Summary
SIVQ-LCM es un enfoque innovador que aprovecha un algoritmo informático, espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ), para conducir el proceso de microdisección láser captura (LCM). El flujo de trabajo SIVQ-LCM mejora en gran medida la velocidad y la exactitud de microdisección, con aplicaciones tanto en la investigación y ajustes clínicos.
Abstract
SIVQ-LCM es una nueva metodología que automatiza y simplifica el proceso de disección con láser depende del usuario más tradicional. Su objetivo es crear una avanzada tecnología de la plataforma de disección láser, rápido personalizable. En este reporte se describe la integración del software de análisis de imágenes espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ) en el instrumento ArcturusXT. El sistema ArcturusXT contiene tanto un puerto de infrarrojos (IR) y ultravioleta (UV) de láser, lo que permite celular específico o grandes disecciones de la zona. El objetivo principal es mejorar la velocidad, la precisión y reproducibilidad de la disección con láser para aumentar el rendimiento de la muestra. Este nuevo enfoque facilita la microdisección de animales y tejidos humanos en la investigación y los flujos de trabajo clínicos.
Introduction
Originalmente desarrollado en la década de 1990, la microdisección de captura por láser (LCM) permite al usuario capturar con precisión las células específicas o regiones celulares de una sección de tejido histológico mediante visualización microscópica 1, 2. Muchos estudios que comparan el análisis molecular de LCM contra raspaduras de tejido ilustran el valor del método de 3-12. Además, hay tres publicaciones de protocolo de vídeo sobre la tecnología que están disponibles para su visualización 13, 14. Sin embargo, a pesar de su acreditado valor, LCM puede ser tedioso y laborioso cuando el objetivo de interés es una población de células dispersas en una sección de tejido heterogéneo, o cuando un gran número de células se necesitan para las aplicaciones posteriores específicos como la proteómica. La carga que supone para el operador humano nos ha llevado a desarrollar un enfoque disección semi-automatizado para LCM mediante la combinación de un potente algoritmo de análisis de imágenes para guiar el proceso de LCM 15.
<p class = "jove_content"> En colaboración con la Universidad de Michigan, el laboratorio en el NIH extendió el previamente desarrollado y reportado espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ) algoritmo de una manera que le permita a semi-automatizar el proceso de selección de los tejidos intrínseca a microdisección guiada, con lo que dispone de una herramienta con el patólogo o científico vida en mente. Espacialmente invariantes cuantificación vectorial (SIVQ) es un algoritmo que permite al usuario simplemente "clic" en una característica histológica de interés para crear un vector de anillo (función de imagen de predicado) que se puede utilizar para buscar en toda la imagen histológica, ajustando el umbral estadístico según sea necesario 16-21. El mapa de calor resultante muestra la calidad de los partidos a la función inicial de la imagen predicado y se convierte posteriormente en un solo color (rojo) Mapa de la anotación en la que se puede importar en el instrumento LCM. El software de selección automatizado, AutoScanXT, entonces se utiliza para dibujar un mapa basadoen la anotación de SIVQ guiar la captura de las células diana de la muestra de tejido. El protocolo se detalla a continuación se describe la implementación de SIVQ al flujo de trabajo de microdisección.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo descrito se emplea de acuerdo con las normas de NIH sobre el uso de muestras de tejidos humanos.
1. Preparación de Tejido
- Antes de comenzar, obtener muestras de tejidos humanos de acuerdo a la Junta de Revisión Institucional (IRB) protocolos.
- Elija el tipo de bloque de tejido / célula y el correspondiente método de procesamiento [fijado en formol e incluido en parafina (FFPE), congelados, o etanol-fijo incluido en parafina (EFPE)]. La fijación en formol proporciona histología óptimo, seguido por la fijación de etanol y flash congelado. Sin embargo, los métodos de procesamiento de fijación y tejidos pueden afectar el ADN, el ARN y cantidad de las proteínas y de calidad para el análisis molecular de aguas abajo y se deben considerar.
- Corte las secciones de bloque de tejido / célula en el tipo de diapositiva (vidrio, vidrio de la membrana o membrana estructura de metal) de su elección. Análisis SIVQ funciona igual de bien en los tres tipos de diapositivas. Tenga en cuenta que el método de pseudo-cubreobjetos (descrito más adelante) con xilenos y ethanol no se puede realizar en las diapositivas de la membrana estructura metálica ya que el deslizamiento debe ser invertido en el escenario.
- Seleccionar una mancha de tejido química-o basado en IHC para identificar las células de interés desde el fondo. Tenga en cuenta que los métodos de tinción también pueden afectar el ADN, ARN, y la calidad y cantidad de la proteína de tejido. Pruebe el tejido después de la tinción para evaluar la calidad de línea de base de biomoléculas antes de proceder con el protocolo. SIVQ-LCM se ha realizado en portaobjetos de tejido / citología teñidas con: inmunohistoquímica (IHC) con DAB 15, inmunofluorescencia, rojo rápido, de novo rojo, azul de toluidina, y hematoxilina y eosina (H & E) (datos no publicados).
2. Espécimen Imaging
- Carga se desliza sobre la etapa motorizada del instrumento microdisección y lanzar el software relacionado. Seleccione las casillas de verificación para designar las posiciones de las diapositivas cargadas y asegurar los archivos de imágenes capturadas se guardan en formato JPEG.
- Optimizar el imcalidad edad ajustando el brillo y enfoque de la imagen en la pantalla, usando la ruedecilla de enfoque manual o por medio de software del instrumento de disección.
- El uso de la caja de herramientas de imagen dentro del software del instrumento de disección, establezca adecuadamente la ganancia de brillo de la lámpara y la cámara. Los valores de ejemplo son el brillo = 60 y la ganancia = 220, con el difusor.
- Enfoque manualmente o con la función de enfoque automático en el software.
- Captura de una imagen de visión en miniatura de la diapositiva para proporcionar una hoja de ruta para el proceso de disección.
- Para obtener una calidad óptima de la imagen de una diapositiva uncoverslipped, utilizar el difusor por debajo del condensador en el instrumento, o bien, añadir una pequeña cantidad (~ 30 l) de etanol o xileno para mejorar el índice refractario (pseudo-cubreobjetos). Al utilizar xilenos, ser conscientes de que están deben utilizar medidas de seguridad tóxicos y adecuados, incluyendo el uso de una campana de humos y bata de laboratorio protectora, gafas protectoras y guantes.
- NO coloque el tapón LCM en la diapositiva hasta que la solución de etanol o xilenos ha desaparecido por completo o el polímero de la tapa será distorsionada.
- Navegar por el tobogán y capturar imágenes de las áreas a ser diseccionados a 10X, 20X o 40X. Si es necesario, mejorar la imagen con software como Autocorrección (en Microsoft Office Picture Manager) como se ha descrito previamente 22. Las imágenes deben ser capturadas en formato jpeg para que puedan volver a ser adquiridos por el software de selección automatizado.
3. Análisis del algoritmo de la Imagen
- Transferencia de imágenes capturadas desde el instrumento microdisección a la carpeta SIVQ. Instale y abra los paquetes de software ArcturusXT, AutoScan y SIVQ en el ordenador conectado al instrumento de disección. Para el acceso al software SIVQ, por favor póngase en contacto con el Dr. Ulises Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Abrir SIVQ y cargar la imagen capturada (jpeg) de interés. </ Li>
- Navega hasta el área de interés y / o ajustar el tamaño de las ventanas de exhibición (Visor 5 y 6). En el software SIVQ, Viewport 5 muestra la imagen pre-procesamiento y Viewport 6 muestra la imagen post-procesamiento 16.
- Elija el tamaño del vector del anillo y el número de anillos que se utilizarán.
- Seleccione la función de imagen de predicado para ser capturado por clic derecho sobre él en Viewport 6.
- Haga clic en "Scan" para analizar la imagen.
- Ajustar la probabilidad estadística de imagen coincidente utilizando las dos barras deslizantes. La barra superior ajusta la especificidad global de vectores, y se utiliza para excluir el área de la exploración inicial (con una sensibilidad tal como se define por la variable "Estadística" seleccionado) que puede representar área incluida excesiva. Por el contrario, la corredera inferior se utiliza para aumentar la sensibilidad, después se lleva a cabo una exploración, con la intención de aumentar la superficie que se clasifica como un partido. Estos dos controles deslizantes UTIlizar la variable "Stat" como el umbral inicial de sensibilidad de referencia.
- Para guardar la imagen, haga clic en "guardar como jpeg" (imagen se guarda en c :/ vq_test carpeta / fotos).
- Analizar la imagen con el algoritmo. La salida del algoritmo de análisis debe resultar en una imagen anotado para que sea utilizado en SIVQ-LCM. En la actualidad, la versión actual del núcleo del motor SIVQ está en fase beta de pruebas versión con la expectativa de que la versión de producción completo (Q1 disponibles 2014) incorporará un kit de desarrollo de software completo (SDK) y la interfaz de programación de aplicaciones (API) para la integración simplificada de filtros espaciales generados por el usuario y las etapas de procesamiento de datos de flujo de trabajo corriente abajo con el motor de juego de anillo central. Este SDK se distribuye con un conjunto completo de la documentación.
- Asegúrese de que el mapa de calor SIVQ se cambia a un color rojo uniforme.
- Exportar la imagen. Es esencial volver a insertar las coordenadas de posición en el post-análisis de imágenes jpeg con un editor hexadecimal para pegar en la cabecera del archivo de la imagen original de instrumento de disección. Los datos correspondientes se pueden encontrar entre "Inicio de Imagen" marcador (0xFF, 0xd8) y el primer "Definir Cuantificación Tabla" marcador (0xFF, 0xDB).
4. Microdissection
- Coloque la tapa del LCM en el centro de la región de interés, donde se capturaron las imágenes para el análisis SIVQ.
- Calibrar y control de calidad (QC) los láseres de UV / IR y optimizar los parámetros, incluyendo la energía, la duración, las ubicaciones de láser, y la velocidad de corte de UV (tal como se recomienda por el fabricante). Realizar estas calibraciones antes de volver a importar la imagen analizada.
- AutoScanXT abierto (software de selección automatizada) e importar la imagen analizada desde c :/ vq_test carpeta / fotos.
- Capacitar al software de selección automatizado para reconocer la anotación SIVQ y crear el mapa de la disección.
- Para crear un traiarchivo ning, seleccione cuatro regiones de interés (marcados con "círculos azules") en la "pintura roja" de la imagen analizada SIVQ.
- Seleccione las áreas de fondo (marcados con "cuadros rojos") que no se van a diseccionado.
- Haga clic en el botón "Analizar" para generar el archivo de entrenamiento, que se pueden guardar para usos posteriores.
- Realizar microdisección mediante el (UV) láser de infrarrojos apropiado (IR) y / o ultravioleta.
- Copie las áreas seleccionadas en la imagen "en vivo".
- En la caja de herramientas "microdissect", seleccione la captura IR apropiada o botones de corte UV.
- Después de la disección está completa, mueva el tapón LCM a la estación de control de calidad y la captura de una imagen de los tejidos / células disecadas. Otro enfoque consiste en colocar la tapa en un área en blanco de la diapositiva antes de mudarse a la estación de control de calidad, lo que permite al usuario tomar fotografías con distintos aumentos.
- Captura de una imagen de la zona de tejido de interés después de microdisección para evaluar la eficiencia de elevación.
- Si las células deseadas han sido disecados correctamente, haga clic en el botón "estado actual" en el software ArcturusXT y quitar el tapón LCM para iniciar el procedimiento de extracción molecular para el análisis de aguas abajo.
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Representative Results
Una sección de tejido de mama humana FFPE se inmunotiñó para citoqueratina AE1/AE3 utilizando un protocolo estándar IHC 23. Después de la tinción, la diapositiva de tejido se colocó en el escenario ArcturusXT y el protocolo SIVQ-LCM se inició como se describe anteriormente. Dado que el tejido no puede ser coverslipped para microdisección, las células teñidas + IHC pueden ser difíciles de discernir visualmente (Figura 1A). Por lo tanto, para proporcionar una mejor adaptación de índice y una imagen mejorada, se añadieron xilenos a la sección de tejido para crear un pseudo-cubreobjetos 15 (Figura 1B). A continuación, la imagen jpeg fue capturado de la zona pseudo-coverslipped e importarse en SIVQ para el análisis de algoritmos. Una característica imagen predicado (DAB mancha marrón oscuro) seleccionado por el usuario inicia el algoritmo SIVQ para analizar la imagen (Figura 1C). A continuación, el mapa de calor SIVQ se convirtió en una "pintura roja" que es reconocido por el software de selección automatizada (Figura 1D). Los xilenos se dejó evaporar y el mapa de calor SIVQ se importan en el software de selección automatizado (Figura 1 E) y las celdas resaltadas fueron disecados con el láser de infrarrojos. A continuación, la tapa LCM fue trasladado a la estación de control de calidad del instrumento ArcturusXT y una inspección visual para evaluar la eficiencia de la disección (Figura 1F). El tejido restante también fue inspeccionado (Figura 1G) y el mapa de calor SIVQ se importa nuevamente para evaluar la eficiencia de microdisección (Figura 1H).
Figura 1. SIVQ-LCM de IHC tiñe el tejido mamario FFPE. A) Imagen Uncoverslipped de citoqueratina AE1/AE3 tiñe el tejido mamario FFPE. B) Imagen xilenos recubierto (pseudo-coverslipped) del panel A.
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Discussion
Se presenta un protocolo para la aplicación de SIVQ-LCM a microdissect células epiteliales immunostained de FFPE tejido mamario humano. El uso de un algoritmo de análisis de imágenes, tales como SIVQ, reduce la cantidad de manos sobre el tiempo requerido para el proceso de microdisección. Este es un avance potencialmente importante para el campo desde el tiempo del operador y esfuerzo es típicamente el paso limitante de la velocidad para la disección precisa de las células de interés. En el presente protocolo, se adaptó específicamente nuestro procedimiento al instrumento ArcturusXT, aunque es probable que sea posible adaptar SIVQ y otros algoritmos para otros instrumentos de microdisección disponibles en el mercado también. Además de mejorar la eficiencia, este nuevo enfoque puede permitir a los usuarios que son expertos no histopatología para realizar microdisección. Finalmente, el uso de un algoritmo para conducir el proceso de microdisección puede permitir una mayor reproducibilidad de sitio a sitio mediante la eliminación de la subjetividad de usuario en la identificación de células o interés f.
Mientras SIVQ exhibe amplia adaptabilidad a múltiples clases de imagen materia, incluyendo la histología, es importante reconocer que no es la intención de servir como una herramienta de procesamiento / segmentación universal de la imagen, sino más bien, como una alta eficiencia de la selección de primer plano de primer paso herramienta. Utilizado de esta capacidad, tiene alta utilidad para predecir si o no una clase particular de la materia imaginería es adecuado para aproximaciones numéricas de segmentación. Cuando SIVQ tiene éxito, existe un alto poder predictivo que sea: a) un enfoque de análisis de imagen / segmentación más refinada y específica será un gran éxito y / o b) una, SIVQ vector máquina seleccionada optimizado será efectiva en la prestación de una clínica- solución de flujo de trabajo listo. En cualquier circunstancia, el uso de SIVQ sirve como una herramienta de triaje eficaz para identificar la materia imaginería que plantea soluciones computacionalmente tratables en términos de segmentabilidad primer plano.
ntent "> Mientras que hemos descrito anteriormente el uso del protocolo SIVQ-LCM sólo para experimentos de microarrays expresión de ARNm 15, creemos que el protocolo es aplicable a la mayoría de los ensayos moleculares aguas abajo, y puede ser particularmente útil para los ensayos moleculares que requieren un gran número de células, tales como la proteómica Para estos estudios, grandes cantidades de células necesitan para ser adquiridos debido a la incapacidad para amplificar las proteínas.. Además, la llegada de las tecnologías más recientes, como Next-Gen Sequencing (NGS), hace hincapié en la necesidad de comenzar con la mayor de una muestra pura como sea posible. La capacidad para SIVQ-LCM para aislar células a través de ambas características morfológicas y / o cualidades de tinción podría permitir la capacidad de aislar más fácilmente las poblaciones de células puras.Es fundamental contar con el tejido preparado adecuadamente para obtener resultados reproducibles, tanto para el análisis SIVQ y microdisección. Para las condiciones óptimas para el LCM es mejor realizar disecciona en un ambiente de baja humedad y mantener adecuadamente deshidrated tejido. Además, asegurar que la tinción del tejido es reproducible. Por último, la familiaridad con el instrumento de disección es esencial para el éxito de SIVQ-LCM.
El protocolo SIVQ-LCM que aquí se presenta es el primer paso hacia la microdisección semi-automatizada, que puede tener aplicaciones en el futuro los ensayos clínicos ya que los métodos de disección actuales no son fácilmente capaz de manejar grandes cargas de trabajo. En resumen, creemos que SIVQ-LCM es una nueva incursión en el campo de la microdisección automatizado y proporciona un punto de partida para que los investigadores y desarrolladores de algoritmos pueden mejorar aún más la tecnología.
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Disclosures
Michael R. Emmert-Buck es un inventor de patentes de los NIH que cubren láser captura microdissection y recibe los pagos en forma de regalías a través del Programa de Transferencia de Tecnología de NIH.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado en parte por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, el Centro para la Investigación del Cáncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
