Analyse av epitelisk skade produsert av Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51668

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Abigail Betanzos¹, Michael Schnoor², Rosario Javier-Reyna¹, Guillermina García-Rivera¹, Cecilia Bañuelos³, Jonnatan Pais-Morales¹, Esther Orozco¹

¹Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ²Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ³Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

Summary

Menneske-smitte av Entamoeba histolytica fører til amoebiasis, en viktig årsak til diaré i tropiske land. Infeksjon er initiert av patogen interaksjoner med intestinale epitelceller, provoserte åpningen av celle-celle-kontakter og følgelig diaré, noen ganger fulgt av leverinfeksjon. Denne artikkelen gir en modell for å vurdere tidlig host-patogen interaksjoner å forbedre vår forståelse av amoebiasis patogenesen.

Abstract

Entamoeba histolytica er den utløsende agent for menneskelig amoebiasis, en viktig årsak til diaré og lever abscess i tropiske land. Infeksjon er initiert av interaksjon av organismen med intestinale epitelceller. Dette samspillet fører til forstyrrelse av intercellulær strukturer som trange veikryss (TJ). TJ sikre tetning av epitellaget å skille vertsvevet fra tarmlumen. Nyere studier gir bevis for at forstyrrelse av TJ av den parasittiske protein EhCPADH112 er en forutsetning for E. histolytica invasjon som er ledsaget av epiteliale barriere dysfunksjon. Således analyse av molekylære mekanismer som er involvert i TJ demontering under E. histolytica invasjonen er av avgjørende betydning for å forbedre vår forståelse av amoebiasis patogenesen. Denne artikkelen presenterer en enkel modell som gjør at vurderingen av innledende vert-patogen interaksjoner og parasitten invasjonen potensial. Parametere som skal analyseres er transepithelial elektrisk motstand, samspill av EhCPADH112 med epiteliale overflate reseptorer, endringer i uttrykk og lokalisering av epitel junctional markører og lokalisering av parasitt molekyler i epitelceller.

Introduction

Entamoeba histolytica er en enkelt celle protozo ansvarlig for menneskelig amoebiasis, en tarminfeksjon forårsaker betennelse og diaré. E. histolytica infiserer opptil 50 millioner mennesker årlig, men bare ca 10% av infiserte mennesker utvikler symptomer assosiert til amoebiasis ^en. Smitte skjer ved inntak av forurenset mat eller vann som inneholder E. histolytica cyster. I tarmen, cyster produsere levende trophozoites som holder seg til kolon mucin og sprer ^to. Trophozoites vanligvis danne cyster som skilles ut via avføring. I andre tilfeller og for ennå ukjente årsaker, trophozoites bryte tarmepitel lag og invadere underliggende vev. I verste fall går de inn i blodstrømmen og påvirke andre organer som lever ^tre.

Breaking epiteliale barriere krever avbrudd av epitel transmembranal strukturer som opprettholder celler sluttet. Epitelcellekontakter er dannet av den apikale junctional kompleks bestående av stramt (TJ) og adherens veikryss (AJ), og desmosomes ^fire. De mest apikale veikryss er TJ, og derfor er de den første barrieren krenket av E. histolytica og noen andre patogener under verts invasjon. TJ består av transmembranal adhesjonsreseptorer som Claudins, occludin og junctional adhesjonsmolekyler (JAM) som driver homo-eller heterofile interaksjoner med reseptorer på nabocellen. De er intracellulært bundet av stillas molekyler av zonula okkludens (ZO) familie som kobler adhesjonsreseptorer til aktin cytoskjelettet for å gi ytterligere mekanisk styrke til Epitel. TJ er ansvarlig for tetting intestinal vev fra tarmen lumen, hindre overdreven vann og oppløst stoff lekkasje. Dermed, etter TJ blir forstyrret av parasitten, er vev invadert. E. histolytica utskiller flere molekyler som: (i) de som er involvert i adhesjon av amøber til TargET celler ^5; (Ii) Membranaktive faktorer som deltar i dreping av vertsceller ved exocytose, f.eks ionekanal-dannende peptider betegnet amoebapores ^6,7; og (iii) proteinases som forringer ekstracellulære matrix proteiner og megle vev oppløsning ^5,8,9.

Cystein protease EhCP112 og adhesjonsmolekylet EhADH112 som sammen danner EhCPADH112 komplekset er to E. histolytica virulens proteiner som spiller en viktig rolle i demontering av TJ ^10. Aktive trophozoites, deres totale lysates og skilles produkter indusere molekylære endringer i TJ komplekse og funksjonell forstyrrelse av epiteliale barriere. I denne studien er det vist at EhCP112 og EhADH112 samhandle med occludin og claudin-en proteiner fører til internalisering og nedbrytning av celleproteiner, og dermed tilrettelegge for E. histolytica inngang gjennom paracellular veien.

Våre data og de of andre grupper ^11-17 sterkt at nødvendigheten av spesifikke vert-patogen interaksjoner som lar parasitt invasjon. Rakne den molekylære basis av disse interaksjonene er av største betydning for en bedre forståelse av amoebiasis patogenesen. Selektiv forstyrrelse av TJ etter trophozoites, preget av økt paracellular permeabilitet, kan måles ved en nedgang i transepithelial elektrisk motstand (TER). Denne overføring av parasittiske proteiner mot verts epitel kan bli bestemt ved immunfluorescens farging og laser konfokal mikroskopi, en metode som også viser ko-lokalisering av amoeba virulensfaktorer med epitel-junksjonale markører som indikerer mulige direkte interaksjoner. I denne artikkelen beskriver vi i detalj hvordan epitelceller og trophozoites er dyrket, høstet og manipulert til å undersøke vert-patogen interaksjoner og deres konsekvenser.

Protocol

En. Etablering og vedlikehold av E. histolytica Kulturer

1. Grow axenically (helt fri for alle andre forurensende organismer) 1 x 10 ⁵ trophozoites av Entamoeba histolytica belastning HML: IMSS klone en ¹⁸ i 16 x 125 mm kultur rør med Teflon liner skrulokk (eller 1 x 10 ⁶ trophozoites i en disponibel T- 25 kolbe) og 15 ml (eller 50 ml i T-25 kolbe) i Tyi-S-33 medium (Tyi buljong supplert med 3% Diamond vitamin-blanding, 10% varme-inaktivert voksen bovin serum, 0,5 IU / ml penicillin og 35 ug / ml streptomycin) ¹⁹ i en inkubator ved 37 ° C.
2. Slakte trophozoites under den logaritmiske vekstfase vanligvis på 48 til 96 t intervaller (figur 1) av kjøle rørene kultur i 5-10 minutter i et is-vann-bad for å frigjøre trophozoites festet til glasset kulturrøret.
3. Overfør kulturen til et konisk rør og invertere den flere ganger for å dispergere cells. Bestem celle nummer ved hjelp av en hemocytometer (Neubauer kammer), og overføre en inoculum inn i en kultur rør som inneholder fersk Tyi-S-33 medium.
   1. Bruk lavt antall amøber for lengre inkubasjonsperioder (~ 3 x 10 ⁵ celler for ~ 5 dager) og et høyere tall for kortere perioder (~ 1 x 10 ⁶ celler for ~ 1 dag). Mens telles inokula er ønskelig, etablerte kulturer blir forutsigbar slik at beregnede mengder av inokula er gjennomførbare.
   2. Titrer mengden trophozoites for å optimalisere cellenummer for hvert eksperiment.
   3. Opprettholde en parallell duplikat kultur å ha en back-up i tilfelle av utilsiktet forurensning eller tube brekkasje.
4. Cap rør tett og ruge dem ved 37 ° C i en 5 ° skrå horisontal vinkel.
5. Kontroller kulturer ved visuell inspeksjon regelmessig, da en overdreven vekst av kulturen kan inneholde mange lyserte celler.

2. Etablering og vedlikehold av MDCK Culture </ P>

1. Dyrk MDCK (Madin Darby Canine Kidney)-celler type I (høy motstand) i engangs-T-75-kolber med 10 ml DMEM media supplert med penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 mg / ml), insulin (0,08 U / ml) og 10% nyfødt kalveserum i en fuktet atmosfære av 5% _CO2 og 95% luft ved 37 ° C.
2. Å splitte celler, sjekk dem på en invertert mikroskop. Dele celler når de er ~ 85-100% konfluent.
3. Bruke en aspirator vakuum i en steril hette og et sterilt glass Pasteur pipette for å fjerne mediet fra kulturen. For å unngå å skrape celler, snu flasken opp ned og aspirer media fra det nederste hjørnet.
4. Tilsett 10 ml forvarmet PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na HPO _{2 til 4,} 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) i en T-75 kolbe (5 ml i tilfelle av en T-25 kolbe ) og rist i kolben for å vaske cellene. Fjern PBS ved vakuum aspirasjon. Omfattende vasking er nødvendig siden serum hemmer trypsin.
5. Tilsett 1,5 ml av 0,05% trypsin i en T-75 kolben (for T-25 kolbe bruke 0,5 ml), og rist i kolben for å dekke celleskiktet med trypsin.
6. Inkuber i 5-10 min i inkubatoren (eksakt tid avhenger trypsinaktivitet).
7. Kontroller for celle løsgjøring ved å holde kolben mot lys og se etter strømmer celler. Cell avløsning (avrundet celler) kan også kontrolleres ved hjelp av et mikroskop. Ofte celler frigi raskere med en rask, skånsom slag på siden av kolben.
8. Tilsett 15 ml av DMEM supplert til en T-75 kolbe (5 ml for en T-25 kolbe). Resuspender cellene ved å pipettere opp og ned fire eller fem ganger.
9. Å forplante celler, fortynne cellesuspensjon 01:05 med friskt supplert DMEM. Celler nummer kan også bestemmes på dette punktet ved hjelp av en hemocytometer men dette er vanligvis bare nødvendig hvis splitte celler i spesielle formater for enkelte analyser.

Tre. Utarbeidelse av trophozoite Total Lysates

1. Løsne trophozoites fra cuLTURE rør ved avkjøling av røret etter 5-10 minutter i et is-vann-bad. Overfør kulturen aseptisk i et konisk rør og sentrifuger ved 360 xg i 10 min ved 4 ° C. Forkaste forsiktig supernatanten ved dekantering, tilsett iskald PBS til pelleten, snu røret flere ganger for å dispergere cellene og sentrifuger på nytt ved 360 xg i 10 min. Gjenta dette trinn to ganger for å fjerne alle spor av Tyi-S-33 medium.
2. Bestem trophozoites nummer ved hjelp av en hemocytometer.
3. Lyse trophozoites av fryse-tine sykluser. Snap-fryse en følsom inokulum av trophozoites (600000 trophozoites / ml) fortynnet i iskald PBS, i flytende nitrogen i 1 min. Frigi prøven ved 4 ° C og vortex kraftig. Gjenta frysing og tining tre ganger for å fullføre cellelyse.
4. Aktiver proteaser som er tilstede i de lysater med 0,02% β-mercaptoethanol.

4. Utarbeidelse av trophozoite utskilt Produkter

1. Utfør trinn 03.01 til 03.02.
2. Bestemceller antallet og levedyktigheten på dette tidspunkt ved hjelp av et hemocytometer, og påføring av et trypan blå eksklusjon test ^20:
   1. Fortynne 9 x 10 ⁶ trophozoites i 3 ml iskald PBS og overføre celler til en 50 ml konisk tube. Ta 10 ul av denne suspensjonen og tilsett 1 pl av 0,4% trypan blå lagerløsning pH 7,2.
   2. Bruk en Neubauer kammer for å telle celler ved lav forstørrelse.
   3. Telle alle celler og skille antallet blå celler, siden blå cellene har tatt opp fargestoffet og må ansett døde.
   4. Beregn prosentandel av levedyktige celler ved å dividere antallet levedyktige celler ved det totale antall celler og multiplisere med 100..
3. Overfør konisk rør inneholdende trophozoite suspensjonen i inkubator ved 37 ° C i 2 timer i en 5 ° skråstilt i horisontal retning.
4. For å samle de utskilte produkter, sentrifugerør ved 360 xg i 10 min. Bruk en engangs og steril sprøyte og nøye samle supernatant å unngå forurensning av prøver med trophozoites fra pelleten. Fjern eventuelle overførte celler ved å føre supernatanten gjennom et 0,22 pm celluloseacetat-membran. Aktiver proteaser med 0,02% β-mercaptoethanol.
5. Å forkaste antatte uønsket forurensing med molekyler utgitt fra døde celler, på nytt den trypanblått utelukkelse test for celle levedyktighet. Levedyktig og totalt antall celler bør være den samme som oppnådd i trinn 4.2. Hvis dette ikke er tilfelle, kan den oppsamlede supernatant ikke bare inneholder utskilte proteiner og må kasseres.

5. Interaksjon av MDCK Cells med Trophozoites, trophozoite Lysates eller utskilt Produkter

1. Inkuber konfluente MDCK cellemonolagene med live trophozoites (en MDCK-til-amøbe 1:1), trophozoite lysatene (en MDCK-til-amøbe forholdet 1:2) eller skilles produkter (en MDCK-til-amøbe ratio av en : 10) ved 37 ° C i 2 og 30 min (figur 2A).
2. Vask epitelceller fem ganger med iskald PBS å eliminere ubundne molekyler eller trophozoites.

6. Forberedelse av prøver for Immunfluorescens

1. Kultur MDCK celler på sterile glass dekkglass plassert inne i en 24-multiwell cellekultur fatet. Inspisere cellene på invertert mikroskop til de når 100% av samløpet. Deretter bytt medium med 1 ml frisk DMEM supplert medium og overføre platen til en 37 ° C inkubator i 24 timer mer.
2. Fjern mediet ved hjelp av en vakuum-aspirator og en steril glass Pasteur-pipette og tilsett 1 ml varm PBS til hver brønn. Fjern PBS og gjenta vaske med fersk PBS. Vær forsiktig for ikke å skrape cellene fra bunnen av brønnen med glasset pipette.
3. Legg ulike forhold av trophozoites utvannet i en ml varm PBS: Live trophozoites (T), trophozoite totale Lysater (TL) og skilles produkter (SP).
   1. Sett dyrkingsplate i inkubator i 2 eller 30 min.
   2. Forbered to kontroll forhold: en som heter tids 0 min, der MDCK celler skal ikke inkuberes med E. histolytica, men bare med ett ml varm PBS; og en annen tilstand som sekundære antistoffer som kontroll, i dette tilfellet inkuber MDCK med T, TL eller SP for 2 eller 30 min, og utelate inkubasjon med primære antistoffer.
4. Vask epitelceller fem ganger med kald PBS å eliminere ubundne molekyler eller trophozoites.
5. Fikse og permeabilize cellene med 1 ml av 96% etanol i 30 min ved -20 ° C.
6. For å fjerne ethanol, utfører tre raske vaskinger med 1 ml PBS ved romtemperatur.
7. Utfør følgende trinn i et fuktighetskammer for å unngå uttørking av prøvene:
   1. Bruk alle tilgjengelige flat boks som kan lukkes og fylt med et vått papirhåndkle på hvilke prøver kan trygt plassert. For eksempel, en tom Pipettespissen boks tjener dette formålet godt.
   2. Inne i kammeret, jevnt plassere en Parafilm lag og pipette 25 pl av blokking-løsning (0,5% BSA) til hver dekkglass.
   3. Ta Dekk ut av brønnene med fin pinsett, fjern forsiktig overflødig væske fra kanten med et filterpapir, og satt inn i dekk dråpe inneholdende blokkeringsoppløsning (0,5% BSA) med cellene som vender mot sperre løsning. Inkuber prøvene i 1 time ved romtemperatur.
8. Lag en blanding av primære antistoffer i PBS: IgM mus anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; 1:10 fortynning) og IgG kanin anti-ZO-en (pα-ZO-en; 1:100 fortynning).
9. Plasser et nytt ark av Parafilm i fuktig boksen og pipette 25 mL av antistoffer løsning for hver dekkglass.
10. Løft Dekkglass fra den blokkerende løsning, tørkes overskytende væske ved kantene ved hjelp av et filterpapir, og plassere dem i dråpene med de cellene som vender mot antistoff-løsning. Inkuber prøvene over natten ved 4 ° C.
11. Sett hver dekkglass i en brønn av en 24-multiwell (celle side på toppen) og tilsett 1 ml PBS.
12. Lag en blanding av fluorescerende sekundære antistoffer i PBS: geit-anti-mus IgM koblet til FITC (1:100 fortynning) og geite-anti-kanin IgG koblet til TRITC (1:50 fortynning).
13. Plasser en ny ark av Parafilm inn i den fuktige boksen og pipetteres 25 pl av den sekundære antistoffer løsning for hver dekkglass.
14. Overfør prøvene som i 6.10 og inkuberes i 1 time ved romtemperatur i mørke for å unngå bleking av de fluorescerende fargestoffer. Gjenta trinn 6.11.1.
15. For nukleær farging, inkuberes i 3 minutter med 200 pl av 0,05 mM DAPI-løsning ved romtemperatur og beskyttes mot lys. Gjenta trinn 6.11.1.
16. For å spare de fluorescerende fargestoffer, plasserer Dekkglass (celler vendt ned) inn i 5 mL VECTA Shield antifade monteringsløsning på glass objektglass. Tett dekkglass å bruke neglelakk for å unngå sample tørking.
17. For langtidslagring, holde lysbilder i enobjektglass boksen ved -20 ° C.
18. Analyser forberedelse av konfokalmikroskopi gjennom Z-stack seksjoner og XZ-fly (figur 2a).

7. Inkubasjon av Trophozoites med proteasehemmere eller spesifikke antistoffer

1. Gjenta trinn 03.01 til 03.02. For hver eksperimentell betingelse, ruge 1 x 10 ⁵ trophozoites (resuspendert i 50 mL PBS) med proteasehemmere (1 mm komplett og 40 mikrogram / ​​ml E-64) eller 30 mikrogram monoklonalt antistoff mot EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ for 20 min ved 4 ° C (figur 2B). Bruk disse preparater for co-inkubering assays som beskrevet i trinn 8.5.

8. Måling av Transepithelial Elektrisk motstand (TER)

1. Kultur MDCK celler på sterile Transwell permeable støtter (0,4 mikrometer porestørrelse). I det øvre kammer, plassere 100 pl cellesuspensjon, og i det nedre kammerplassere 600 mL supplert DMEM medium.
   1. Kontroller middels nivå med jevne mellomrom. Fersk medium kan tilsettes etter behov.
   2. Kontroller cellene på en invertert mikroskop inntil de når 100% av sammenløpet. Endre medium hver 2-3 dager.
   3. For å forbedre cellebinding (om nødvendig), likevekt i Transwell filtrene over natten ved 37 ° C i DMEM før tilsetning av cellesuspensjonen.
2. Steril STX2 elektroder i panseret ved nedsenkning i etanol og deretter i sterile PBS i 15 min hver, under UV-lys. Koble elektrodene til en EVOM epitelial voltohmmeter og velg motstand modus.
3. Samle medium fra det øvre kammer av hvert Transwell og pool dem. Ta 50 ul av dette mediet blandingen og kombinerer det med 50 pl av trophozoites suspensjonen (1 x 10 ⁵ trophozoites i PBS), eller med kun PBS (kontroll). Bruk en lignende blanding for hver Transwell.
4. Legg blandinger til det øvre kammeret av hver Transwell containing i MDCK-celler. Eksperimentelle forhold inkluderer MDCK celler uten trophozoites (kontroll), en co-kultur med trophozoites eller med trophozoites forhånds ruges med proteasehemmere eller mαEhCPADH112. For å eliminere motstanden levert av filtre, bruker transwells ruges med medium bare. For hver eksperimentell tilstand benytte minst tre transwells.
5. Umiddelbart, måle TER ved å dyppe STX2 elektroder i hver Transwell.
   1. Påse at lengre elektrode i berøring med bunnen av det nedre kammer, og at den korteste elektrode er dekket av mediet i det øvre kammeret (se figur 2B).
   2. Sørg for å holde elektrodene vinkelrett hver gang. Dette vil bedre reproduserbarhet, betydelig. Unngå å bevege eller vippe elektroden under målingene, da dette vil føre til variasjoner i dataene.
6. Denne målingen bør vurderes den første TER verdi. Deretter overvåke TER under følgende30 min.
7. For å beregne den endelige TER verdi, trekke fra TER verdien av filtre bare. Å sammenligne resultatene fra ulike eksperimenter normal hvert datapunkt til de opprinnelige verdiene, tar disse som 100% (figur 2B).

Representative Results

For en vellykket E. histolytica kultur, må to viktige forutsetninger være oppfylt: vekst i axenic forhold og innhøsting i logaritmisk fase. Tidligere kulturer av E. histolytica lett ble etablert i forbindelse med visse arter av bakterier eller trypanosomatids ^22. Men i dag er det vanlig å ha axenic dyrking av denne parasitten betyr ubestemt subcultivation av amøber i et miljø fritt for metabolizing bakterier, sopp, protozoer, eller metazoan celler. I tillegg høste trophozoites under sen logaritmisk til tidlig stasjonær vekstfase er avgjørende å ha levedyktige og prolifererende celler ^23. Derfor er det viktig å skille denne fase ved kvantifisering av trophozoites langs flere dager, og også ved å undersøke deres intakt morfologi og hurtig bevegelse (fig. 1).

For interaksjonsstudier, epitelceller må værei et konfluent monolag å representere fysiologiske betingelser som amøber normalt ville oppstå i kroppen. Flere epiteliale cellelinjer, lett å dyrke, er tilgjengelige. Selv om en mer fysiologisk modell cellesystem ville avlede fra tarmen som Caco-2 eller T84, disse cellelinjene vokser ganske langsomt. En raskere voksende cellelinje som i stor utstrekning er blitt studert er MDCK-celler ^24. Disse epitelceller er av nyre opprinnelse og er preget av høy TER, sterk TJ og enkel dyrking. Denne cellelinje har blitt brukt i årtier for å studere cellebiologi kryss og TJ sammensetning samt mekanismer for TJ montering og demontering. For disse grunner, er MDCK cellene ofte valgt av forskere når studere TJ funksjoner. MDCK celler har også vært mye brukt som modell for studier av mekanismer indusert under amoebiasis ^{5,8,10,25-28.} I en fersk studie, rapporterte vi at samspillet av belastningen jeg MDCK celler og intestinale epitelceller Caco-2 celler med live amøber, lysates og Amoeba produkter forårsaket lignende effekter på TJ sammensetning og TER ^10. Dermed MDCK celler er en egnet modell for å studere mekanismer for amøbe-epitel interaksjoner. Videre er bruken av flere E. histolytica produkter (intakte trophozoites, trophozoite totale Lysater eller utskilt produkter høstet som trophozoites kultur supernatant) er avgjørende for å gi ytterligere og relevant informasjon om molekyler som er involvert i disse interaksjoner, for eksempel tilgjengelighet, virknings, sekresjon, deltakelse av andre molekyler og utløsning av signalveier.

Mens nå konfluens, epitelceller danner kontakter som er stabilisert av TJ og AJ. Disse strukturene er sammensatt av visse molekyler som kan visualiseres ved hjelp av spesifikke antistoffer i immunfluorescens stainings. For eksempel, i figur 3, blir celle kontakter visualisert med et antistoff mot TJ markør ZO-1 og et rødt fluorescerende labÉLED sekundært antistoff. Som det kan sees, cellene samles i umiddelbar nærhet for å danne en tett monosjikt uten hull. I denne figuren har amøbe-avledet kompleks EhCPADH112 blitt farget ved å bruke et monoklonalt antistoff som blir detektert av en grønn fluorescensmerkede sekundært antistoff for å studere interaksjonen av dette komplekset med epiteliale overflate. Tre ulike kilder til dette komplekset har blitt brukt til epithelial monolayer: Live trophozoites (T), trophozoite totale lysates (TL) og skilles produkter (SP). Påfallende, i alle tilfeller, co-lokalisering av EhCPADH112 med ZO-1 kan observeres (fig. 3, piler), som indikerer at dette kompleks kan være nødvendig for å lette E. histolytica penetrasjon inn i epiteliale monolayer.

Selv om denne interaksjonen kan allerede være observert så tidlig som 2 min etter amøbe-epitelial celle kontakt, er det celle laget ennå ikke berørt av dette samspillet siden ZO-1 flekker fortsatt ser continuerlig. Dette endrer seg fullstendig etter lengre inkubasjonstider som vist i figur 4.. Her ble bildene tatt etter 30 min for eksponering for de tre forskjellige EhCPADH112 kilder. En klar avbrudd i TJ visualiseres ved en diskontinuerlig ZO-1-farging på cellerammer (figur 4, piler), med det mest tydelig virkning inntreffer i MDCK celler i kontakt med T-eller TL. I motsetning til dette blir ZO-1 internalisert og er sett i intracellulære vesikler. Nøyaktig samlokalisering med enten TJ eller AJ langs side cellemembranene kan ikke skilles ved å bare se på toppen av monolaget, men heller ved å skaffe seg en "side"-visning av cellekontakter ^29. Konfokal lasermikros tillater et slikt vis langs xz-aksen som vist på figurene 3 og 4 nedenfor hver xy-visning. Disse bildene viser en klar angivelse vidt proteinene samtidig lokalisere med TJ på det meste apikale parti av den laterale membran eller hvis de er snarere plassertNedenfor TJ eller over TJ på den apikale membran. I figur 3 (pilhoder), en nøyaktig ko-lokalisering av EhCPADH112 kompleks med ZO-1 kan observeres klart åpen TJ som stedet for handlinger for virulens faktor. I kontrast, i E. histolytica invasjon kommet (30 min interaksjon) inn i epitel, penetrerte EhCPADH112 mot det intercellulære mellomrom som flekker langs den laterale membranen viste (figur 4, pilspisser). I vår nyere artikkel, denne metoden tillot oss å skille mellom TJ og AJ fordi dette komplekset bare samlokalisert med TJ markører occludin og claudin-en, men ikke med AJ markør β-catenin på 2 min av interaksjon ^10.

Internalisering av TJ-komponenter, som kan sees i immunfluorescens stainings i figur 4, er vanligvis ledsaget av tap av barrierefunksjonen som kan måles ved transepithelial elektrisk motstand (TER). TERreflekterer ion strømning på tvers av epithelial monolaget, og kan måles ved hjelp av elektroder som vist i figur 2B. Når monolaget ennå ikke er fullstendig dannet, eller avbrutt på grunn av ekstracellulære signaler, er en fri strømning av ioner over cellelaget indikert ved en lav TER. TER ble målt av en kontroll konfluent monolag som ikke har vært i kontakt med amoeba produkter eller monolag i kontakt med trophozoites (figur 5). Parasitt kontakt avbrutt epitelial barrierefunksjon er angitt ved en TER fall på 90% i forhold til kontroll-monolag. For å undersøke de mekanismer som påvirker trophozoites barrierefunksjon, vi pre-inkubert i trophozoites med et antistoff mot EhCPADH112 for å forhindre adhesjon av dette kompleks, eller med protease-inhibitorer, for å blokkere den proteolytiske aktivitet av denne komplekse og andre proteaser som er viktige for target celleskader. Begge behandlingene førte til en nesten fullstendig reversering av TER dråpe, noe som tyder på at både proteolytisk aktivitet og selvklebende egenskaper er viktige virulensfaktorer av dette komplekset under E. histolytica invasjon.

Figur 1. Typisk vekstkurve for axenically dyrkes E. histolytica trophozoites. Inokulasjoner av 2 x 10 ⁵ trophozoites av E. histolytica HMI-IMSS klone A ble dyrket i seks-brønns retter med Tyi-S-33 medium og etter hver 24-timers celle tall ble bestemt med en hematocytomer. Celleveksten ble undersøkt ved lysmikroskopi og morfologi av voksende celler er vist i det øvre panel. Mengden av trophozoites ble overvåket i seks dager (d), og verdiene ble plottet i diagrammet nedenfor. Data representerer gjennomsnitt og standard feil av gjennomsnittet av tre uavhengige målinger. Bar = 10 mikrometer./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Skjematisk fremstilling av interaksjoner mellom MDCK celler og ulike forhold av E. histolytica. A) Ulike vilkår for E. histolytica vises: Live trophozoites (T), total trophozoites lysates (TL) og molekyler skilles ut av trophozoites inn i mediet (SP). Alle eksperimentelle tilstand ble bestemt med hensyn til 2 og 30 min inkubering med konfluent MDCK-celler. Etter inkubasjon ble MDCK-celler rikelig vasket for å fjerne ubundne trophozoites eller parasittiske molekyler. Da prøvene ble behandlet for immunofluorescence analyser, ansette mαEhCPADH112 og pαZO-en antibodkaper å co-lokalisere den parasittiske kompleks EhCPADH112 og TJ markør ZO-1, henholdsvis. Senere ble det artsspesifikke sekundære antistoffer koblet til forskjellige fluorokromer benyttes til å detektere både proteiner ved konfokal mikroskopi. B) Tilsetning av trophozoites kun or trophozoites pre-inkubert med mαEhCPADH112-eller protease-inhibitorer for 20 min ved 4 ° C i det øvre kammer av transwells inneholder konfluente MDCK celler. TER av epitelceller ble overvåket ved hjelp av en STX2 elektrode koblet til en EVOM voltohmeter, i løpet av 30 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3.. Lokalisering av EhCPADH112 på TJ av MDCK monolayers. MDCK cellene var inkubasjonerbated med live trophozoites (T), total trophozoites lysates (TL) og molekyler skilles ut av trophozoites inn i mediet (SP) for 2 min. Øvre panel: fase bilder kontrast av MDCK celler. EhCPADH112 og ZO-1 proteiner ble identifisert ved mαEhCPADH112 og pαZO-1-antistoffer, og deretter med FITC-og TRITC-sekundære antistoffer, henholdsvis. Atomkjerner var farget med DAPI. Piler: protein lokalisering i cellekantlinjer. Pilspisser i XZ-plan: protein lokalisering på TJ. Bar = 10 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Internalisering av EhCPADH112 inn MDCK celler. MDCK celler ble inkubert med live trophozoites (T), total trophozoites lysatene (TL) og molekyler utskilt av trophozoites inn i mediet (SP) i 30 min. Øvre panel: fase bilder kontrast av MDCK celler. EhCPADH112 og ZO-1 proteiner ble identifisert ved mαEhCPADH112 og pαZO-1-antistoffer, og deretter med FITC-og TRITC-sekundære antistoffer, henholdsvis. Atomkjerner var farget med DAPI. Piler: protein lokalisering i cellekantlinjer. Pilspisser i XZ-plan: protein lokalisering ved lateral membran (pilspisser). Bar = 10 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. E. histolytica via EhCPADH112 induserer epiteliale barriere avbrudd. MDCK monolagene inkubert med live trophozoites(T) eller T pre-inkubert med proteaseinhibitorer (PI) eller mαEhCPADH112 antistoff (α) i 30 min og TER ble vurdert ved indikerte tider. TER ble normalisert i henhold til den opprinnelige verdien for hver Transwell (~ 3200 Ω · cm ^2). Midler og standardfeil av gjennomsnittene er representert for hvert tidspunkt. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism 5 programvaren ved hjelp enveis ANOVA test. *** P <0,001.

Discussion

For å studere i vitro vert-patogen interaksjoner under epithelial infeksjon etter E. histolytica, er det avgjørende å jobbe med godt etablerte kulturer av både epitelceller og trophozoites. For eksempel, tidligere, E. histolytica kulturer hadde vanligvis er etablert i forbindelse med visse arter av bakterier eller trypanosomatids ^22,23. Men co-dyrking av E. histolytica kulturer er kontraproduktivt for studiet av host-patogen interaksjoner fordi observerte virkninger på vertsceller ikke kunne utvetydig tilskrives ameobas men kan heller være en effekt av co-dyrkede celler. Således, en axenical kultur av E. histolytica er ønskelig for undersøkelse av spesifikke host-patogen interaksjoner. Den angitte protokollen beskriver hvordan en slik axenic dyrking av E. histolytica kan oppnås for å spesifikt utnytte slike kulturer for infeksjonsstudier. I tillegg, timingenfor innhøsting av E. histolytica er også kritisk. E. histolytica innhøstingen er anbefalt under sene stadier av eksponentiell vekst for å sikre en høy avkastning av celler med høy levedyktighet.

På den annen side, er en vel-etablert monolag av epitelceller også påkrevd for å oppnå reproduserbare resultater. Å etterligne en fysiologisk stramt epitel monolayer, dyrkede celler må brukes på riktig timing. Den monolaget må være fullstendig dannet uten hull. Videre riktig dannelsen av TJ og AJ krever litt tid etter cellekontakter er etablert. Vanligvis epitelceller er kontakt-inhibert, hvilket betyr at cellene stopper prolifererende i et konfluent monolag, slik at det vanligvis bedre å gi cellene annen dag for vekst. Dette bør imidlertid ikke utvides ettersom denne kontakt inhibering ikke er ubestemt, og cellene kan på et tidspunkt begynner å overgrow hverandre. Hvis dette overholdes vil det være nødvendig å dele eller plateard celler og ikke bruke dem i analyser. Dannelsen av stramme epitel monolayers er best kontrolleres ved å måle TER. Dette krever imidlertid veksten i Transwell filtre, som er ganske dyrt. Å utvikle et øye for en god monolayer kan det være nyttig for den uerfarne eksperimentator å sammenligne cellevekst i samme dyrking format etter å spre ulike celle tall.

Tidspunktet for host-parasitt interaksjoner analysen er en annen viktig faktor. Etter 2 min av samhandling, kunne ingen epithelial skade observeres, men et samspill av EhCPADH112 med TJ molekyl ZO-en var allerede tydelig. Imidlertid, etter 30 min interaksjon ble alvorlig epitelial skade observert som vist ved TJ demontering og en dråpe TER ⁽¹⁰ og denne studien). Disse data tyder på at tidlig klebe interaksjon med den apikale epithelial side er nødvendig for å løsne kontaktene og tillater inntrengning av andre molekyler slik som proteaser som deretter bidrar tilnedbrytning av andre TJ, AJ og desmosome molekyler. Konsentrasjonen av de trophozoites proteiner er også viktig. Av notatet, kan ulike resultater observeres ved søknad levende trophozoites eller bare lysates eller skilles produkter av E. histolytica. Den relative andel av trophozoites til epitelceller ble tidligere påvist ^10, og selv når forholdet av MDCK-til-secreted-produkter ved amøbe var høy (01:10), epiteliale skaden var ikke så alvorlig. Dette indikerer ikke bare at konsentrasjonen av en enkelt virulens protein er kritisk, men at den også kan være samspillet mellom ulike faktorer som resulterer i effektiv epitelial skade for å tillate hurtig invasjon av amøber. For eksempel, Chadee gruppe fremhevet viktigheten av en annen amøbe-avledet protease, EhCP5, for å lokke fram epithelial skade ^16. Det virker sannsynlig at et samspill av virulensfaktorer er in vivo som kreves for å indusere amoebiasis og at manglende samhandling grunn inhibition av et enkelt protein kan forklare det faktum at i de fleste tilfeller infeksjoner er stillestående. I denne sammenheng er det også viktig å nevne at epiteliale produkter som mucins er viktig å beskytte mot smitte. Spesielt mucin2 knock-out mus er mer utsatt for EhCP5-indusert TJ endringer og infeksjon ^16. Dermed endringer på epithelial side må også tas i betraktning for å vurdere amøbe invasivitet.

En viktig begrensning for de beskrevne teknologi for å påvise co-lokalisering, er at den ikke utvetydig beviser en direkte interaksjon. I dette tilfellet kan et co-lokalisering eller interaksjon også bli formidlet av et annet protein som er ikke bare visualisert. For å detektere en direkte interaksjon, vil det være nødvendig å produsere rekombinante tagged (slik som GST-eller 10xHis) proteiner og utføre immunoutfelling for en kode-og Western blot for den andre. Anyways, immunofluorescence stainings har fordelen av å avsløre EXAct cellulær beliggenhet av proteinkomplekset og gi experimenter et inntrykk av de proteiner som skal testes i et slikt in vitro interaksjon assay. En annen ulempe er at det er bare noen få Amoeba spesifikke antistoffer tilgjengelige. Således, hvis man ønsker å studere visse amoeba proteiner i slike interaksjonsstudier, vil det mest sannsynlig krever genereringen av et antistoff. Imidlertid, hvis antistoffer er tilgjengelige, de beskrevne fremgangsmåter kan anvendes for å studere betydningen av andre amoeba proteiner (secreted eller overflate-bundet) for vert-patogen interaksjoner.

Dette notatet beskriver en enkel modell for å oppdage samlokalisering og interaksjoner mellom molekyler av verten og parasitten. Kunnskapen fra disse celle-baserte eksperimenter kan brukes i in vivo smittemodeller ved hjelp hamster eller mus for å underbygge den fysiologiske relevans for verts invasjon av parasitten. Disse data kan så benyttes for utviklingen av nye behandlings stragier.

Oppsummert kan vi tilby detaljerte protokoller for å dyrke E. histolytica og epitelceller for bruk i vert-patogen interaksjonsstudier, særlig, analyser som tillater evaluering av samlokalisering og TJ demontering. Timingen av kulturene, så vel som at på hver analyse er avgjørende for å sikre reproduserbarhet av resultater oppnådd. Selv om tidsberegningen av kulturene kan påvirkes ved å variere antallet av disseminert celler, timingen av forsøkene selv er avhengig av den type analyse og typen av proteiner som ble undersøkt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution