Summary
عدوى الإنسان عن طريق المتحولة الحالة للنسج يؤدي إلى الأميبية، سببا رئيسيا من أسباب الإسهال في البلدان الاستوائية. وبدأت العدوى عن طريق التفاعلات الممرض مع الخلايا الظهارية في الأمعاء، مما أدى إلى افتتاح اتصالات خلية خلية، وبالتالي الإسهال، يليه في بعض الأحيان عن طريق العدوى الكبد. توفر هذه المقالة نموذج لتقييم مبكر التفاعلات المضيف الممرض لتحسين فهمنا للالأميبية المرضية.
Abstract
المتحولة الحالة للنسج هو العامل المسبب للالأميبية الإنسان، سببا رئيسيا من أسباب الإسهال وخراج الكبد في البلدان الاستوائية. وبدأت العدوى عن طريق التفاعل بين الممرض مع الخلايا الظهارية في الأمعاء. هذا التفاعل يؤدي إلى اختلال الهياكل بين الخلايا مثل منعطفات ضيقة (TJ). TJ ضمان الختم من طبقة الطلائية لفصل الأنسجة المضيف من التجويف الأمعاء. تقديم الدراسات الحديثة أدلة على أن تعطل TJ من البروتين EhCPADH112 الطفيلية هو شرط أساسي لE. غزو نسج أن يترافق ضعف حاجز الظهارية. وبالتالي، فإن تحليل الآليات الجزيئية المشاركة في TJ التفكيك خلال E. غزو نسج هو من أهمية قصوى لتحسين فهمنا للالأميبية المرضية. تقدم هذه المقالة نموذج السهل الذي يسمح للتقييم الأولي التفاعلات المضيف الممرض واحتمال غزو الطفيليات. المعلمات ليتم تحليلها وتشمل رالمقاومة الكهربائية ransepithelial، تفاعل EhCPADH112 مع مستقبلات سطح الظهارية، والتغيرات في التعبير وتوطين علامات صلي الظهارية وتوطين الجزيئات الطفيليات داخل الخلايا الظهارية.
Introduction
المتحولة الحالة للنسج الأوالي هو خلية واحدة مسؤولة من الأميبية الإنسان، عدوى معوية تسبب الالتهاب والإسهال. E. نسج تصيب ما يصل إلى 50 مليون شخص سنويا، ولكن فقط حوالي 10٪ من المصابين تطوير الأعراض المصاحبة لالأميبية 1. تحدث العدوى عند ابتلاع الطعام الملوث أو المياه التي تحتوي على E. الخراجات نسج. في الأمعاء، والخراجات إنتاج النواشط الحية التي تلتزم القولون الميوسين وتتكاثر 2. النواشط عادة ما تشكل الخراجات التي تفرز عن طريق البراز. في حالات أخرى وذلك لأسباب غير معروفة حتى الآن، النواشط كسر الطبقة الظهارية المعوية وغزو الأنسجة الكامنة. في أسوأ الحالات، فإنها تدخل مجرى الدم وتؤثر على أعضاء أخرى مثل الكبد 3.
كسر حاجز الظهارية يتطلب تعطيل هياكل transmembranal الظهارية التي تحافظ على خلايا انضم. الخلايا الظهاريةوتشكل الاتصالات عن طريق مجمع صلي قمية تتألف من ضيق (TJ) والملتصقة تقاطعات (AJ)، وdesmosomes 4. التقاطعات الأكثر القمي هي TJ، وبالتالي، فهي أول حاجز بالإهانة من قبل E. نسج وبعض مسببات الأمراض الأخرى خلال الغزو المضيف. وتتألف TJ مستقبلات الالتصاق transmembranal مثل claudins، occludin وجزيئات الالتصاق صلي (JAM) التي تشارك في التفاعلات متغايرة الحبيبات وطي أو مع مستقبلات الخلية المجاورة. يتم داخل الخلية ملزمة من قبل جزيئات السقالة من النطيقة نطيقة (ZO) الأسرة التي تربط مستقبلات الالتصاق إلى الهيكل الخلوي الأكتين لتوفير مزيد من القوة الميكانيكية للظهارة. TJ هي المسؤولة عن ختم الأنسجة المعوية من التجويف الأمعاء، ومنع تسرب المياه المفرطة والمذاب. وهكذا، بعد تتعطل TJ من الطفيليات، وغزت الأنسجة. E. نسج تفرز العديد من الجزيئات مثل: (ط) المتورطين في التصاق الأميبات لTARGوآخرون خلايا 5؛ (ب) العوامل غشاء النشطة المشاركة في قتل الخلايا المضيفة التي كتبها إيماس، على سبيل المثال الببتيدات المكونة للقناة أيون يطلق amoebapores 6،7؛ و (iii) proteinases التي تتحلل البروتينات المصفوفة خارج الخلية والأنسجة التوسط تفكك 5،8،9.
البروتيني السيستين EhCP112 وجزيء التصاق EhADH112 التي تشكل معا مجمع EhCPADH112 هما E. نسج الفوعة البروتينات التي تلعب دورا رئيسيا في تفكك TJ 10. النواشط الحية، ومجموع لست] ومنتجاتها يفرز لحث على التغيرات الجزيئية في TJ اضطراب معقدة وظيفية من حاجز الظهارية. في هذه الدراسة، تبين أن EhCP112 وEhADH112 التفاعل مع occludin وclaudin-1 البروتينات مما يؤدي إلى استيعاب وتدهور البروتينات الخلايا، مما يسهل E. مدخل للنسج من خلال مسار paracellular.
لدينا البيانات وتلك سو مجموعات أخرى 11-17 تشير بقوة إلى ضرورة التفاعلات المضيف الممرض المحددة التي تسمح غزو الطفيليات. كشف الأساس الجزيئي لهذه التفاعلات أمر في غاية الأهمية من أجل فهم أفضل للالأميبية المرضية. اضطراب انتقائية من قبل TJ النواشط، وتتميز زيادة نفاذية paracellular، يمكن قياس انخفاض في المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (TER). ونقل البروتينات الطفيلية نحو ظهائر المضيف يمكن تحديده من خلال تلطيخ المناعي ومتحد البؤر المجهري الليزر، وهي طريقة التي يمكن أن تكشف أيضا عن المشاركة في توطين عوامل الفوعة الاميبا مع علامات تشير صلي الظهارية التفاعلات المباشرة ممكن. في هذه المقالة، ونحن تصف بالتفصيل كيف تزرع الخلايا الظهارية والنواشط، تحصد والتلاعب بها لدراسة التفاعلات المضيف الممرض وعواقبها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنشاء وصيانة E. الثقافات نسج
- تنمو axenically (خال تماما من جميع الكائنات الأخرى تلويث) 1 × 10 5 النواشط من المتحولة الحالة للنسج سلالة HML: IMSS استنساخ A 18 في 16 × 125 ملم مع ثقافة أنابيب تفلون قبعات بطانة المسمار (أو 1 × 10 6 النواشط في المتاح T- 25 قارورة) و 15 مل (أو 50 مل في T-25 قارورة) من TYI-S-33 المتوسطة (TYI مرق تستكمل مع 3٪ خليط فيتامين الماس، و 10٪ الحرارة المعطل المصل البقري الكبار، 0.5 وحدة دولية / مل البنسلين و 35 ميكروغرام / مل الستربتوميسين) 19 في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- النواشط الحصاد خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي عادة في 48-96 ساعة فترات (الشكل 1) بواسطة تقشعر لها الأبدان أنابيب الثقافة لمدة 5-10 دقيقة في حمام الماء المثلج للافراج النواشط تعلق على أنبوب الثقافة الزجاج.
- نقل الثقافة في أنبوب مخروطي الشكل وعكس ذلك عدة مرات لتفريق سلليرة سورية. تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (غرفة نيوباور)، ونقل على اللقاح في أنبوب الثقافة التي تحتوي على TYI الطازجة-S-33 متوسطة.
- استخدام أعداد قليلة من الأميبا لفترات حضانة أطول (~ 3 × 10 5 خلايا ل~ 5 أيام) وعدد أعلى لفترات أقصر (~ 1 × 10 6 خلايا ل~ 1 اليوم). في حين عد قائح تكون مرغوبة والثقافات التي أنشئت أصبح يمكن التنبؤ بها بحيث كميات تقدر ب قائح مجدية.
- عاير كمية النواشط لتحسين أرقام الخلية لكل تجربة.
- الحفاظ على الثقافة مكررة موازية لديك نسخة احتياطية في حالة تلوث غير مقصود أو أنبوب الكسر.
- أنابيب الغطاء بإحكام واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية في 5 ° إمالة الزاوية الأفقية.
- تحقق الثقافات عن طريق التفتيش البصري بانتظام، إذ أن النمو المفرط للثقافة قد تحتوي على العديد من الخلايا هي lysed.
2. إنشاء وصيانة الثقافة MDCK </ ع>
- تنمو MDCK (مدين داربي الناب الكلى) الخلايا النوع الأول (مقاومة عالية) في المتاح T-75 قوارير مع 10 مل من وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع البنسلين (100 وحدة دولية / مل)، الستربتوميسين (100 ملغ / مل)، الأنسولين (0.08 U / مل) و 10٪ مصل العجل الوليد في جو ترطيب 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء في 37 درجة مئوية.
- لتقسيم الخلايا، والتحقق منها على مجهر مقلوب. تقسيم الخلايا عندما تكون ~ 85-100٪ متموجة.
- استخدام الشافطة فراغ في غطاء العقيمة والمعقمة ماصة باستير الزجاج لإزالة وسائل الإعلام من الثقافة. لتجنب كشط الخلايا، بدوره القارورة رأسا على عقب وسائل الإعلام نضح من الزاوية السفلي.
- الاستغناء 10 مل من برنامج تلفزيوني prewarmed (140 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 ملي KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 7.4) إلى T-75 قارورة (5 مل في حالة وجود T-25 قارورة ) وصخرة بلطف القارورة لغسل الخلايا. إزالة برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط. مطلوب الغسيل واسعة منذ مصل يمنع التربسين.
- الاستغناء 1.5 مل من 0.05٪ التربسين إلى T-75 قارورة (لT-25 قارورة استخدام 0.5 مل) وبلطف صخرة قارورة لتغطية طبقة الخلايا مع التربسين.
- احتضان لمدة 5-10 دقيقة في الحاضنة (الوقت المحدد يعتمد على النشاط التربسين).
- التحقق من وجود مفرزة الخلية من خلال عقد القارورة ضد الضوء والبحث عن الخلايا التي تتدفق. ويمكن أيضا مفرزة خلية (خلايا مدورة) أن يتم التحقق باستخدام المجهر. في كثير من الأحيان، والخلايا الافراج أسرع مع ذلك، لطيف صفعة سريعة إلى جانب القارورة.
- إضافة 15 مل من DMEM تستكمل إلى T-75 قارورة (5 مل لT-25 قارورة). الخلايا resuspend pipetting صعودا وهبوطا 4 أو 5 مرات.
- لنشر الخلايا، تمييع تعليق خلية 01:05 مع DMEM تستكمل الطازجة. ويمكن أيضا تحديد عدد الخلايا في هذه المرحلة باستخدام عدادة الكريات ولكن هذا عادة ما يكون ضروريا فقط إذا تقسيم الخلايا إلى صيغ خاصة لبعض المقايسات.
3. إعداد أتروفة إجمالي لست]
- فصل النواشط من مكعبأنابيب LTURE بواسطة تقشعر لها الأبدان الأنبوب لمدة 5-10 دقيقة في حمام الماء المثلج. نقل جو معقم و مطهر الثقافة في أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 360 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل بعناية طاف عن طريق الترقيد، إضافة PBS الجليد الباردة إلى بيليه، عكس الأنبوب عدة مرات لتفريق الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 360 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة كل آثار TYI-S-33 متوسطة.
- تحديد عدد النواشط باستخدام عدادة الكريات.
- ليز النواشط قبل تجميد أذاب دورات. الأداة الإضافية تجميد اللقاح يقاس من النواشط (600،000 النواشط / مل) المخفف في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة، في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة. تجميد العينة في 4 درجات مئوية ودوامة بقوة. تكرار تجميد والذوبان 3 مرات لاستكمال تحلل الخلية.
- تنشيط البروتياز الموجودة في لست] مع 0.02٪ β-المركابتويثانول.
4. إعداد أتروفة يفرز المنتجات
- تنفيذ الخطوات 3،1-3،2.
- حددعدد الخلايا وقدرتها على البقاء في هذه المرحلة باستخدام عدادة الكريات وتطبيق اختبار التريبان الأزرق الاستبعاد 20:
- تمييع 9 × 10 6 النواشط في 3 مل PBS الجليد الباردة والخلايا نقل إلى أنبوب 50 مل المخروطية. يستغرق 10 ميكرولتر من هذا التعليق وإضافة 1 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق محلول المخزون ودرجة الحموضة 7.2.
- استخدام غرفة نيوباور لحساب الخلايا في تضخم منخفضة.
- حساب كافة الخلايا وفصل عدد من الخلايا الزرقاء، حيث اتخذت خلايا الصبغة الزرقاء حتى ويجب النظر القتلى.
- حساب النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة عن طريق قسمة عدد من خلايا قابلة للحياة من العدد الكلي للخلايا وضرب الناتج في 100.
- نقل أنبوب مخروطي يحتوي على تعليق أتروفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في 5 ° إمالة الزاوية الأفقية.
- لجمع المنتجات يفرز، أنابيب الطرد المركزي في 360 x ج لمدة 10 دقيقة. استخدام الحقنة ومعقمة وبعناية جمع سوpernatant، وتجنب تلوث العينات مع النواشط من بيليه. القضاء على أي خلايا نقل عن طريق تمرير طاف عبر غشاء خلات السليلوز 0.22 ميكرون. تنشيط البروتياز مع 0.02٪ β-المركابتويثانول.
- لتجاهل التلوث غير المرغوب فيها المفترضة مع جزيئات أفرج عنه من الخلايا الميتة، إعادة تطبيق الاختبار التريبان الأزرق الاستبعاد لبقاء الخلية. وينبغي أن تكون قابلة للحياة وعدد الكلي للخلايا في نفس حصلت عليه في الخطوة 4.2. إذا لم تكن هذه هي الحالة، طاف جمعها قد لا يحتوي فقط يفرز البروتينات ويجب التخلص منها.
5. التفاعل بين الخلايا MDCK مع النواشط، أتروفة لست] أو يفرز المنتجات
- احتضان متموجة الطبقات الوحيدة الخلية MDCK مع النواشط حية (نسبة MDCK إلى الأميبا 1:1)، أتروفة لست] (نسبة MDCK إلى الأميبا من 1:2) أو المنتجات يفرز (نسبة MDCK إلى الأميبا من 1 : 10) عند 37 درجة مئوية لمدة 2 و 30 دقيقة (الشكل 2A).
- غسل الخلايا الظهارية خمس مرات مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة للقضاء على الجزيئات غير منضم أو النواشط.
6. إعداد العينات للالمناعي
- خلايا الثقافة MDCK على coverslips الزجاج معقمة وضعها داخل طبق خلية ثقافة 24 multiwell. تفقد الخلايا على المجهر المقلوب حتى تصل إلى 100٪ من التقاء. ثم استبدال المتوسطة مع 1 مل من الطازجة المتوسطة DMEM تستكمل ونقل لوحة لحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أكثر من ذلك.
- إزالة المتوسطة باستخدام الشافطة فراغ ومعقمة الزجاج باستور ماصة وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الحارة إلى كل بئر. إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار غسل مع برنامج تلفزيوني جديد. والحرص على عدم كشط الخلايا من قاع البئر مع ماصة الزجاج.
- إضافة شروط مختلفة من النواشط المخفف في 1 مل من برنامج تلفزيوني الحارة: النواشط الحية (T)، ومجموع لست] أتروفة (TL) والمنتجات يفرز (SP).
- وضع لوحة الثقافة في الحاضنة لمدة 2 أو 30 دقيقة.
- إعداد شرطين التحكم: واحد اسمه الوقت 0 دقيقة، حيث الخلايا MDCK ينبغي أن لا حضنت مع E. نسج ولكن فقط مع 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ؛ وشرط آخر كما تحكم الأجسام المضادة الثانوية، في هذه الحالة احتضان MDCK مع T، TL أو SP لمدة 2 أو 30 دقيقة وحذفت الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية.
- غسل الخلايا الظهارية خمس مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة للقضاء على الجزيئات غير منضم أو النواشط.
- إصلاح وpermeabilize الخلايا مع 1 مل من الايثانول 96٪ لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- لإزالة الإيثانول، نفذ ثلاثة يغسل سريعة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
- نفذ الخطوات التالية في غرفة رطبة لتجنب تجفيف العينات:
- استخدام أي مربع مسطح المتاحة التي يمكن أن تكون مغلقة ومليئة منشفة ورقية مبللة على عينات التي يمكن وضعها بأمان. على سبيل المثال، يقدم مربع ماصة تلميح فارغ هذا الغرض أيضا.
- داخل غرفة، ووضع طبقة بالتساوي Parafilm وماصة 25 ميكرولتر من كتلةالحل (0.5٪ BSA) جي لكل ساترة.
- اتخاذ coverslips من الآبار مع ملقط غرامة، وإزالة بعناية السائل الزائد من على حافة مع ورقة الترشيح ووضع ساترة في قطرة تحتوي على عرقلة الحل (0.5٪ BSA) مع الخلايا التي تواجه عرقلة الحل. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد مزيج من الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني: الغلوبولين المناعي الماوس المضادة للEhCPADH112 (mα-EhCPADH112؛ تخفيف 1:10) ومفتش أرنب المضادة للZO-1 (pα-ZO-1؛ 1:100 تمييع).
- وضع ورقة جديدة من parafilm في مربع الرطبة وماصة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة حل لكل ساترة.
- رفع لل coverslips من عرقلة الحل، أي يجف السائل الزائد على حواف باستخدام ورق الترشيح، ووضعها في قطرات مع الخلايا التي تواجه حل الأجسام المضادة. احتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- وضع كل ساترة في بئر من 24 multiwell (الجانب الخلية في الأعلى) وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- إعداد مزيج من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في برنامج تلفزيوني: الماعز الفأر مكافحة الغلوبولين المناعي إلى جانب لFITC (1:100 تمييع) والماعز المضادة للأرنب مفتش جانب لTRITC (1:50 تمييع).
- وضع ورقة جديدة من parafilm في مربع الرطبة وماصة 25 ميكرولتر من الحل الأجسام المضادة الثانوية لكل ساترة.
- نقل العينات كما هو الحال في 6.10 واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتجنب التبييض من الأصباغ الفلورية. كرر الخطوة 6.11.1.
- لتلطيخ النووية، واحتضان لمدة 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من 0.05 ملي دابي الحل في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء. كرر الخطوة 6.11.1.
- للحفاظ على الأصباغ الفلورية، ومكان لل coverslips (خلايا لأسفل) في 5 ميكرولتر Vecta درع antifade تصاعد الحل على شرائح المجهر الزجاجية. ختم زلات الغطاء باستخدام طلاء الأظافر لتجنب العينة التجفيف.
- للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على الشرائح فيمربع شريحة المجهر في -20 درجة مئوية.
- تحليل استعدادات المجهري متحد البؤر من خلال أقسام Z-مكدس وXZ-طائرات (الشكل 2A).
7. الحضانة من النواشط مع مثبطات البروتياز أو الجسم المضاد النوعي
- كرر الخطوات من 3،1-3،2. لكل حالة تجريبية، واحتضان 1 × 10 5 النواشط (معلق في 50 ميكرولتر PBS) مع مثبطات الأنزيم البروتيني (1 ملم كاملة و 40 ميكروغرام / مل E-64) أو 30 ميكروغرام ريتوكسيماب ضد EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 لمدة 20 دقيقة على 4 ° C (الشكل 2B). استخدام هذه الاستعدادات لفحوصات شارك في الحضانة كما هو موضح في الخطوة 8.5.
8. قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (TER)
- ثقافة خلايا MDCK على transwell الدعم نفاذية العقيمة (0.4 ميكرون حجم المسام). في المقصورة العليا، ووضع 100 ميكرولتر من تعليق الخلوية وانخفاض في المقصورةوضع 600 ميكرولتر من DMEM تستكمل المتوسطة.
- تحقق من مستوى المتوسطة بشكل دوري. يمكن إضافة المتوسطة الطازجة كما هو مطلوب.
- تفقد الخلايا على مجهر مقلوب حتى تصل إلى 100٪ من التقاء. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
- لتحسين مرفق الخلية (إذا لزم الأمر)، تتوازن المرشحات transwell بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في DMEM قبل إضافة تعليق الخلية.
- تعقيم أقطاب STX2 في غطاء محرك السيارة عن طريق الغمر في الإيثانول ثم في برنامج تلفزيوني العقيمة لمدة 15 دقيقة لكل منهما، تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ربط الأقطاب إلى الظهارية voltohmmeter EVOM وتحديد وضع المقاومة.
- جمع المتوسطة من المقصورة العلوية من كل transwell وبركة لهم. تأخذ 50 ميكرولتر من هذا الخليط وسائل الإعلام ودمجها مع 50 ميكرولتر من النواشط تعليق (1 × 10 5 النواشط في برنامج تلفزيوني)، أو فقط مع برنامج تلفزيوني (السيطرة). استخدام خليط مماثلة لكل transwell.
- إضافة مخاليط إلى الغرفة العليا من كل containin transwellز الخلايا MDCK. وتشمل الظروف التجريبية خلايا MDCK دون النواشط (السيطرة)، والثقافة المشتركة مع النواشط أو مع النواشط المحتضنة مسبقا مع مثبطات الأنزيم البروتيني أو mαEhCPADH112. للقضاء على المقاومة التي يوفرها المرشحات، واستخدام transwells حضنت مع المتوسطة فقط. لكل حالة تجريبية استخدام لا يقل عن ثلاثة transwells.
- على الفور، وقياس TER عن طريق غمس الأقطاب STX2 في كل transwell.
- تأكد من أن القطب يعد يلمس الجزء السفلي من مجلس النواب والتي يتم تغطيتها من قبل القطب أقصر المتوسطة في المقصورة العليا (انظر الشكل 2B).
- تأكد من أن يعقد الأقطاب عموديا في كل مرة. سيؤدي ذلك إلى تحسين استنساخ، بشكل كبير. تجنب نقل أو إمالة الكهربائي خلال القياسات لأن هذا سوف يؤدي إلى اختلاف البيانات.
- وينبغي النظر في هذا القياس قيمة TER الأولي. ثم، مراقبة TER خلال ما يلي30 دقيقة.
- لحساب قيمة TER النهائي، طرح قيمة TER من المرشحات فقط. لمقارنة النتائج من تجارب مختلفة تطبيع كل نقطة البيانات إلى القيم الأولية، مع هذه الى 100٪ (الشكل 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لنجاح E. ثقافة نسج، يجب الوفاء شرطين مهمين: النمو في ظروف ممحوضة والحصاد في مرحلة لوغاريتمي. سابقا، ثقافات E. أنشئت نسج بسهولة بالاشتراك مع أنواع معينة من البكتيريا أو trypanosomatids 22. ومع ذلك، في الوقت الحاضر فإنه من الشائع أن يكون زراعة ممحوضة هذا الطفيلي مما يعني أن subcultivation إلى أجل غير مسمى الأميبات في بيئة خالية من البكتيريا تأييض والفطريات والبروتوزوا، أو خلايا metazoan. بالإضافة إلى ذلك، حصاد النواشط خلال لوغاريتمي في وقت متأخر إلى مرحلة ثابتة في وقت مبكر من النمو أمر حاسم لديك خلايا قابلة للحياة وتكاثر 23. وبالتالي، فمن المهم أن نميز هذه المرحلة عن طريق القياس الكمي للالنواشط على طول عدة أيام وأيضا من خلال دراسة مورفولوجية سليمة وتنقل السريع (الشكل 1).
للدراسات التفاعل، والخلايا الظهارية تحتاج إلى أن تكونفي أحادي الطبقة متموجة لتمثيل الظروف الفسيولوجية التي الأميبا سيواجه عادة في الجسم. العديد من خطوط الخلايا الظهارية، وسهلة لزراعة، متوفرة. في حين أن النظام النموذجي الخلية أكثر الفسيولوجية سوف تجنيها من الأمعاء مثل كاتشو-2 أو T84، وهذه خطوط الخلايا تنمو ببطء بدلا. خط الخلية الأسرع نموا على نطاق واسع التي تم دراستها هي خلايا MDCK 24. هذه الخلايا الظهارية من أصل الكلى وتتميز TER عالية، TJ قوية وسهلة زراعة. وقد استخدم هذا الخط الخلية لعقود لدراسة بيولوجيا الخلية من التقاطعات وتكوين TJ فضلا عن آليات TJ التجميع والتفكيك. لهذه الأسباب، غالبا ما يتم اختيار الخلايا MDCK من قبل الباحثين عند دراسة وظائف TJ. كما استخدمت على نطاق واسع خلايا MDCK كنموذج لدراسة الآليات التي يسببها خلال الأميبية 5،8،10،25-28. في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن وذكرت أن التفاعل من سلالة أنا MDCK الخلايا الظهارية وكاتشو-2 الخلايا المعوية مع لترالأميبا إيف، لست] والمنتجات الأميبا تسبب آثار مماثلة على تكوين TJ وTER 10. وبالتالي، والخلايا MDCK هي نموذج مناسب لدراسة آليات التفاعلات الاميبا-ظهائر. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام عدة E. منتجات نسج (النواشط سليمة، ومجموع لست] أتروفة أو المنتجات يفرز تحصد مثل الثقافة النواشط طاف) أمر حاسم لتقديم معلومات إضافية وذات الصلة حول الجزيئات تشارك في هذه التفاعلات، مثل توافر، طريقة العمل، إفراز، ومشاركة الجزيئات الأخرى والتسبب في مسارات الإشارات.
بينما تصل confluency، الخلايا الظهارية تشكل الاتصالات التي استقرت من قبل TJ وAJ. وتتكون هذه الهياكل بعض الجزيئات التي يمكن تصور باستخدام الأجسام المضادة المحددة في stainings المناعي. على سبيل المثال، في الشكل 3، وتصور الاتصالات الخلوية من قبل الأجسام المضادة ضد علامة TJ ZO-1 ومختبر fluorescently الأحمرإليد الضد الثانوية. كما يمكن أن ينظر إليه، وخلايا جمع على مقربة من تشكيل أحادي الطبقة الكثيفة دون أي حفرة. في هذا الشكل، وقد ملطخة EhCPADH112 المستمدة من الاميبا معقدة باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تم الكشف عنها بواسطة خضراء الضد الثانوية fluorescently المسمى لدراسة التفاعل بين هذا المجمع مع سطح طلائي. وقد تم تطبيق ثلاثة مصادر مختلفة من هذا المجمع لأحادي الطبقة الظهارية: النواشط الحية (T)، ومجموع لست] أتروفة (TL) والمنتجات يفرز (SP). لافت للنظر، في جميع الحالات، وشارك في توطين EhCPADH112 مع ZO-1 يمكن ملاحظة (الشكل 3، والسهام)، مشيرا إلى أن هذا المجمع قد تكون هناك حاجة لتسهيل E. اختراق نسج في أحادي الطبقة الظهارية.
على الرغم من أن هذا التفاعل يمكن أن يكون بالفعل لوحظ في أقرب وقت 2 دقيقة بعد الاميبا الظهارية خلية الاتصال، لا يتأثر طبقة الخلايا حتى الآن من هذا التفاعل منذ تلطيخ ZO-1 لا تزال تبدو جontinuous. هذا يتغير تماما بعد مرات الحضانة يعد كما هو مبين في الشكل (4). هنا، وقد أخذت صور بعد 30 دقيقة من التعرض لمصادر ثلاثة EhCPADH112 مختلفة. هو تصور واضح للتعطيل من قبل TJ متقطع ZO-1 تلطيخ في حدود الخلية (الشكل 4، والسهام)، مع تأثير أكثر وضوحا التي تحدث في الخلية MDCK في اتصال مع تي أو TL. على النقيض من ذلك، ويحصل على ZO-1 المنضوية وينظر في حويصلات داخل الخلايا. بالضبط التعاون مع التعريب إما TJ أو AJ على طول أغشية الخلايا الجانبية لا يمكن تمييزها من خلال النظر فقط على رأس أحادي الطبقة ولكن بدلا من الحصول على "الجانب" عرض جهات الاتصال الخليوي 29. متحد البؤر المجهري بالليزر يسمح مثل هذا الرأي على طول محور XZ كما هو موضح في الشكلين 3 و 4 أدناه كل عرض س ص. تظهر هذه الصور بيانا واضحا ما إذا كانت البروتينات شارك توطين مع TJ في الجزء الأكثر قمية من الغشاء الجانبي أو إذا كانت تقع بدلاأدناه TJ TJ أعلاه أو في الغشاء القمي. في الشكل 3 (السهام)، وهو بالضبط شارك في توطين المعقدة EhCPADH112 مع ZO-1 يمكن ملاحظتها، وكشف بوضوح TJ كمكان عمل لهذا العامل الفوعة. في المقابل، كما E. غزو نسج تقدما (30 دقيقة للتفاعل) في ظهائر، اخترقت EhCPADH112 نحو الفضاء بين الخلايا كما تلطيخ على طول الغشاء الجانبي أظهرت (الشكل 4، النصال). في ورقتنا الأخيرة، يسمح هذا الأسلوب لنا أن نميز بين TJ وAJ لأن هذا المجمع فقط شارك المترجمة مع TJ علامات occludin وclaudin-1 ولكن ليس مع AJ علامة β-catenin في 2 دقيقة من التفاعل 10.
استيعاب مكونات TJ، كما يمكن أن يرى في stainings المناعي في الشكل 4، وعادة ما يرافقه فقدان وظيفة الحاجز الذي يمكن أن تقاس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (TER). TERيعكس تدفق أيون عبر أحادي الطبقة الظهارية، ويمكن قياسها باستخدام الأقطاب كما هو مبين في الشكل 2B. عندما أحادي الطبقة ليست حتى الآن شكلت تماما أو تعطلت بسبب العظة خارج الخلية، ويدل على التدفق الحر للأيونات عبر طبقة الخلايا بواسطة TER منخفضة. وقد تم قياس TER عنصر تحكم أحادي الطبقة متموجة أنه لم يكن على اتصال مع منتجات الأميبا أو الطبقات الوحيدة في اتصال مع النواشط (الشكل 5). الاتصال الطفيلي تتعطل وظيفة حاجز الظهارية المشار إليها بواسطة قطرة TER من 90٪ بالمقارنة مع الطبقات الوحيدة السيطرة. للتحقيق في الآليات التي تؤثر على وظيفة النواشط الحاجز، ونحن قبل المحتضنة-النواشط مع الأجسام المضادة ضد EhCPADH112 لمنع التصاق هذا المجمع أو مع مثبطات الأنزيم البروتيني، لمنع نشاط بروتين من هذا المجمع وغيرها من البروتياز مهمة لتلف الخلايا المستهدفة. أدى كل من العلاجات إلى انقلاب كامل تقريبا من انخفاض TER، مما يشير إلى أن كلا من بروتين النشاط واللصق الخصائص هي عوامل الفوعة هاما من هذا المجمع خلال E. غزو نسج.
الرقم 1. منحنى النمو نموذجية من يزرع axenically E. النواشط للنسج. قائح من 2 × 10 5 النواشط من E. نسج HMI-IMSS استنساخ وكانت تزرع في أطباق 6 جيدا مع TYI-S-33 متوسطة وبعد كل 24 ساعة أرقام الخلية كانوا مصممين باستخدام hematocytomer. تم رصد نمو الخلايا بواسطة المجهر الضوئي ومورفولوجيا الخلايا المتزايد هو مبين في اللوحة العليا. تم رصد مبلغ لمدة 6 أيام النواشط (د) و تم التخطيط القيم في الرسم البياني أدناه. تمثل البيانات المتوسط والخطأ المعياري للمتوسط من ثلاثة قياسات مستقلة. شريط = 10 ميكرون./ www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تمثيل تخطيطي من التفاعلات بين الخلايا MDCK وظروف مختلفة من E. نسج. أ) ظروف مختلفة من E. وترد نسج: النواشط الحية (T)، ومجموع لست] النواشط (TL) والجزيئات التي يفرزها النواشط في المتوسط (SP). كان يعاير أي حالة تجريبية لمدة 2 دقيقة و 30 من الحضانة مع الخلايا متموجة MDCK. بعد الحضانة، والخلايا MDCK غسلها تماما لإزالة النواشط أو الجزيئات الطفيلية غير منضم. ثم تم تجهيز العينات للفحوصات المناعي، ويعمل mαEhCPADH112 وpαZO-1 antibodالمنشأ للمشاركة في توطين EhCPADH112 معقدة الطفيلية وعلامة TJ ZO-1، على التوالي. في وقت لاحق، تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية أنواع محددة إلى جانب لfluorochromes مختلفة للكشف عن البروتينات سواء عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. B) إضافة النواشط فقط أو النواشط المحتضنة مسبقا مع mαEhCPADH112 أو مثبطات الأنزيم البروتيني لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في المقصورة العليا من transwells تحتوي على خلايا MDCK متموجة. تم رصد TER من الخلايا الظهارية باستخدام القطب STX2 متصلة voltohmeter EVOM، خلال 30 دقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. توطين EhCPADH112 في TJ الطبقات الوحيدة MDCK. كانت الخلايا MDCK incuهدأ مع النواشط الحية (T)، ومجموع لست] النواشط (TL) والجزيئات التي يفرزها النواشط في المتوسط (SP) لمدة 2 دقيقة. اللوحة العليا: على النقيض من الصور المرحلة من الخلايا MDCK. وقد تم تحديد EhCPADH112 وZO-1 البروتينات بواسطة mαEhCPADH112 وpαZO-1 الاجسام المضادة ثم مع FITC وTRITC الثانوي الأجسام المضادة، على التوالي. كانت ملطخة النوى مع دابي. السهام: البروتين التعريب في حدود الخلية. النصال في XZ-طائرات: البروتين التعريب في TJ. شريط = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تدخيل EhCPADH112 إلى خلايا MDCK. وحضنت الخلايا MDCK مع النواشط الحية (T)، النواشط مجموع لست] (TL) والجزيئات التي يفرزها النواشط في المتوسط (SP) لمدة 30 دقيقة. اللوحة العليا: على النقيض من الصور المرحلة من الخلايا MDCK. وقد تم تحديد EhCPADH112 وZO-1 البروتينات بواسطة mαEhCPADH112 وpαZO-1 الاجسام المضادة ثم مع FITC وTRITC الثانوي الأجسام المضادة، على التوالي. كانت ملطخة النوى مع دابي. السهام: البروتين التعريب في حدود الخلية. النصال في XZ-طائرات: البروتين التعريب في الغشاء الجانبي (السهام). شريط = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. E. نسج عبر EhCPADH112 يدفع تعطيل حاجز الظهارية. حضنت الطبقات الوحيدة MDCK مع النواشط الحية(T) أو تي المحتضنة مسبقا مع مثبطات الأنزيم البروتيني (PI) أو mαEhCPADH112 الأجسام المضادة (α) لمدة 30 دقيقة وجرى تقييم TER في أوقات المشار إليه. تم تطبيع TER وفقا لقيمة الأولية لكل transwell (~ 3،200 Ω · سم 2). وتتمثل الوسائل والأخطاء المعيارية وسائل لكل نقطة زمنية. تم إجراء التحليل الإحصائي مع GraphPad بريزم 5 البرمجيات باستخدام اختبار ANOVA في اتجاه واحد. *** P <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل دراسة في المختبر التفاعلات المضيف الممرض خلال العدوى الظهارية بواسطة E. نسج، لا بد من العمل مع الثقافات الراسخة في كل من الخلايا الظهارية والنواشط. على سبيل المثال، سابقا، E. وعادة ما أنشئت الثقافات نسج بالتعاون مع أنواع معينة من البكتيريا أو trypanosomatids 22،23. ومع ذلك، وشارك في زراعة E. الثقافات نسج يأتي بنتائج عكسية لدراسة التفاعلات المضيف الممرض لأن لا يمكن أن تعزى الآثار الملاحظة على خلايا المضيف بشكل لا لبس فيه إلى ameobas ولكن يمكن أن يكون بدلا من تأثير الخلايا المزروعة المشترك. وبالتالي، ثقافة axenical من E. نسج أمر مرغوب فيه لفحص التفاعلات محددة المضيف الممرض. يصف البروتوكول تنص على كيف يمكن لمثل زراعة ممحوضة من E. لا يمكن أن يتحقق نسج خصيصا لاستغلال مثل هذه الثقافات للدراسات العدوى. بالإضافة إلى ذلك، فإن توقيتالحصاد من E. نسج أمر بالغ الأهمية أيضا. E. ينصح الحصاد للنسج خلال المراحل المتأخرة من النمو المتسارع لضمان تحقيق عائد مرتفع من الخلايا مع بقاء عالية.
من ناحية أخرى، أحادي الطبقة راسخة من الخلايا الظهارية هو أيضا إلزامية للحصول على نتائج قابلة للتكرار. لمضاهاة أحادي الطبقة الظهارية ضيقة من الناحية الفسيولوجية، والحاجة الخلايا المستزرعة أن تستخدم في التوقيت الصحيح. أحادي الطبقة لابد من تشكيل تماما من دون أي ثقوب. وعلاوة على ذلك، وتشكيل الصحيح للTJ وAJ يتطلب بعض الوقت بعد إقامة اتصالات الخلية. عادة، الخلايا الظهارية هي من تحول دون اتصال، وهذا يعني أن الخلايا المتكاثرة في وقف أحادي الطبقة متموجة، حتى أنه من الأفضل عادة لإعطاء خلايا يوم آخر من النمو. ومع ذلك، هذا لا ينبغي أن يتم توسيع هذا منذ تثبيط الاتصال ليست لأجل غير مسمى وربما الخلايا في مرحلة البدء في اكتسى بعضها البعض. إذا لوحظ هذا سيكون من الضروري لتقسيم القرص أوالخلايا ارض وعدم استخدامها في المقايسات. يتم التحكم في تشكيل الطبقات الوحيدة الظهارية ضيق أفضل من خلال قياس TER. ومع ذلك، وهذا يتطلب النمو في المرشحات transwell، والتي هي مكلفة نوعا ما. لوضع العين لأحادي الطبقة جيدة قد يكون من المفيد لالمجرب عديم الخبرة لمقارنة نمو الخلايا في شكل زراعة نفسه بعد نشر أعداد الخلايا المختلفة.
توقيت المضيف الطفيلي التفاعل الاختبار هو عامل حاسم آخر. بعد 2 دقيقة من التفاعل، ويمكن ملاحظة أي ضرر الظهارية ولكن كان التفاعل من EhCPADH112 مع جزيء TJ ZO-1 واضحة بالفعل. ومع ذلك، وبعد 30 دقيقة التفاعل، لوحظ الضرر الظهارية شديدة كما يتضح من TJ التفكيك وقطرة من تير (10 وهذه الدراسة). وتشير هذه البيانات إلى أن تفاعل لاصقة في وقت مبكر مع الجانب الظهارية القمي هو ضروري لتخفيف والاتصالات تسمح تغلغل الجزيئات الأخرى مثل البروتياز التي ثم المساهمة فيتدهور TJ أخرى، AJ وجسيم رابط الجزيئات. تركيز البروتينات النواشط مهم أيضا. من المذكرة، ويمكن ملاحظة نتائج مختلفة عند تطبيق النواشط حية أو مجرد لست] أو المنتجات يفرز من E. نسج. وقد ثبت الحصة النسبية من النواشط الخلايا الظهارية في السابق 10 وحتى عندما كانت نسبة MDCK-يفرز إلى المنتجات عن طريق الاميبا عالية (1:10)، وكان الضرر الظهارية يست شديدة كما. وهذا يدل ليس فقط أن تركيز بروتين الفوعة واحد أمر بالغ الأهمية ولكنها أيضا يمكن أن يكون التفاعل بين مختلف العوامل التي تؤدي إلى الضرر الظهارية فعالة للسماح الغزو السريع لالأميبا. على سبيل المثال، أبرزت مجموعة Chadee على أهمية البروتيني آخر المستمدة من الأميبا، EhCP5، للحصول الضرر الظهارية 16. يبدو من المرجح أن التفاعل بين عوامل الفوعة في الجسم الحي هو مطلوب للحث على الأميبية وأن التفاعلات في عداد المفقودين بسبب inhibitioن من بروتين واحد قد تكون مسؤولة عن حقيقة أنه في معظم الحالات هي عدوى هادئة. في هذا الصدد، من المهم أيضا أن نذكر أن منتجات الظهارية مثل mucins مهمة للوقاية من العدوى. على وجه الخصوص، mucin2 خروج المغلوب الفئران هم أكثر عرضة للتغييرات التي يسببها TJ EhCP5 وإصابة 16. وبالتالي، تحتاج أيضا تعديلات على الجانب الظهارية التي سينظر فيها لتقييم الأميبا الغازية.
واحد الحد من التكنولوجيات الهامة للكشف عن وصفها المشارك التعريب هو أنه لا يثبت بشكل لا لبس فيه على التفاعل المباشر. في هذه الحالة، يمكن بوساطة التفاعل المشترك توطين أو أيضا بروتين آخر هو مجرد أن لا تصور. للكشف عن التفاعل المباشر، سيكون من الضروري لإنتاج المؤتلف الموسومة (مثل ضريبة المبيعات أو 10xHis) البروتينات وأداء مناعي لعلامة واحدة وطخة غربية لأخرى. على أي حال، stainings المناعي لديها ميزة الكشف عن إكساءموقع الخلوية قيراط من بروتين معقد وإعطاء المجرب فكرة عن البروتينات التي يجب اختبارها في مثل هذا التفاعل في المختبر فحص. عيب آخر هو أن هناك عدد قليل من الأجسام المضادة الاميبا محددة الوحيد المتاح. وبالتالي، إذا كان أحد يريد أن دراسة بروتينات معينة الأميبا في مثل هذه الدراسات التفاعل، فإنه من المرجح أن تتطلب توليد الأجسام المضادة. ومع ذلك، إذا كانت الأجسام المضادة المتاحة، الأساليب المذكورة يمكن تطبيقها على دراسة أهمية البروتينات الاميبا الأخرى (أو ملزمة يفرز سطح) عن التفاعلات المضيف الممرض.
وتصف هذه الورقة نموذجا سهلة للكشف عن التعاون التعريب والتفاعلات بين الجزيئات للمضيف والطفيليات. المعرفة المكتسبة من هذه التجارب خلية القاعدة يمكن تطبيقها في نماذج العدوى في الجسم الحي باستخدام الهامستر أو الفئران لتأكيد أهمية الفسيولوجية للغزو من قبل المضيف الطفيلي. ثم يمكن استخدام هذه البيانات لتطوير العلاج رواية ستراtegies.
باختصار، نحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لزراعة E. نسج والخلايا الظهارية للاستخدام في الدراسات التفاعل المضيف الممرض، على وجه الخصوص، المقايسات التي تسمح التقييم المشترك التعريب وTJ التفكيك. توقيت الثقافات فضلا عن أن كل مقايسة أمر حاسم لضمان استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها. بينما توقيت الثقافات يمكن أن تتأثر متفاوتة عدد الخلايا نشرها، توقيت التجارب نفسها يعتمد على نوع الفحص ونوع من البروتينات التحقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I.
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M.
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H.
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S.
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
