturusXT、オートスキャンとSIVQソフトウェアパッケージをインストールして開きます。 SIVQソフトウェアへのアクセスのために、博士はユリシーズバリス（ulysses@med.umich.edu）までお問い合わせください。
- オープンSIVQ、目的の撮影した画像（JPEG）をロードします。</李>
- 関心のある領域に移動し、/または表示窓（ビューポート5および6）のサイズを調整します。 SIVQソフトウェアでは、ビューポート5は、前処理画像を示すとビューポート6は、後処理画像16を示している。
- リングベクトルと、使用するリングの数のサイズを選択します。
- ビューポート6でそれを右クリックしてキャプチャされる述語画像特徴を選択します。
- 画像を分析する「スキャン」をクリックしてください。
- 2つのスライドバーを利用した画像マッチングの統計的確率を調整します。上部のバーには、全体のベクトル特異性を調整し、（選択された「統計」変数で定義されている感度の）過度含ま面積を表すことができ、初期スキャンから地域を除外するために使用されている。逆に、下側スライダーは、スキャンが実行された後に試合であると分類された領域の増大を意図して、感度を高めるために利用される。これらのスライダコントロールの両方がUTI初期ベースライン感度閾値としてリゼ "統計"変数。
- 画像を保存するには、（画像は現在C :/ vq_testフォルダ/写真に保存されている）「JPEGとして保存」をクリックしてください。
- アルゴリズムを用いて画像を分析します。アルゴリズム解析の出力はSIVQ-LCMに使用されるための注釈画像をもたらす必要がある。現在、SIVQコアエンジンの現在のバージョンは、フル生産バージョン（利用可能Q1 2014）の単純化された統合のための完全なソフトウェア開発キット（SDK）、アプリケーション·プログラミング·インターフェース（API）を組み込むことを見込んでベータ版テスト中ユーザが生成した空間フィルタと、コアリングマッチングエンジン下流ワークフローデータ処理ステップ。このSDKには、ドキュメントの完全なセットと一緒に配布されます。
- SIVQヒートマップを均一赤色に変化していることを確認します。
- 画像をエクスポートします。これは、Pに位置座標を再埋め込むことが不可欠であるオリジナルの解剖計器イメージからファイルヘッダに貼り付けることが進エディタを使用して、OST分析JPEG画像。適切なデータ」は、画像の開始」マーカー（0xFFの、0xD8）と第「量子化テーブルを定義する「マーカー（0xFFの、0xDB）との間で見つけることができる。
4。マイクロダイセクション
- 画像はSIVQ解析のために捕獲された関心領域の中心にLCMキャップを置きます。
- キャリブレーションと品質管理（QC）、UV / IRレーザーとパワー、継続時間、レーザーの位置、および（メーカーが推奨するように）、UVカット速度を含むパラメータを最適化します。解析された画像を再インポートする前に、これらのキャリブレーションを実行します。
- オープンAutoScanXT（自動化された選択ソフトウェア）およびc :/ vq_testフォルダ/写真から解析された画像をインポートします。
- SIVQ注釈を認識し、解剖マップを作成するための自動化された選択ソフトウェアを訓練。
- TRAIを作成するには寧ファイル、SIVQ解析された画像の「赤ペンキ」に（「青い円」でマーク）は、対象の4領域を選択する。
- 解剖されるべきではなく、（「赤い四角」でマーク）背景領域を選択します。
- その後の使用のために保存することができ、トレーニングファイルを生成するために、「分析」ボタンをクリックしてください。
- 適切な赤外線（IR）および/または紫外線（UV）レーザを使用したマイクロダイセクションを行う。
- 「ライブ」画像に、選択した領域をコピーします。
- 「顕微解剖」ツールボックスで、適切なIRキャプチャやUVカットのボタンを選択します。
- 切開が完了した後、QC局にLCMキャップを移動させ、解剖した組織/細胞の画像を取り込む。別のアプローチは、これは、ユーザが様々な倍率で撮影することができ、従来QCステーションに移動するスライドの空白領域上にキャップを配置することである。
- 効率をさらに引き上げる評価するためにマイクロダイセクション後に、関心のある組織領域の画像をキャプチャします。
- 所望の細胞が正常に解剖されている場合は、下流の分析のための分子の抽出手順を開始するArcturusXTソフトウェアで「現段階」ボタンをクリックし、LCMキャップを取り外します。
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Representative Results
FFPEヒト乳房組織切片は、標準的なIHCプロトコール23を用いてサイトケラチンAE1/AE3に対して免疫染色した。染色後、組織スライドはArcturusXTステージ上に置き、上記のようにSIVQ-LCMプロトコルが開始した。組織顕微解剖のためにカバースリップすることができないので、+ IHC染色された細胞は、視覚的に（ 図1A）を識別することは困難である。これにより、より良好な屈折率整合および改善された画像を提供するために、キシレン擬似カバーガラス15（ 図1B）を作成するために組織切片に添加した。 JPEG画像は、擬似的なカバーガラス面積がキャプチャされ、アルゴリズム解析のためのSIVQにインポートされました。ユーザーが選択した述語画像特徴（ダークブラウンのDAB染色）は画像（ 図1C）を分析するためにSIVQアルゴリズムを開始した。 SIVQのヒートマップは、その後、自動化された選択ソフトウェア（ 図1によって認識されている「赤ペンキ」に変換されたD）。キシレンを蒸発させ、そしてSIVQのヒートマップを自動選定ソフト（ 図1E）にインポートされ、強調表示されたセルは、IRレーザーで切開した。 LCMキャップは次いでArcturusXT器具のQCステーションに移動し、視覚的に切開効率（ 図1F）を評価するために検査した。残りの組織も観察した（ 図1G）とSIVQのヒートマップは、さらに、マイクロダイセクション効率（ 図1H）を評価するために再インポートされました。
図1。IHCのSIVQ-LCMは、FFPE乳房組織を染色した。パネルAのA）サイトケラチンAE1/AE3のUncoverslipped画像のFFPE乳房組織を染色した。B）キシレンコーティングされた（擬似カバーガラス）の画像
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Discussion
私たちは、FFPEヒト乳房組織から免疫染色上皮細胞を顕微解剖するSIVQ-LCMの適用のためのプロトコルを提示する。例えばSIVQなどの画像解析アルゴリズムの使用は、実践的な顕微解剖処理に要する時間の量を減少させる。オペレータの時間と労力は、通常、目的の細胞の正確な解剖のための律速段階であるので、これはフィールドの潜在的に重要な進歩である。それは可能性が高いだけでなく、他の市販のマイクロダイセクションの楽器にSIVQや他のアルゴリズムを適合させることが可能になりますが、本プロトコルでは、我々は具体的には、ArcturusXT機器に私たちの手順を適応。効率を改善することに加えて、この新しいアプローチは、非組織病理学の専門家であるユーザーは、顕微解剖を行うことを可能にし得る。最後に、顕微解剖プロセスを駆動するためのアルゴリズムの使用は、細胞のOを識別する際にユーザの主観を除去することによって、サイトからのより大きな再現性を可能にすることができる Fの関心。
SIVQは組織学を含む画像の主題の複数のクラスに広い適応性を示すが、それは高効率の初回通過前景選択としてではなく、むしろ、ユニバーサル画像処理/セグメンテーションツールとして役立つことを意図するものではないことを認識することが重要であるツール。この能力において使用され、それは画像の主題の特定のクラスは、数値セグメンテーションアプローチに適しているか否かを予測するための高い有用性を有する。 A）より洗練されたターゲット画像解析/セグメンテーションのアプローチは非常に成功すると/またはb）最適化され、マシンが選択しSIVQベクトルが臨床をレンダリングするのに有効になります。SIVQが成功した場合には、いずれか高い予測力がありますワークフロー対応のソリューションを提供します。状況のいずれかで、SIVQの使用は、フォアグラウンドsegmentabilityの点で計算上扱いやすいソリューションを提起する画像の主題を識別するための効果的なトリアージツールとして機能します。
ntent ">我々は、以前は、mRNA発現マイクロアレイ実験15 SIVQ-LCMプロトコルの使用を説明したが、我々は、プロトコルが最下流の分子アッセイに適用可能であり、多数の細胞を必要とする分子アッセイに特に有用であり得ると信じて、このようなプロテオミクスなど。これらの研究のために、細胞を大量に起因するタンパク質を増幅することができないことに調達する必要があります。また、このような次世代シーケンシング（NGS）などの新しい技術の出現は、などで始まる必要性を強調している可能な限り純粋な試料の両方の形態学的特徴および/または染色の質を介して細胞を単離するSIVQ-LCMのための能力がより容易に純粋な細胞集団を単離する能力を可能にすることができる。それはSIVQ解析とマイクロダイセクションの両方のための再現性のある結果を得るために適切に準備された組織を持つことが重要です。 LCMのための最適条件のためには、低湿度室で解剖を行い、適切にdehy維持するのが最適です組織をdrated。また、組織の染色が再現可能であることを確認してください。最後に、解剖楽器に精通して成功したSIVQ-LCMに不可欠です。
ここで紹介するSIVQ-LCMプロトコルは、現在の解剖方法は大規模なワークロードを処理することが容易に対応していないので、将来の臨床試験の中での用途もある半自動化マイクロダイセクション、に向けた最初のステップです。要約すると、我々はSIVQ-LCMは、自動化されたマイクロダイセクションのフィールドに新しいの進出で、研究者、アルゴリズム開発者が技術をさらに向上させることができ、そこから出発点を得たと判断している。
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Disclosures
マイケル·R·エマート、バックにはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションをカバーするNIH-保有する特許に関する発明者であり、NIH技術移転プログラムを通じてロイヤルティ報酬を受け取る。
Acknowledgments
研究は、米国立衛生研究所、国立癌研究所、癌研究センターの学内研究プログラムによって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
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