Summary
人感染阿米巴导致阿米巴病，腹泻在热带国家的重要原因。感染是通过与肠上皮细胞病原体相互作用启动，引起的细胞 - 细胞接触的开口，因而腹泻，有时接着肝感染。本文提供了一个模型来评估早期的宿主 - 病原体相互作用，以改善我们的阿米巴病发病机制的认识。
Abstract
阿米巴是人类阿米巴病的病原体，腹泻和肝脓肿在热带国家的重要原因。感染是通过与肠上皮细胞的病原体的相互作用启动。这种相互作用导致细胞间的结构，例如紧密连接（TJ）的中断。 TJ保证上皮细胞层，以宿主组织从肠腔中分离的密封。最近的研究提供的证据表明由寄生蛋白EhCPADH112中断TJ的是大肠杆菌的先决条件阿米巴入侵是伴随着上皮屏障功能障碍。因此， 大肠杆菌中参与TJ拆卸分子机制的分析阿米巴入侵是非常重要的改善我们的阿米巴病发病机制的认识。本文介绍了一个简单的模型，它允许初始宿主 - 病原体相互作用的评估和寄生虫侵袭潜能。要分析的参数包括Transepithelial电阻，EhCPADH112与上皮细胞表面的受体，改变表达与上皮交界标记和上皮细胞内的寄生虫分子的本地化本地化互动。
Introduction
阿米巴是一种单细胞原生动物负责人阿米巴病，肠道感染引起炎症和腹泻。E.阿米巴感染高达50亿人每年，但只有约10％的感染者制定相关的阿米巴病1，症状。感染发生于对含有大肠杆菌污染的食物或水摄入阿米巴包囊。在肠道内，囊肿产生坚持结肠粘蛋白和增殖2现场滋养体。滋养体通常形成是通过粪便排出体外囊肿。在其他情况下和未知的原因，滋养体打破肠上皮细胞层和侵入皮下组织。在最坏的情况下，他们进入血流而影响其他器官，如肝3。
打破上皮屏障需要保持细胞加入transmembranal上皮结构的破坏。上皮细胞触点由根尖连接复合体组成的紧（TJ）形成和粘合连接（AJ）和桥粒4。最顶端的交界处TJ，因此，它们是由E.冒犯的第一阻挡主机入侵期间组织阿米巴和一些其他病原体。 TJ是由transmembranal粘附受体如claudins，occludin和连接粘附分子（JAM）从事均聚物或嗜异性的相互作用与所述相邻小区的受体。它们是由紧密连接（ZO）系列连接粘附受体与肌动蛋白细胞骨架，以提供进一步的机械强度上皮的支架分子在细胞内的约束。 TJ负责密封肠组织从肠腔，防止过多的水分和溶质渗漏。因此，后TJ由寄生虫破坏，组织被入侵。E.阿米巴分泌一些分子，如：（ⅰ）涉及变形虫的粘附性尔格等细胞5; （ii）在胞吐作用参与杀伤宿主细胞的膜活性的因素，例如被称为离子通道形成肽amoebapores 6,7;及（iii）降解细胞外基质蛋白并介导组织崩解5,8,9蛋白酶。
半胱氨酸蛋白酶EhCP112和粘附分子EhADH112，它们一起组成EhCPADH112复杂两种E.阿米巴毒性蛋白，在TJ 10的拆装发挥了重要作用。现场滋养体，他们的总裂解液和分泌产物诱导的上皮屏障的TJ复杂和功能障碍的分子变化。在这项研究中，它表明，EhCP112和EhADH112与occludin和紧密连接蛋白-1的蛋白质，导致内在化和细胞蛋白的降解相互作用，从而有利于E。通过旁细胞途径阿米巴入口。
我们的数据和那些ØF其他群体11-17强烈建议特定的宿主-病原体相互作用，使寄生虫侵袭的必要性。揭开这些相互作用的分子基础是最重要的一个更好的了解阿米巴病的发病机制。 TJ由滋养体，其特征在于，增加细胞旁渗透性选择性的干扰，可以通过在跨上皮电阻下降（TER）来测量。寄生蛋白对宿主上皮细胞的转移可以通过免疫荧光染色和共聚焦激光显微镜，也可以揭示共定位阿米巴毒力因子的上皮交界性标志物，指示可能的直接的相互作用的方法来确定。在这篇文章中，我们将详细介绍上皮细胞和滋养体如何栽培，收获和操纵研究宿主 - 病原体相互作用及其后果。
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Protocol
1，E.建立和维护阿米巴文化
- 成长axenically（完全免费所有其他污染微生物）1×10 5滋养体阿米巴株HML的：IMSS克隆18在16 x 125毫米培养管聚四氟乙烯内衬螺旋盖（或1×10 6滋养体在一次性的T- 25烧瓶中）和15毫升（或50毫升缇-S-33培养基中的T-25烧瓶中）（缇肉汤补充有3％的钻石维生素混合物，10％热灭活的成年牛血清，0.5国际单位/毫升青霉素和35微克/毫升链霉素）19在培养箱中在37℃下
- 在通常的对数生长期在48-96小时的时间间隔（ 图1）通过冷却的培养管中5-10分钟，在冰-水浴中以释放附着在玻璃培养管滋养体收获滋养体。
- 转让文化成锥形管和颠倒几次驱散CELLS。确定细胞数用血细胞计数（纽鲍尔室）和接种物转移到含有新鲜缇-S-33培养基中培养管。
- 使用低号变形虫更长的潜伏期（〜3×10 5细胞〜5天）和更短期间内有较大的数字（〜1×10 6细胞〜1天）。虽然计数接种是可取的，建立文化变得可预测的，这样接种的估计量是可行的。
- 滴定滋养体的量，以优化细胞数为每一个实验。
- 保持平行重复的文化有一个备份，以防不慎污染或管破损。
- 管帽紧紧地和孵化它们在37℃的水平倾斜角度5°。
- 检查文化通过视觉检查定期，因为文化的过快增长可能包含许多裂解细胞。
2，建立MDCK文化和维护</ P>
- 生长的MDCK（的Madin Darby狗肾细胞）的I型（高电阻），在一次性的T-75培养瓶中，用10ml补充有青霉素（100国际单位/毫升），链霉素（100毫克/毫升）的DMEM培养基中，胰岛素（0.08 U /毫升）和10％新生小牛在5％CO 2和95％空气的潮湿气氛中，在37℃血清
- 要拆分的单元格，检查他们在倒置显微镜。拆分单元格时，他们〜85-100％汇合。
- 使用真空吸气器在无菌罩和无菌的玻璃巴斯德移液管从培养介质中删除。为了避免刮细胞，转瓶倒过来，抽吸介质从底部角落。
- 分配10毫升预热的PBS（140 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10毫米的Na 2 HPO 4，1.8 mM的KH 2 PO 4，pH 7.4）中的导入T-75烧瓶（5毫升在T-25烧瓶中的情况下），并轻轻摇动烧瓶以洗涤细胞。真空抽吸去除PBS。彻底清洗是必需的，因为血清抑制胰蛋白酶。
- 分配1.5毫升0.05％胰蛋白酶的导入T-75烧瓶（对于T-25烧瓶中，用0.5ml）中，并轻轻摇动烧瓶以覆盖细胞层，用胰蛋白酶。
- 孵育在孵化5-10分钟（具体时间取决于胰蛋白酶的活性）。
- 检查细胞脱落握住瓶对着光，寻找流动的细胞。细胞脱离（四舍五入细胞）也可使用显微镜检查。通常情况下，细胞释放速度更快的快速，温和的巴掌烧瓶的一侧。
- 加15毫升补充的DMEM对T-75烧瓶（5毫升一T-25烧瓶中）。移液器向上和向下4〜5次重悬细胞。
- 传播的细胞，淡化细胞悬液1:5辅以新鲜的DMEM。在这一点上使用血球细胞数也可确定，而这通常是只有必要的，如果分裂细胞分化成特殊格式的某些测定法。
滋养体的总裂解液3。准备
- 从铜分离滋养体lture管通过冷却所述管在冰 - 水浴中5〜10分钟。转移培养无菌成锥形管中并离心分离，在360×g离心10分钟，在4℃下小心弃去上清液通过倾析，加入冰冷的PBS至沉淀，颠倒试管几次，在360×g离心10分钟，再以分散细胞并离心。重复此步骤两次，以除去缇-S-33介质的所有痕迹。
- 使用血细胞计数器确定滋养体数目。
- 裂解滋养体通过冻融。卡扣冻结滋养体的测定接种物（600000滋养体/毫升）稀释，在冰冷的PBS中，在液氮中1分钟。解冻的样品在4℃和涡大力。重复冻融3次，以完成细胞裂解。
- 激活存在于溶胞产物用0.02％β-巯基乙醇的蛋白酶。
4，准备滋养体分泌的产品
- 执行步骤3.1至3.2。
- 确定使用血细胞计数器，并应用锥虫蓝排斥试验20细胞数目和生存力在这一点：
- 稀9×10 6个滋养体在3毫升冰冷的PBS和转移细胞到50ml锥形管中。取10微升此悬浮液，加入1微升0.4％台盼蓝储备液pH值7.2。
- 使用纽鲍尔室计数细胞在低倍镜下。
- 计数所有的细胞和分离的蓝色细胞的数量，因为蓝色的细胞已占用的染料，必须予以考虑死。
- 通过将活细胞的数目通过细胞的总数并乘以100计算出的存活细胞的百分比。
- 转移的锥形管含有滋养体悬浮到培养箱中在37℃下进行2小时的倾斜水平角度5°。
- 收集的分泌产物，离心管在360×g离心10分钟。使用一次性无菌注射器，仔细收集苏pernatant，避免样品污染的沉淀滋养体。通过使上清液通过0.22μm的醋酸纤维素膜消除任何转移的细胞。激活蛋白酶与0.02％β-巯基乙醇。
- 要放弃假定不需要的污染与死亡细胞释放的分子，重新应用台盼蓝排斥试验细胞活力。如在步骤4.2获得的细胞的存活和总数量应该是相同的。如果不是这样的情况下，所收集的上清液可以不仅含有分泌的蛋白质，应该被丢弃。
MDCK细胞5。与滋养体，滋养体裂解物或分泌产品互动
- 融合培养MDCK细胞单层用活滋养体（1:1的MDCK对阿米巴比），滋养体裂解液（1:2的MDCK对阿米巴比）或分泌的产品（1一MDCK对阿米巴比例：10），在37℃下2分钟和30分钟（ 图2A）。
- 用冰冷的PBS洗涤上皮细胞5次，以消除未结合的分子或滋养体。
6，样品的制备用于免疫荧光
- 培养MDCK细胞在无菌盖玻片置于24多孔细胞培养皿内。检查在倒置显微镜的细胞，直到它们达到汇合的100％。然后，更换培养基，用1ml新鲜辅以DMEM培养基中，并在板转移到37℃培养箱中放置24小时以上。
- 使用真空吸气器和一个无菌的玻璃巴斯德移液管取出培养基，并加入1毫升温的PBS中，以每个孔中。除去PBS，重复用新鲜PBS洗。小心不要从井与玻璃吸管底部刮细胞。
- 添加滋养体稀释1毫升温PBS的不同情况：现场滋养体（T），滋养体总裂解液（TL）和分泌的产品（SP）。
- 将培养板在培养箱中培养2或30分钟。
- 准备两个控制条件：命名时1 0分，其中MDCK细胞应该不会孵育E.阿米巴但只用1毫升温的PBS;和其他条件如二抗控制，在这种情况下温育的MDCK带T，TL或SP 2或30分钟，并省略孵化与初级抗体。
- 用冷PBS洗上皮细胞五次，以消除未结合的分子或滋养体。
- 固定和透化的细胞用1毫升96％乙醇中30分钟，在-20℃下
- 除去乙醇，执行三个快速洗涤用1毫升的PBS在室温下。
- 执行在潮湿的室内下列步骤，以避免样品的干燥：
- 使用任何可用的扁平盒子，可以封闭并且填充有湿纸巾在其上的样品可以被安全地放置。例如，一个空的枪头盒为这个目的很好。
- 内室，均匀地将一个封口膜层和吸管25微升块ING液（0.5％BSA）为每个盖玻片。
- 取盖玻片出井用细镊子，小心地从边缘除去多余的液体用滤纸，把盖玻片到含有封闭液（0.5％BSA）中与细胞面临的封闭溶液的下降。孵育样品1小时，在室温下进行。
- 制备初级抗体的混合物在PBS：IgM的鼠抗EhCPADH112（Mα-EhCPADH112; 1:10稀释）和IgG兔抗ZO-1（Pα-ZO-1; 1:100稀释）。
- 将封口膜的全新片在潮湿的盒子和吸管25微升的每个盖玻片抗体的解决方案。
- 从封闭溶液提起盖玻片，晾干任何多余的液体在使用滤纸的边缘，并将其放置在与细胞面临的抗体溶液的液滴。过夜孵育样品在4℃下
- 把每个盖玻片到24多井的井（单元侧的顶部），加1毫升的PBS。
- 制备在PBS中的荧光第二抗体的混合物：山羊抗小鼠IgM抗体结合到FITC（1:100稀释）和山羊抗兔IgG抗体结合到TRITC（1:50稀释）。
- 将封口膜的全新片放入潮湿箱和吸管25微升每个盖玻片的二级抗体溶液中。
- 转移样品在6.10和孵育1小时，在室温下在黑暗中以避免荧光染料的褪色。重复步骤6.11.1。
- 对核染色，孵育3分钟，加入200μl0.05mM的DAPI溶液在室温和避光。重复步骤6.11.1。
- 为了保护荧光染料，将盖玻片（细胞面朝下）插入5微升Vecta盾抗淬灭的显微镜玻片安装解决方案。使用指甲油，避免样品干燥密封盖玻片。
- 对于长期储存，保持幻灯片的在-20℃下的显微镜载玻片盒
- 通过Z堆叠部分和XZ-平面（ 图2A）分析制剂通过共聚焦显微镜。
7，培养滋养体与蛋白酶抑制剂或特异性抗体
- 重复步骤3.1至3.2。对于每种实验条件下，培养1×10 5个滋养体（重悬浮于50μlPBS中）与蛋白酶抑制剂（1mM的完整和40微克/毫升的E-64）或抗EhCPADH112（mαEhCPADH112）30微克的单克隆抗体21为20分钟，在4 ℃（ 图2B）。使用这些制剂共培养试验按照步骤8.5中所述。
跨上皮电阻的8。测量（TER）
- 培养MDCK细胞在无菌的transwell透水支持（0.4微米孔径）。在上部隔室中，将100μl的细胞悬浮液，并在下部隔室把600微升补充DMEM培养基。
- 定期检查的中等水平。新鲜培养基可以根据需要添加。
- 检查在倒置显微镜的细胞，直到它们达到汇合的100％。改变培养基每2-3天。
- 以改善细胞的附着（如需要），加入细胞悬浮液前过夜平衡的transwell小的过滤器，在37℃在DMEM中。
- 在乙醇消毒STX2电极在通风橱中通过浸渍，然后在无菌PBS中，每次15分钟，在紫外光下。连接电极的EVOM上皮voltohmmeter并选择电阻模式。
- 从每个Transwell小的上格收集中，汇集他们。取50微升这种混合物介质，并用50μl的滋养体悬浮液（1×10 5滋养体在PBS中），或只用PBS（对照组）相结合。每个Transwell小使用类似的混合。
- 加的混合物，以每Transwell小containin的上部腔室克的MDCK细胞。实验条件包括MDCK细胞而不滋养体（对照），共培养与滋养体或滋养体预温育与蛋白酶抑制剂或mαEhCPADH112。为了消除过滤器提供的阻力，使用转孔孵育唯一媒介。对于每种实验条件下利用至少三个转孔。
- 随即，测量TER通过浸渍STX2电极到每个Transwell小。
- 确保较长的电极接触的下腔室的底部，而较短的电极覆盖介质在上部隔室（参见图2B）。
- 请务必保持电极每次垂直。这将提高可重复性，显著。避免移动或在倾斜测量电极，因为这会导致数据的变化。
- 这种测量应被视为初始TER值。然后，在下面的过程中监控的TER30分钟。
- 来计算最终的TER值，减去的只是过滤器的TER值。以从不同的实验比较结果正常化的每个数据点的初始值，取它们作为100％（ 图2B）。
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Representative Results
对于一个成功的E。阿米巴文化，有两个重要条件必须满足：成长在无菌条件下与收获对数生长期。 E.以前，文化阿米巴是容易建立与细菌或锥虫22的某些物种的关联。但是，现在它通常有无菌培养这种寄生虫的意思变形虫在免费代谢细菌，真菌，原生动物，后生动物或细胞环境中的不确定传代培养。此外，后期对数生长早期稳定期收获滋养体关键是有活力和增殖细胞23。因此，通过滋养体量化来区分这阶段沿数天，也通过检查其完好形貌和快速运动（ 图1）是重要的。
对于相互作用的研究中，上皮细胞的需要是在汇合单层来表示变形虫会在体内通常遇到的生理条件。几个上皮细胞系，容易培养，都可以。而更符合生理细胞模型系统将获得从肠道等的Caco-2或T84，这些细胞系生长相当缓慢。一个已经被广泛地研究增长较快的细胞系是MDCK细胞24。这些上皮细胞肾脏起源，特点是高TER，TJ强，容易栽培。该细胞系已被使用了几十年，研究结和TJ组合物的细胞生物学以及TJ组装和拆卸的机构。由于这些原因，MDCK细胞通常是由研究人员在研究TJ功能时选用。 MDCK细胞也被广泛用作模型的阿米巴病5,8,10,25-28中诱导机制的研究。在最近的研究中，我们报道了应变的互动我MDCK细胞和肠上皮Caco-2细胞与升香港专业教育学院变形虫，裂解液和阿米巴产品引起的TJ组成和TER 10类似的效果。因此，MDCK细胞是一个合适的模型来研究的阿米巴上皮细胞的相互作用机制。此外，使用数个大肠杆菌的阿米巴制品（完整滋养体，滋养体总裂解物或收获为滋养体培养上清液分泌的产品）是至关重要的，以提供有关涉及这些相互作用的分子，如可用性，动作，分泌，其它分子的参与模式和触发额外的相关信息信号通路。
而达到会合，上皮细胞形成是由TJ和AJ稳定的接触。这些结构构成的，即可以通过使用特异性抗体的免疫荧光染色进行可视化目标分子。例如，在图3中，电池触点由一个抗体对抗TJ标记ZO-1和一个红色荧光实验室可视化ELED第二抗体。如可以看出，细胞聚集在靠近形成致密的单分子层，没有任何孔。在该图中，变形虫衍生的复杂EhCPADH112已经使用通过绿色荧光标记的第二抗体进行检测，以研究这种复杂的相互作用与上皮表面的单克隆抗体染色。三种不同的这种复杂的来源已应用于单层上皮：活滋养体（T），滋养体总裂解液（TL）和分泌的产品（SP）。引人注目的是，在所有情况下，共定位EhCPADH112与ZO-1可以观察到（ 图3中，箭头），这表明可能需要这种复杂的，以促进大肠杆菌阿米巴渗透到上皮单层。
虽然这种互动已经可以早阿米巴后上皮细胞接触2分钟观察，细胞层尚未受到这种互动，因为ZO-1染色看起来仍然Çontinuous。 如图4后较长的温育时间这完全改变，在这里，图象暴露在三个不同EhCPADH112源30分钟后拍摄。 TJ的一个明显破坏是由不连续的ZO-1的染色在细胞边界（ 图4，箭头）可视化，最明显的效果出现在MDCK细胞与T或TL接触。相比之下，ZO-1被内化和被认为是在细胞内囊泡。确切的共定位与任何TJ或AJ沿着横向细胞膜不能由只不过在该单层的顶部，而是通过获得一个“侧”视图的细胞接触29区分开来。共焦激光显微镜可以沿着XZ轴这样的视图，展示了在图3和图4分别 XY视图下面。这些图像显示一个明确的说法是否与蛋白质TJ共定位于细胞膜外侧的最顶端部分，或者如果它们是位于相当TJ以下或以上的TJ在顶膜。在图3中（箭头），确切的共定位的EhCPADH112配合物与ZO-1可以看出，清楚地揭示了TJ作为行动的地方，这种致病因子。相反，如大肠杆菌阿米巴侵袭进展（相互作用30分钟）到上皮细胞，EhCPADH112侵入朝向细胞间隙沿横向膜的染色显示（ 图4，箭头）。在我们最近的纸张，该方法使我们能够TJ和AJ区分，因为这种复杂只共定位的标记物TJ occludin和紧密连接蛋白-1但不与AJ标记物β-连环蛋白在相互作用10的2分钟。
TJ元器件的内在化，如可在图4中的免疫荧光染色中可以看出，通常伴随着损失的屏障功能，可以由跨上皮电阻（TER）测定。 TER反映了横跨上皮单层的离子流，并且可以使用的电极， 如图2B进行测定。当单层还没有完全形成，或者是由于细胞外线索打乱，离子在细胞层中的自由流动是由一个低TER表示。 TER测定了一直没有与阿米巴产品或单层与滋养体接触（ 图5）接触的控制融合单层的。寄生虫接触打乱的90％相比于对照细胞单层一个TER下降表明上皮的屏障功能。为研究其影响滋养体屏障功能的机制，我们预孵育对EhCPADH112抗体的滋养体，以防止这种复杂的或与蛋白酶抑制剂的附着力，以阻止这个复杂而其他蛋白酶为靶细胞损伤重要的蛋白水解活性。两种治疗导致TER下降几乎完全逆转，这表明这两种蛋白水解活动和粘接性能是这个复杂的重要的毒力因子在大肠杆菌阿米巴入侵。
图1。axenically培养大肠杆菌的典型生长曲线 2×10 5滋养体E的阿米巴滋养体。菌剂阿米巴 HMI-IMSS的克隆生长在6孔板与缇-S-33中型和每24小时细胞数量后用hematocytomer确定。将细胞的生长在所述上板被描绘由生长细胞的光学显微镜和形态监测。滋养体量为6天（四）监测和值绘制在下面的图表。数据代表平均值和三次独立测量的平均值的标准误差。标尺=10μm以下。/ www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
相互作用的MDCK细胞和大肠杆菌的不同条件之间的图2。示意图阿米巴 A）不同的大肠杆菌的条件阿米巴显示：现场滋养体（T），总滋养体裂解液（TL）和分子由滋养体分泌到培养基中（SP）。任何实验条件进行测定孵化与融合MDCK细胞的2和30分钟。孵育后，MDCK细胞大量洗涤去除滋养体或绑定寄生分子。然后，样品处理，进行免疫荧光试验，采用mαEhCPADH112和pαZO-1 antibodIES到共定位的寄生复杂EhCPADH112和TJ标记ZO-1，分别。在转孔的上部隔室后，耦合到不同的荧光染料的种特异性的第二抗体，使用了共聚焦显微镜来检测两种蛋白质B）的加成滋养体只或滋养体预孵育mαEhCPADH112或蛋白酶抑制剂20分钟，在4℃下含汇合MDCK细胞。上皮细胞TER使用连接到一个EVOM voltohmeter，在30分钟的STX2电极监测。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。本地化EhCPADH112在TJ MDCK细胞单层的 。 MDCK细胞衍丰屏息现场滋养体（T），总滋养体裂解液（TL）和分子由滋养体分泌到2分钟的培养基（SP）。上图：MDCK细胞的相衬图像。 EhCPADH112和ZO-1蛋白通过mαEhCPADH112和pαZO-1抗体识别，然后用FITC和TRITC-二抗，分别。细胞核用DAPI染色。箭头：蛋白定位在单元格边框。箭头在XZ-平面：蛋白定位在TJ。酒吧= 10微米。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图4。内在EhCPADH112入MDCK细胞 。 MDCK细胞培养与活滋养体（T），总滋养体裂解液（TL）和分子通过滋养体30分钟，分泌到培养基中（SP）。上图：MDCK细胞的相衬图像。 EhCPADH112和ZO-1蛋白通过mαEhCPADH112和pαZO-1抗体识别，然后用FITC和TRITC-二抗，分别。细胞核用DAPI染色。箭头：蛋白定位在单元格边框。箭头在XZ-平面：蛋白定位于细胞膜外侧（箭头）。酒吧= 10微米。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图5。E.通过EhCPADH112 阿米巴诱导上皮屏障破坏。MDCK细胞单层培养与活滋养体30分钟，TER在指定的时间进行了评价（T）或T预孵育蛋白酶抑制剂（PI）或mαEhCPADH112抗体（α）。 TER按照每个Transwell小的初始值归一化（〜3200Ω·厘米2）。的装置和方法的标准误差来表示，每个时间点。使用单向ANOVA测试用的GraphPad棱镜5软件进行统计分析。 *** P <0.001。
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Discussion
为了研究上皮感染时体外宿主-病原体相互作用的E.组织阿米巴 ，关键的是与两个上皮细胞和滋养体行之有效的培养工作。例如，以前，E.阿米巴培养了通常建立在与细菌或锥虫22,23某些物种的关联。然而，共培养的大肠杆菌阿米巴培养是得不偿失的宿主-病原体相互作用的研究，因为在宿主细胞中观察到的效果不能明确归因于ameobas但可以相当是共培养细胞的效果。因此，E的axenical培养阿米巴是可取的特定宿主-病原体相互作用的检查。所提供的协议描述了如何这样的无菌培养的大肠杆菌阿米巴可以实现专门利用这种文化感染的研究。此外，定时E.收获的阿米巴也很关键。E.在指数增长的后期阶段阿米巴收成建议，以确保高产细胞具有高生存能力。
另一方面，行之有效的上皮细胞单层也是强制性的，以获得可再现的结果。为了模拟生理紧张单层上皮，培养的细胞需要在正确的时间使用。该单层具有不带任何孔被完全形成。此外，形成正确的TJ和AJ，需要细胞接触，建立了一段时间后。通常，上皮细胞是接触抑制的，这意味着细胞停止增殖的融合单层，因此，它通常是更好生长的另一天，得到的细胞。然而，这不应该被扩展，因为这接触抑制不是无限期和细胞可能在某一时刻开始长满对方。如果发生此种情况，有必要分割或光盘ARD细胞和不使用它们中的检测。紧单层上皮形成，最好通过测量TER控制。然而，这需要生长在Transwell小的过滤器，这是相当昂贵的。开发一种眼有一个良好的单分子层也可能是对没有经验的实验者传播各种细胞数后，在相同的培养格式来比较细胞的生长有帮助。
该宿主 - 寄生虫相互作用测定法的定时是另一个重要因素。互动后2分钟，可以观察到无上皮损伤，但EhCPADH112与TJ分子ZO-1的相互作用已经是很明显。然而，经过30分钟的互动，严重上皮损伤，观察由TJ拆卸和下降TER（10和这项研究）所示。这些数据表明，与心尖上皮侧的早期粘合剂的相互作用是必要的松开接触，并允许其他分子如蛋白酶，当年有助于渗透退化等TJ，AJ和桥粒分子。滋养体蛋白的浓度也很重要。值得注意的是，不同的结果可以应用现场滋养体或只是裂解物或E的分泌的产品时，必须遵守组织阿米巴 。滋养体到上皮细胞的相对比例是以前证明10，甚至当MDCK到分泌产物通过阿米巴的比例为高（1:10），上皮损伤是不那么严重。这表明，不仅是单一的毒性蛋白的浓度是关键的，但它也可能是导致在有效上皮损伤，从而允许快速侵入变形虫的各种因素的相互作用。例如，Chadee的研究小组强调了另一种阿米巴源性蛋白酶，EhCP5的重要性，以引起上皮损伤16。这很可能是致病因素的相互作用是诱导阿米巴病所需的体内 ，由于inhibitio缺少互动N一种单一的蛋白可以解释的是，在大多数情况下，感染是静态。在这方面，同样重要的是提到上皮的产品，如粘蛋白是重要的，以防止感染。特别是，mucin2敲除小鼠更容易受到EhCP5诱导TJ改变和感染16。因此，在上皮侧的改变还需要考虑到评估阿米巴侵袭。
所描述的技术以检测共定位的一个重要的限制是，它并没有明确地证明的直接相互作用。在这种情况下，一个共同定位或相互作用可也由这只是不可视另一个蛋白介导的。用于检测的直接相互作用，这将是必要的，以产生重组标签（例如GST或10xHis）的蛋白质和1标记和Western印迹对其他进行免疫沉淀。不管怎么说，免疫荧光染色也揭示了EXA的优势蛋白质复合物的克拉细胞定位，并给实验者应该在这样的体外相互作用测定待测蛋白质的想法。另一个缺点是，有可用的只有少数阿米巴特异性抗体。因此，如果一个人想学习某些阿米巴原虫的蛋白质在这种相互作用的研究，这将最有可能需要的抗体的产生。然而，如果抗体是可用的，所描述的方法可应用于研究其他阿米巴蛋白的相关性（分泌或表面结合）为宿主 - 病原体相互作用。
本文介绍了一个简单的模型来检测主机和寄生虫的分子之间的共定位和相互作用。从这些基于细胞的实验中获得的知识可以用仓鼠或小鼠的寄生虫相印证的主机入侵生理相关的体内感染模型被应用。这些数据可以被用来为新颖的治疗斯特拉发展tegies。
综上所述，我们提供详细的协议，为培养大肠杆菌阿米巴细胞和上皮细胞在宿主-病原体相互作用的研究，特别是在允许的共定位和TJ拆卸的评价试验中使用。培养物以及每个测定法的时序是至关重要的，以确保所获得的结果的可重复性。当培养物的时间可通过改变传播的细胞数的影响，本实验本身的时间取决于试验的类型和研究的蛋白质的类型。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
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