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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

द्वारा उत्पादित उपकला नुकसान का विश्लेषण Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51668
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 1, 1
1Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

Summary

एटामोइबा हिस्टोलिटिका से मानव संक्रमण amoebiasis, उष्णकटिबंधीय देशों में डायरिया का एक प्रमुख कारण हो जाती है. संक्रमण सेल सेल संपर्क के उद्घाटन और फलस्वरूप दस्त, कभी कभी जिगर के संक्रमण के द्वारा पीछा उत्तेजक, आंतों उपकला कोशिकाओं के साथ रोगज़नक़ बातचीत से शुरू की है. यह लेख amoebiasis रोगजनन के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने के लिए जल्दी मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का आकलन करने के लिए एक मॉडल प्रदान करता है.

Abstract

एटामोइबा हिस्टोलिटिका मानव amoebiasis की प्रेरणा का एजेंट, उष्णकटिबंधीय देशों में डायरिया और यकृत फोड़ा का एक प्रमुख कारण है. संक्रमण आंतों उपकला कोशिकाओं के साथ रोगज़नक़ की बातचीत से शुरू की है. यह बातचीत इस तरह तंग जंक्शनों (टी जे) के रूप में कहनेवाला संरचनाओं के विघटन की ओर जाता है. टी जे आंत लुमेन से मेजबान ऊतक अलग करने के लिए उपकला परत की सील किया जाता है. हाल के अध्ययनों से परजीवी प्रोटीन EhCPADH112 द्वारा टी जे के विघटन ई. के लिए एक शर्त है कि सबूत प्रदान उपकला बाधा शिथिलता के साथ है कि हिस्टोलिटिका आक्रमण. इस प्रकार, ई. के दौरान टी जे disassembly में शामिल आणविक तंत्र का विश्लेषण हिस्टोलिटिका आक्रमण amoebiasis रोगजनन के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण है. यह लेख प्रारंभिक मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के आकलन और परजीवी आक्रमण क्षमता की अनुमति देता है कि एक आसान मॉडल प्रस्तुत करता है. विश्लेषण किया जा करने के लिए पैरामीटर शामिल हैं टीransepithelial विद्युत प्रतिरोध, उपकला सतह रिसेप्टर्स, अभिव्यक्ति में परिवर्तन और उपकला junctional मार्करों और उपकला कोशिकाओं के भीतर परजीवी अणुओं का स्थानीयकरण के स्थानीयकरण साथ EhCPADH112 की बातचीत.

Introduction

एटामोइबा हिस्टोलिटिका सूजन और दस्त. ई. के कारण मानव amoebiasis, एक आंत्र संक्रमण के जिम्मेदार एक एकल कोशिका प्रोटोजोआ है हिस्टोलिटिका वार्षिक 50 लाख व्यक्तियों को संक्रमित करता है, लेकिन संक्रमित लोगों के बारे में केवल 10% amoebiasis 1 के लिए जुड़े लक्षण विकसित. संक्रमण ई. युक्त दूषित भोजन या पानी की घूस पर तब होता है हिस्टोलिटिका अल्सर. आंत में अल्सर पेट के mucin का पालन करना और 2 पैदा करना है कि लाइव ट्रोफोजोइट्स उत्पादन. ट्रोफोजोइट्स आमतौर पर मल के माध्यम से उत्सर्जित कर रहे हैं कि अल्सर के रूप में. अन्य मामलों में और अभी तक अज्ञात कारणों के लिए, ट्रोफोजोइट्स आंतों उपकला परत को तोड़ने और अंतर्निहित ऊतकों आक्रमण. सबसे खराब मामलों में, वे रक्त प्रवाह में प्रवेश और जिगर के रूप में 3 अन्य अंगों को प्रभावित.

उपकला बैरियर तोड़कर शामिल हो गए कोशिकाओं को बनाए रखने कि उपकला transmembranal संरचनाओं के विघटन की आवश्यकता है. उपकला कोशिकासंपर्क तंग (टीजे) से मिलकर शिखर junctional जटिल द्वारा गठित और जंक्शनों (ए जे) adherens, और 4 desmosomes रहे हैं. सबसे शिखर जंक्शनों टी जे रहे हैं, और इसलिए, वे ई. द्वारा affronted पहली बाधा हैं मेजबान आक्रमण के दौरान हिस्टोलिटिका और कुछ अन्य रोगजनकों. टी जे ऐसे पड़ोसी सेल के रिसेप्टर्स के साथ होमोसेक्सुअल या heterophilic बातचीत में संलग्न है कि claudins, occludin और junctional आसंजन अणुओं (जाम) के रूप में transmembranal आसंजन रिसेप्टर्स के शामिल हैं. वे intracellularly उपकला को आगे यांत्रिक शक्ति प्रदान करने के लिए actin cytoskeleton के लिए आसंजन रिसेप्टर्स कि कनेक्ट (ZO) परिवार zonula occludens की पाड़ अणुओं से बंधे हुए हैं. टी जे अत्यधिक पानी और घुला हुआ पदार्थ के रिसाव को रोकने, आंत लुमेन से आंतों के ऊतकों सीलिंग के लिए जिम्मेदार हैं. टी जे परजीवी द्वारा बाधित कर रहे हैं के बाद इस प्रकार, ऊतकों पर हमला कर रहे हैं. ई. (मैं) Targ को अमीबा की आसंजन में शामिल लोगों को: हिस्टोलिटिका जैसे कई अणुओं secretesएट कोशिकाओं 5; एक्सोसाइटोसिस द्वारा मेजबान कोशिकाओं की हत्या में भाग लेने वाले (द्वितीय) झिल्ली सक्रिय कारक है, उदाहरण के लिए कहा जाता आयन चैनल के गठन पेप्टाइड्स 6,7 amoebapores; और (iii) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन नीचा और ऊतक विघटन 5,8,9 कि मध्यस्थता proteinases.

एक साथ EhCPADH112 जटिल है कि फार्म सिस्टीन प्रोटीज EhCP112 और आसंजन अणु EhADH112 दो ई. हैं हिस्टोलिटिका टी जे 10 के disassembly में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं कि प्रोटीन डाह. लाइव ट्रोफोजोइट्स, उनकी कुल lysates और secreted उत्पादों उपकला बाधा के टी जे जटिल और कार्यात्मक अशांति में आणविक परिवर्तन प्रेरित. इस अध्ययन में यह EhCP112 और EhADH112 इस प्रकार ई. की सुविधा, occludin और internalization और सेल प्रोटीन की गिरावट के लिए अग्रणी claudin -1 प्रोटीन के साथ बातचीत दिखाया गया है कि paracellular मार्ग के माध्यम से हिस्टोलिटिका प्रवेश द्वार.

हमारे आंकड़े और उन ओF अन्य समूहों 11-17 जोरदार परजीवी आक्रमण की अनुमति है कि विशिष्ट मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की आवश्यकता सुझाव है. इन मुलाकातों के आणविक आधार Unraveling amoebiasis रोगजनन का एक बेहतर समझ के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. वृद्धि की paracellular पारगम्यता द्वारा विशेषता ट्रोफोजोइट्स द्वारा टी जे के चुनिंदा अशांति, transepithelial विद्युत प्रतिरोध में कमी (आतंकवाद) द्वारा मापा जा सकता है. मेजबान epithelia की ओर परजीवी प्रोटीन के स्थानांतरण immunofluorescence धुंधला और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी, यह भी संभव प्रत्यक्ष बातचीत का संकेत उपकला junctional मार्कर के साथ अमीबा विषैलापन कारकों की सह स्थानीयकरण प्रकट कर सकते हैं कि एक विधि द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस अनुच्छेद में, हम उपकला कोशिकाओं और ट्रोफोजोइट्स, खेती काटा और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत और उनके परिणामों की जांच करने के लिए छेड़छाड़ कर रहे हैं कि कैसे विस्तार से वर्णन है.

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Protocol

ई. के 1. स्थापना और रखरखाव हिस्टोलिटिका संस्कृति

  1. (अन्य सभी contaminating जीवों की पूरी तरह से मुक्त) axenically बढ़ो एटामोइबा हिस्टोलिटिका तनाव HML की 1 एक्स 10 5 ट्रोफोजोइट्स: IMSS Teflon लाइनर भाड़ में कैप्स (या में एक डिस्पोजेबल टी -1 एक्स 10 6 ट्रोफोजोइट्स के साथ 18 125 X 16 मिमी संस्कृति ट्यूब क्लोन 25 कुप्पी) और 15 मिलीलीटर (या TYI-S-33 मध्यम T-25 फ्लास्क में 50 मिलीलीटर) (TYI शोरबा 3% डायमंड विटामिन मिश्रण, 10% गर्मी निष्क्रिय वयस्क गोजातीय सीरम, 0.5 आइयू / एमएल पेनिसिलिन और 35 ग्राम के साथ पूरक / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में स्ट्रेप्टोमाइसिन) 19
  2. 48-96 घंटे के अंतराल पर आमतौर पर लघुगणक विकास के चरण में कांच संस्कृति ट्यूब से जुड़ी ट्रोफोजोइट्स जारी करने के लिए एक बर्फ का पानी स्नान में 5-10 मिनट के लिए संस्कृति ट्यूब द्रुतशीतन द्वारा (चित्रा 1) के दौरान हार्वेस्ट ट्रोफोजोइट्स.
  3. एक शंक्वाकार ट्यूब में संस्कृति स्थानांतरण और सीईएल फैलाने के लिए यह कई बार पलटनारास. एक hemocytometer (Neubauer कक्ष) का उपयोग सेल नंबर का निर्धारण, और ताजा TYI-S-33 मध्यम युक्त संस्कृति ट्यूब में एक inoculum हस्तांतरण.
    1. अब ऊष्मायन अवधि (~ 5 दिनों के लिए ~ 3 x 10 5 कोशिकाओं) और छोटी अवधि के लिए एक उच्च संख्या (~ 1 दिन के लिए ~ 1 x 10 6 कोशिकाओं) के लिए amoebas की कम संख्या का प्रयोग करें. गिना inocula वांछित हैं जबकि inocula की अनुमानित मात्रा में संभव है, इसलिए है कि स्थापित संस्कृतियों उम्मीद के मुताबिक हो जाते हैं.
    2. एक प्रयोग के लिए सेल नंबर का अनुकूलन करने ट्रोफोजोइट्स की राशि टाइट्रेट.
    3. अनजाने संदूषण या ट्यूब टूटना के मामले में एक बैक अप के लिए एक समानांतर डुप्लिकेट संस्कृति को बनाए रखने.
  4. कैप ट्यूब कसकर और क्षैतिज कोण झुका एक 5 ° में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं.
  5. संस्कृति का एक अत्यधिक वृद्धि कई lysed कोशिकाओं हो सकती हैं, नियमित रूप से दृश्य निरीक्षण से संस्कृतियों की जाँच करें.

MDCK संस्कृति के 2. स्थापना और रखरखाव </ P>

  1. (Madin डार्बी कुत्ते गुर्दे सेल) / 0.08 यू (इंसुलिन, पेनिसिलिन (100 आइयू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पूरक DMEM मीडिया के 10 एमएल के साथ डिस्पोजेबल टी 75 बोतल में मैं (उच्च प्रतिरोध) लिखें MDCK बढ़ो 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 और 95% हवा की एक humidified वातावरण में एमएल) और 10% नवजात शिशु बछड़ा सीरम
  2. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, एक औंधा माइक्रोस्कोप पर उन्हें जांच ले. वे ~ 85-100% मिला हुआ हैं जब कोशिकाओं को विभाजित.
  3. एक बाँझ हुड और संस्कृति से मीडिया को दूर करने के लिए एक बाँझ कांच पाश्चर पिपेट में एक निर्वात चूषित्र का प्रयोग करें. कोशिकाओं scraping से बचने के लिए नीचे कोने से उल्टा फ्लास्क और महाप्राण मीडिया बारी.
  4. एक टी 25 फ्लास्क के मामले में (5 एमएल एक टी -75 फ्लास्क में prewarmed पीबीएस (140 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 4 HPO, 1.8 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 7.4 पीएच) के 10 एमएल बांटना ) और धीरे कोशिकाओं को धोने के लिए फ्लास्क रॉक. वैक्यूम आकांक्षा से पीबीएस निकालें. सीरम trypsin रोकता के बाद से व्यापक धोने की आवश्यकता है.
  5. (टी 25 फ्लास्क के लिए 0.5 मिलीलीटर का उपयोग) और धीरे trypsin के साथ सेल परत को कवर करने के फ्लास्क रॉक एक टी -75 फ्लास्क में 0.05% trypsin के 1.5 एमएल बांटना.
  6. इनक्यूबेटर में 5-10 मिनट (सटीक समय trypsin गतिविधि पर निर्भर करता है) के लिए सेते हैं.
  7. प्रकाश के खिलाफ कुप्पी धारण करके सेल टुकड़ी के लिए जाँच करें और कोशिकाओं बहने के लिए देखो. सेल टुकड़ी (गोल कोशिकाओं) भी एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर जाँच की जा सकती. अक्सर, कोशिकाओं कुप्पी की ओर करने के लिए एक त्वरित, कोमल थप्पड़ के साथ तेजी से जारी है.
  8. एक टी -75 कुप्पी (एक टी 25 फ्लास्क के लिए 5 एमएल) के लिए पूरक DMEM के 15 मिलीलीटर जोड़ें. ऊपर और नीचे pipetting 4 या 5 बार से कोशिकाओं Resuspend.
  9. कोशिकाओं का प्रचार करने, नए सिरे से पूरक DMEM के साथ सेल निलंबन 1:05 पतला. प्रकोष्ठों संख्या भी एक hemocytometer का उपयोग इस बिंदु पर निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन कुछ assays के लिए विशेष स्वरूप में कोशिकाओं बंटवारे अगर यह आमतौर पर केवल आवश्यक है.

Trophozoite कुल lysates की 3. तैयारी

  1. घन से ट्रोफोजोइट्स को अलग करेंएक बर्फ का पानी स्नान में 5-10 मिनट के लिए ट्यूब द्रुतशीतन द्वारा lture ट्यूबों. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 360 XG पर एक शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में संस्कृति aseptically स्थानांतरण ध्यान से, निस्तारण से सतह पर तैरनेवाला त्यागने गोली को ठंडा पीबीएस जोड़ने के लिए, 10 मिनट के लिए 360 XG पर फिर से कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र को फैलाने के लिए ट्यूब कई बार पलटना. TYI-S-33 मध्यम के सभी निशान हटाने के लिए दो बार इस चरण को दोहराएँ.
  2. एक hemocytometer का उपयोग ट्रोफोजोइट्स संख्या निर्धारित करते हैं.
  3. Lyse फ्रीज पिघलना चक्र से ट्रोफोजोइट्स. 1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में, ठंडा पीबीएस में पतला ट्रोफोजोइट्स की एक मापा inoculum (600,000 ट्रोफोजोइट्स / एमएल) स्नैप फ्रीज. सख्ती से 4 डिग्री सेल्सियस और भंवर में नमूना नरम कर देना. सेल को पूरा करने के लिए ठंड और विगलन 3 बार दोहराएँ.
  4. 0.02% β-mercaptoethanol के साथ lysates में मौजूद proteases सक्रिय करें.

Trophozoite स्रावित उत्पाद के 4. तैयारी

  1. कदम 3.1-3.2 प्रदर्शन करना.
  2. निर्धारण करेंएक hemocytometer का उपयोग और एक trypan नीले बहिष्कार परीक्षा 20 को लागू करने के लिए इस बिंदु पर कोशिकाओं की संख्या और व्यवहार्यता:
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 9 एक्स 10 6 3 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस में ट्रोफोजोइट्स और हस्तांतरण कोशिकाओं पतला. इस निलंबन के 10 μl ले लो और 0.4% trypan नीले शेयर समाधान पीएच 7.2 से 1 μl जोड़ें.
    2. कम बढ़ाई कोशिकाओं गिनती करने के लिए एक Neubauer कक्ष का प्रयोग करें.
    3. सभी कक्षों की गणना और नीले कोशिकाओं डाई ले लिया है और मृत विचार किया जाना चाहिए के बाद से, नीले कोशिकाओं की संख्या अलग.
    4. कोशिकाओं की कुल संख्या से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में विभाजित है और 100 से गुणा करके व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना.
  3. क्षैतिज कोण झुका एक 5 ° में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में trophozoite निलंबन युक्त शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण.
  4. 10 मिनट के लिए 360 XG पर स्रावित उत्पादों, अपकेंद्रित्र ट्यूबों लेने के लिए. एक डिस्पोजेबल और बाँझ सिरिंज का प्रयोग करें और ध्यान से सु इकट्ठाpernatant, गोली से ट्रोफोजोइट्स साथ नमूनों के प्रदूषण से बचने. 0.22 सुक्ष्ममापी सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला गुजर द्वारा किसी भी तबादला कोशिकाओं को खत्म. 0.02% β-mercaptoethanol के साथ proteases सक्रिय करें.
  5. मृत कोशिकाओं से जारी अणुओं के साथ ख्यात अवांछित संदूषण त्यागें, सेल व्यवहार्यता के लिए trypan नीले बहिष्कार परीक्षण पुन: लागू. 4.2 कदम में प्राप्त के रूप में कोशिकाओं की व्यवहार्य और कुल संख्या एक ही होना चाहिए. यह मामला नहीं है, तो एकत्र सतह पर तैरनेवाला होते प्रोटीन स्रावित हो सकता है न केवल और त्याग किया जाना चाहिए.

ट्रोफोजोइट्स, Trophozoite lysates या स्रावित उत्पाद के साथ MDCK कोशिकाओं के 5. इंटरेक्शन

  1. लाइव ट्रोफोजोइट्स (1:1 के एक MDCK करने वाली अमीबा अनुपात) के साथ मिला हुआ MDCK सेल monolayers सेते हैं, trophozoite lysates (एक MDCK करने वाली अमीबा 1:2 के अनुपात) या स्रावित उत्पाद (1 के एक MDCK करने वाली अमीबा अनुपात : 10) 2 और 30 मिनट (2A चित्रा) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर.
  2. अनबाउंड अणुओं या ट्रोफोजोइट्स को खत्म करने के लिए ठंडा पीबीएस के साथ उपकला कोशिकाओं पांच बार धोएं.

Immunofluorescence के लिए नमूने के 6. तैयारी

  1. एक 24 multiwell सेल संस्कृति पकवान अंदर रखा बाँझ कांच coverslips पर संस्कृति MDCK कोशिकाओं. वे संगम की 100% तक पहुँच जब तक उलटा माइक्रोस्कोप पर कक्षों का निरीक्षण किया. फिर, ताजा पूरक DMEM माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ मध्यम जगह और अधिक 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली हस्तांतरण.
  2. एक निर्वात चूषित्र और एक बाँझ कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग मध्यम निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए गर्म पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें. पीबीएस निकालें और ताजा पीबीएस के साथ धोने दोहराएँ. कांच विंदुक के साथ अच्छी तरह से नीचे से कोशिकाओं को कुरेदना नहीं ख्याल रखना.
  3. लाइव ट्रोफोजोइट्स (टी), trophozoite कुल lysates (टीएल) और स्रावित उत्पादों (सपा): गर्म पीबीएस के 1 मिलीलीटर में पतला ट्रोफोजोइट्स की विभिन्न स्थितियों जोड़ें.
    1. 2 या 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में संस्कृति की थाली रखो.
    2. MDCK कोशिकाओं ई. के साथ incubated नहीं किया जाना चाहिए, जहां से एक का नाम समय 0 मिनट,: दो नियंत्रण स्थितियां तैयार करें हिस्टोलिटिका लेकिन केवल गर्म पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ; और इस मामले में माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में एक और शर्त, 2 या 30 मिनट के लिए टी, टीएल या सपा के साथ MDCK सेते हैं और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन न आना.
  4. अनबाउंड अणुओं या ट्रोफोजोइट्स को खत्म करने की ठंड पीबीएस के साथ उपकला कोशिकाओं पांच बार धोएं.
  5. फिक्स और -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 96% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं permeabilize
  6. इथेनॉल को निकालने के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ तीन त्वरित washes प्रदर्शन करते हैं.
  7. नमूने के सूखने से बचने के लिए एक नम कक्ष में निम्न चरणों का पालन:
    1. बंद और नमूने सुरक्षित रूप से रखा जा सकता है, जिस पर एक गीला कागज तौलिया के साथ भरा जा सकता है कि किसी भी उपलब्ध फ्लैट बॉक्स का उपयोग करें. उदाहरण के लिए, एक खाली पिपेट टिप बॉक्स में अच्छी तरह से इस उद्देश्य में कार्य करता है.
    2. कक्ष के अंदर, समान रूप से एक Parafilm परत और पिपेट ब्लॉक के 25 μl जगहप्रत्येक coverslip के लिए समाधान (0.5% बीएसए) आईएनजी.
    3. ठीक संदंश के साथ कुओं से बाहर coverslips लो, सावधानी से एक फिल्टर पेपर के साथ बढ़त से अतिरिक्त तरल निकालने और कोशिकाओं अवरुद्ध समाधान का सामना करना पड़ के साथ अवरुद्ध समाधान (0.5% बीएसए) युक्त ड्रॉप में coverslip डाल दिया. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए नमूने सेते हैं.
  8. पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी का एक मिश्रण तैयार: आईजीएम माउस विरोधी EhCPADH112 (mα-EhCPADH112, 1:10 कमजोर पड़ने) और आईजीजी खरगोश विरोधी ZO -1 (pα-zo-1, 1:100 कमजोर पड़ने).
  9. नम बॉक्स और पिपेट प्रत्येक coverslip के लिए एंटीबॉडी समाधान के 25 μl में Parafilm के एक ताजा शीट रखें.
  10. , अवरुद्ध समाधान से coverslips लिफ्ट एक फिल्टर पेपर का उपयोग किनारों पर किसी भी अतिरिक्त तरल सूखी, और कोशिकाओं एंटीबॉडी समाधान का सामना करना पड़ के साथ बूंदों में उन्हें जगह है. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात नमूने सेते
  11. (शीर्ष पर सेल की ओर) एक 24 multiwell के एक कुएं में प्रत्येक coverslip रखो और पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  12. FITC के लिए युग्मित बकरी विरोधी आईजीएम माउस (1:100 कमजोर पड़ने) और TRITC (1:50 कमजोर पड़ने) के लिए युग्मित बकरी विरोधी आईजीजी खरगोश: पीबीएस में फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी का एक मिश्रण तैयार करें.
  13. नम बॉक्स और पिपेट प्रत्येक coverslip के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 25 μl में Parafilm के एक ताजा शीट रखें.
  14. 6.10 में नमूने के रूप में स्थानांतरण और फ्लोरोसेंट रंगों के विरंजन से बचने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. कदम 6.11.1 दोहराएँ.
  15. परमाणु धुंधला के लिए कमरे के तापमान पर 0.05 मिमी DAPI समाधान के 200 μl के साथ 3 मिनट के लिए सेते हैं और प्रकाश से बचाने के लिए. कदम 6.11.1 दोहराएँ.
  16. , फ्लोरोसेंट रंगों के संरक्षण VECTA शील्ड गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ते समाधान antifade 5 μl में coverslips (कोशिकाओं नीचे का सामना करना पड़) रखने के लिए. नमूना सुखाने से बचने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग कर कवर फिसल जाता सील.
  17. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एक में स्लाइड्स रखना-20 डिग्री सेल्सियस पर खुर्दबीन स्लाइड बॉक्स
  18. Z-ढेर वर्गों और xz विमानों (2A चित्रा) के माध्यम से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा तैयारियों का विश्लेषण करें.

Protease inhibitors या विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ ट्रोफोजोइट्स के 7. ऊष्मायन

  1. दोहराएँ 3.1-3.2 कदम. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए, 4 में 20 मिनट के लिए प्रोटीज (पूर्ण 1 मिमी और 40 ग्राम / एमएल ई -64) inhibitors या EhCPADH112 (mαEhCPADH112) के खिलाफ 30 माइक्रोग्राम मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 21 (50 μl पीबीएस में resuspended) 1 एक्स 10 5 ट्रोफोजोइट्स सेते डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 बी). कदम 8.5 में वर्णित के रूप में सह ऊष्मायन assays के लिए इन तैयारियों का प्रयोग करें.

8. Transepithelial विद्युत प्रतिरोध के मापन (आतंकवाद)

  1. बाँझ transwell पारगम्य समर्थन करता है (0.4 माइक्रोन रोमकूप आकार) पर संस्कृति MDCK कोशिकाओं. ऊपरी डिब्बे में 100 सेलुलर निलंबन के μl और कम डिब्बे में जगहपूरक DMEM मध्यम के 600 μl जगह है.
    1. समय - समय मध्यम स्तर की जाँच करें. आवश्यकता के रूप में ताजा माध्यम जोड़ा जा सकता है.
    2. वे संगम की 100% तक पहुँच जब तक एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कक्षों का निरीक्षण किया. हर 2-3 दिनों मध्यम बदलें.
    3. सेल लगाव (यदि आवश्यक हो) में सुधार करने के लिए, सेल निलंबन जोड़ने से पहले DMEM में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात transwell फिल्टर संतुलित करना.
  2. इथेनॉल में विसर्जन से हुड में STX2 इलेक्ट्रोड जीवाणुरहित और फिर बाँझ पीबीएस में पराबैंगनी प्रकाश के तहत 15 मिनट प्रत्येक के लिए. एक EVOM उपकला voltohmmeter के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट और प्रतिरोध मोड का चयन करें.
  3. प्रत्येक transwell के ऊपरी डिब्बे से मध्यम इकट्ठा करने और उन्हें पूल. इस मीडिया मिश्रण की 50 μl लो और ट्रोफोजोइट्स निलंबन के 50 μl (पीबीएस में 1 एक्स 10 5 ट्रोफोजोइट्स) के साथ या केवल पीबीएस (नियंत्रण) के साथ गठबंधन. प्रत्येक transwell के लिए एक समान मिश्रण का प्रयोग करें.
  4. प्रत्येक transwell containin के ऊपरी सदन के लिए मिश्रण जोड़ेंजी MDCK कोशिकाओं. प्रयोगात्मक शर्तों ट्रोफोजोइट्स (नियंत्रण) के बिना ट्रोफोजोइट्स साथ या protease inhibitors या mαEhCPADH112 साथ पूर्व incubated ट्रोफोजोइट्स के साथ एक सह संस्कृति MDCK कोशिकाओं में शामिल हैं. फिल्टर द्वारा प्रदान प्रतिरोध को खत्म करने के लिए, केवल मध्यम साथ incubated transwells का उपयोग करें. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत उपयोग कम से कम तीन transwells लिए.
  5. इसके तत्काल बाद, प्रत्येक transwell में STX2 इलेक्ट्रोड सूई से आतंकवाद को मापने.
    1. अब इलेक्ट्रोड निचले सदन के नीचे छू लेती है और छोटे इलेक्ट्रोड (चित्रा 2B देखें) ऊपरी डिब्बे में मध्यम द्वारा कवर किया जाता है कि सुनिश्चित करें.
    2. हर बार लंब के रूप में इलेक्ट्रोड पकड़ के लिए सुनिश्चित करें. यह भी महत्वपूर्ण है, reproducibility में सुधार होगा. इस डेटा की विभिन्नता को बढ़ावा मिलेगा के रूप में चलती है या माप के दौरान इलेक्ट्रोड झुकने से बचें.
  6. यह माप प्रारंभिक TER मूल्य पर विचार किया जाना चाहिए. उसके बाद, निम्न दौरान आतंकवाद की निगरानी30 मिनट.
  7. अंतिम TER मूल्य की गणना करने के लिए, केवल फिल्टर के आतंकवाद मूल्य घटाना. विभिन्न प्रयोगों से परिणामों की तुलना करने के लिए 100% (चित्रा 2 बी) के रूप में इन लेने, प्रारंभिक मूल्यों को प्रत्येक डेटा बिंदु मानक के अनुसार.

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Representative Results

एक सफल ई के लिए हिस्टोलिटिका संस्कृति, दो महत्वपूर्ण शर्तों को पूरा किया जाना चाहिए: लघुगणक चरण में axenic की स्थिति और फसल में वृद्धि. ई. के पहले, संस्कृतियों हिस्टोलिटिका आसानी से बैक्टीरिया या trypanosomatids 22 के कुछ प्रजातियों के सहयोग से स्थापित किए गए थे. लेकिन, आजकल यह metabolizing बैक्टीरिया, कवक, प्रोटोजोआ, या metazoan कोशिकाओं से मुक्त एक वातावरण में अमीबा की अनिश्चितकालीन subcultivation अर्थ यह परजीवी की axenic खेती है आम है. इसके अतिरिक्त, विकास के प्रारंभिक स्थिर चरण के लिए देर लघुगणक दौरान ट्रोफोजोइट्स कटाई व्यवहार्य और proliferating कोशिकाओं 23 रखना जरूरी है. इसलिए, यह कई दिनों के साथ और भी उनके बरकरार आकारिकी और तेजी से हरकत (चित्रा 1) का परीक्षण करके ट्रोफोजोइट्स की मात्रा का ठहराव द्वारा इस चरण के अंतर करना महत्वपूर्ण है.

बातचीत के अध्ययन के लिए, उपकला कोशिकाओं होने की जरूरतamoebas सामान्य रूप से शरीर में मुठभेड़ होती है कि शारीरिक स्थिति का प्रतिनिधित्व करने का एक मिला हुआ monolayer में. खेती करने के लिए आसान कई उपकला कोशिका लाइनों, उपलब्ध हैं. एक अधिक शारीरिक सेल मॉडल प्रणाली ऐसी Caco -2 या T84 के रूप में आंतों से प्राप्त होता है, इन सेल लाइनों बल्कि धीरे - धीरे बढ़ता है. बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है कि एक तेजी से बढ़ सेल लाइन MDCK कोशिकाओं 24 हैं. ये उपकला कोशिकाओं गुर्दे मूल के हैं और उच्च आतंकवाद, मजबूत टी जे और आसान खेती की विशेषता है. इस सेल लाइन सेल जंक्शनों और टी जे रचना के जीव विज्ञान के साथ ही टी जे विधानसभा और disassembly के तंत्र का अध्ययन करने के लिए दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है. टी जे कार्यों का अध्ययन करते समय इन कारणों के लिए, MDCK कोशिकाओं अक्सर शोधकर्ताओं द्वारा चुना जाता है. MDCK कोशिकाओं को भी व्यापक रूप से amoebiasis 5,8,10,25-28 दौरान प्रेरित तंत्र के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. हाल ही में एक अध्ययन में, हम तनाव की बातचीत मैं एल के साथ कोशिकाओं और आंतों उपकला Caco -2 कोशिकाओं MDCK खबर दी है किIve amoebas, lysates और अमीबा उत्पादों टी जे रचना और TER 10 पर समान प्रभाव के कारण होता है. इस प्रकार, MDCK कोशिकाओं अमीबा-epithelia बातचीत के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल हैं. इसके अलावा, कई ई. का उपयोग हिस्टोलिटिका उत्पादों (बरकरार ट्रोफोजोइट्स, trophozoite कुल lysates या ट्रोफोजोइट्स संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के रूप में काटा स्रावित उत्पादों) ऐसे उपलब्धता, कार्रवाई, स्राव, अन्य अणुओं की भागीदारी के मोड और के ट्रिगर के रूप में इन संबंधों में शामिल अणुओं के बारे में अतिरिक्त और प्रासंगिक जानकारी प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है रास्ते संकेतन.

Confluency तक पहुंच गया है, जबकि उपकला कोशिकाओं टी जे और ए जे द्वारा स्थिर रहे हैं कि संपर्क के रूप में. इन संरचनाओं immunofluorescence stainings में विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके देखे जा सकते हैं कि कुछ अणुओं से बना रहे हैं. उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में, सेल संपर्कों टी जे मार्कर ZO-1 और एक लाल fluorescently प्रयोगशाला के खिलाफ एक एंटीबॉडी द्वारा कल्पना कर रहे हैंमाध्यमिक एंटीबॉडी eLED. यह देखा जा सकता है, कोशिकाओं किसी भी छेद के बिना एक घने monolayer फार्म के पास इकट्ठा होते हैं. इस चित्र में, अमीबा व्युत्पन्न जटिल EhCPADH112 उपकला सतह के साथ इस परिसर की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक हरे रंग की fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी से पता चला है कि एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग दाग दिया गया है. इस परिसर के तीन विभिन्न स्रोतों उपकला monolayer के लिए लागू किया गया है: लाइव ट्रोफोजोइट्स (टी), trophozoite कुल lysates (टीएल) और स्रावित उत्पादों (सपा). आश्चर्यजनक ढंग से, सभी मामलों में, ZO-1 के साथ EhCPADH112 के सह स्थानीयकरण इस जटिल ई. की सुविधा के लिए आवश्यक हो सकता है, यह दर्शाता है (चित्रा 3, तीर) मनाया जा सकता है उपकला monolayer में हिस्टोलिटिका प्रवेश.

इस बातचीत पहले से ही के रूप में जल्दी अमीबा उपकला सेल संपर्क के बाद 2 मिनट के रूप में मनाया जा सकता है ZO-1 धुंधला अभी भी सी लग रहा है, क्योंकि सेल परत अभी तक इस बातचीत से प्रभावित नहीं हैontinuous. चित्रा 4 में दिखाया गया है यह पूरी तरह से लंबे समय तक ऊष्मायन समय के बाद बदलता है. यहाँ, छवियों तीन अलग EhCPADH112 स्रोतों के लिए जोखिम के 30 मिनट के बाद लिया गया. टी जे का एक स्पष्ट व्यवधान सबसे स्पष्ट प्रभाव टी या टीएल साथ संपर्क में MDCK सेल में होने वाली के साथ, सेल सीमाओं पर एक टूटनेवाला ZO-1 धुंधला (चित्रा 4, तीर) द्वारा कल्पना है. इसके विपरीत, ZO-1 भाँति हो जाता है और intracellular vesicles में देखा जाता है. पार्श्व कोशिका झिल्ली के साथ टी जे या ए जे के साथ या तो सटीक सह स्थानीयकरण सिर्फ monolayer के शीर्ष पर देख बल्कि सेल संपर्कों 29 की एक "पक्ष" को देखने प्राप्त करने के द्वारा द्वारा प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. लेजर confocal माइक्रोस्कोपी 3 आंकड़े और प्रत्येक XY देखें नीचे 4 में प्रदर्शन के रूप XZ-अक्ष के साथ इस तरह के एक दृश्य की अनुमति देता है. इन छवियों बल्कि वे स्थित हैं, तो प्रोटीन पार्श्व झिल्ली की सबसे शिखर भाग में टी जे के साथ सह स्थानीय बनाना या कि क्या एक स्पष्ट बयान दिखानेटी जे नीचे या टी जे ऊपर शिखर झिल्ली पर. चित्रा 3 (तीर), ZO-1 के साथ EhCPADH112 परिसर के एक सटीक सह स्थानीयकरण स्पष्ट रूप से इस विषैलापन कारक के लिए कार्रवाई की जगह के रूप में टी जे खुलासा मनाया जा सकता है. इसके विपरीत, ई. के रूप में पार्श्व झिल्ली के साथ धुंधला हो जाना (चित्रा 4, तीर) के रूप में दिखाया हिस्टोलिटिका आक्रमण epithelia में (बातचीत के 30 मिनट) आगे बढ़े, EhCPADH112 कहनेवाला अंतरिक्ष की ओर प्रवेश कर. इस जटिल ही टी जे लेकिन नहीं बातचीत 10 की 2 मिनट में ए जे मार्कर β-catenin साथ occludin और claudin -1 मार्कर के साथ सह स्थानीयकृत क्योंकि हमारे कागज हाल ही में, इस विधि हमें टी जे और ए जे के बीच अंतर करने की अनुमति दी.

टी जे घटकों के internalization, चित्रा 4 में immunofluorescence stainings में देखा जा सकता है, आमतौर पर transepithelial विद्युत प्रतिरोध (आतंकवाद) द्वारा मापा जा सकता है कि बाधा समारोह की हानि के साथ है. TERउपकला monolayer भर आयन प्रवाह को दर्शाता है और चित्रा 2B में दिखाया गया है इलेक्ट्रोड का उपयोग करके मापा जा सकता है. Monolayer अभी तक पूरी तरह से गठन या कारण बाह्य cues के लिए बाधित नहीं किया जाता है, सेल परत में आयनों के मुक्त प्रवाह एक कम TER ने संकेत दिया है. आतंकवाद अमीबा उत्पादों या monolayers ट्रोफोजोइट्स के साथ संपर्क में (चित्रा 5) के साथ संपर्क में नहीं किया गया है कि एक नियंत्रण मिला हुआ monolayer के मापा गया था. परजीवी संपर्क नियंत्रण monolayers की तुलना में 90% की एक आतंकवाद बूंद ने संकेत दिया उपकला बाधा समारोह खलल डाल दिया. ट्रोफोजोइट्स बाधा समारोह को प्रभावित तंत्र है जिसके द्वारा जांच करने के लिए, हम लक्ष्य कोशिका क्षति के लिए महत्वपूर्ण इस जटिल और अन्य proteases की proteolytic गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए, यह जटिल या protease inhibitors के साथ के आसंजन को रोकने के लिए EhCPADH112 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ ट्रोफोजोइट्स पूर्व incubated. दोनों उपचार का सुझाव दे, आतंकवाद बूंद के एक लगभग पूरा उत्क्रमण के लिए प्रेरित कि प्रोटियोलिटिक दोनों गतिविधि और चिपकने वाला गुण ई. के दौरान इस परिसर के महत्वपूर्ण विषैलापन कारक हैं हिस्टोलिटिका आक्रमण.

चित्रा 1
चित्रा 1. Axenically खेती ई. की विशिष्ट वृद्धि वक्र ई. के 2 x 10 5 ट्रोफोजोइट्स की हिस्टोलिटिका ट्रोफोजोइट्स. inocula हिस्टोलिटिका एचएमआई-IMSS क्लोन एक TYI-S-33 के माध्यम से 6 अच्छी तरह से बर्तन में बड़े हो रहे थे और प्रत्येक 24 घंटा सेल नंबर के बाद एक hematocytomer का उपयोग निर्धारित किया गया है. सेलुलर विकास ऊपरी पैनल में दिखाया गया है बढ़ कोशिकाओं के प्रकाश माइक्रोस्कोपी और आकारिकी द्वारा नजर रखी थी. ट्रोफोजोइट्स की राशि 6 ​​दिनों (डी) के लिए नजर रखी थी और मूल्यों नीचे दिए गए चार्ट में प्लॉट किए जाते थे. डाटा मतलब है और तीन स्वतंत्र माप का मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. बार = 10 माइक्रोन./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
MDCK कोशिकाओं और ई. के अलग अलग परिस्थितियों के बीच बातचीत का चित्रा 2. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ई. के हिस्टोलिटिका. ए) विभिन्न स्थितियों हिस्टोलिटिका दिखाए जाते हैं: लाइव ट्रोफोजोइट्स (टी), कुल ट्रोफोजोइट्स lysates (टीएल) और मध्यम (सपा) में ट्रोफोजोइट्स द्वारा स्रावित अणुओं. किसी भी प्रयोगात्मक हालत मिला हुआ MDCK कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन के 2 और 30 मिनट के लिए assayed किया गया था. ऊष्मायन के बाद, MDCK कोशिकाओं बहुतायत ट्रोफोजोइट्स या अनबाउंड परजीवी अणुओं को दूर धोया गया. फिर नमूने mαEhCPADH112 और pαZO -1 antibod रोजगार, immunofluorescence assays के लिए प्रोसेस किया गयाएँ क्रमशः सह स्थानीय बनाना परजीवी जटिल EhCPADH112 और टी जे मार्कर ZO-1, के लिए. ट्रोफोजोइट्स के बाद, अलग fluorochromes के लिए युग्मित प्रजाति विशेष माध्यमिक एंटीबॉडी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा दोनों प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया. बी) के अलावा केवल या ट्रोफोजोइट्स transwells के ऊपरी डिब्बे में 4 डिग्री सेल्सियस पर mαEhCPADH112 या 20 मिनट के लिए protease inhibitors के साथ पूर्व incubated मिला हुआ MDCK कोशिकाओं से युक्त. उपकला कोशिकाओं के आतंकवाद 30 मिनट के दौरान, एक EVOM voltohmeter से जुड़े एक STX2 इलेक्ट्रोड का उपयोग कर नजर रखी थी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
MDCK monolayers के टी जे पर EhCPADH112 की चित्रा 3. स्थानीयकरण. MDCK कोशिकाओं incu थेलाइव ट्रोफोजोइट्स (टी), कुल ट्रोफोजोइट्स lysates (टीएल) और 2 मिनट के लिए मध्यम (सपा) में ट्रोफोजोइट्स द्वारा स्रावित अणुओं के साथ bated. ऊपरी पैनल: MDCK कोशिकाओं के चरण विपरीत छवियाँ. EhCPADH112 और ZO-1 प्रोटीन mαEhCPADH112 और pαZO -1 एंटीबॉडी द्वारा पहचान किए गए थे और उसके बाद क्रमश: FITC और TRITC माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ. नाभिक DAPI के साथ दाग रहे थे. तीर: सेल सीमाओं पर प्रोटीन स्थानीयकरण. Xz विमानों में तीर: टी जे में प्रोटीन स्थानीयकरण. बार = 10 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
MDCK कोशिकाओं में EhCPADH112 की चित्रा 4. Internalization. MDCK कोशिकाओं लाइव ट्रोफोजोइट्स (टी), कुल ट्रोफोजोइट्स lysates (टी के साथ incubated रहे थेएल) और 30 मिनट के लिए मध्यम (सपा) में ट्रोफोजोइट्स द्वारा स्रावित अणुओं. ऊपरी पैनल: MDCK कोशिकाओं के चरण विपरीत छवियाँ. EhCPADH112 और ZO-1 प्रोटीन mαEhCPADH112 और pαZO -1 एंटीबॉडी द्वारा पहचान किए गए थे और उसके बाद क्रमश: FITC और TRITC माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ. नाभिक DAPI के साथ दाग रहे थे. तीर: सेल सीमाओं पर प्रोटीन स्थानीयकरण. Xz विमानों में तीर: पार्श्व झिल्ली (तीर) में प्रोटीन स्थानीयकरण. बार = 10 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. ई. EhCPADH112 माध्यम हिस्टोलिटिका उपकला बाधा व्यवधान लाती है. MDCK monolayers लाइव ट्रोफोजोइट्स साथ incubated रहे थे(टी) या टी 30 मिनट और आतंकवाद संकेत समय पर मूल्यांकन किया गया था के लिए प्रोटीज अवरोधक (पीआई) या mαEhCPADH112 एंटीबॉडी (α) के साथ पहले से incubated. आतंकवाद प्रत्येक transwell के लिए प्रारंभिक मूल्य के अनुसार सामान्यीकृत था (~ 3200 Ω · 2 सेमी). साधन के साधन और मानक त्रुटियों हर बार बिंदु के लिए प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरह से एनोवा परीक्षण का उपयोग GraphPad चश्मे 5 सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया गया था. *** पी <0.001.

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Discussion

ई. द्वारा उपकला संक्रमण के दौरान इन विट्रो मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदेश में हिस्टोलिटिका, यह उपकला कोशिकाओं और ट्रोफोजोइट्स दोनों की अच्छी तरह से स्थापित संस्कृतियों के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, पूर्व, ई. हिस्टोलिटिका संस्कृतियों आमतौर पर बैक्टीरिया या trypanosomatids 22,23 के कुछ प्रजातियों के सहयोग से स्थापित किया गया था. ई. की हालांकि, सह खेती मेजबान कोशिकाओं पर मनाया प्रभाव स्पष्ट ameobas नहीं ठहराया जा सकता है बल्कि सह खेती की कोशिकाओं का एक प्रभाव हो सकता है क्योंकि हिस्टोलिटिका संस्कृतियों मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए उल्टा है. इस प्रकार, ई. के एक axenical संस्कृति हिस्टोलिटिका विशिष्ट मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की परीक्षा के लिए वांछनीय है. प्रदान की प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे ई. के ऐसे एक axenic खेती हिस्टोलिटिका विशेष रूप से संक्रमण के अध्ययन के लिए इस तरह की संस्कृतियों का फायदा उठाने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. साथ ही, समयई. की फसल की हिस्टोलिटिका भी महत्वपूर्ण है. ई. हिस्टोलिटिका फसल उच्च व्यवहार्यता के साथ कोशिकाओं के एक उच्च उपज सुनिश्चित करने के लिए बहुत तेजी से विकास की देर चरणों के दौरान की सिफारिश की है.

दूसरी ओर, उपकला कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से स्थापित monolayer प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए भी अनिवार्य है. एक physiologically तंग उपकला monolayer अनुकरण करने के लिए, संवर्धित कोशिकाओं सही समय पर इस्तेमाल किया जा जरूरत है. monolayer पूरी तरह से किसी भी छेद के बिना गठन किया जाना है. इसके अलावा, टी जे और ए जे के सही गठन सेल संपर्क स्थापित हो जाने के बाद कुछ समय की आवश्यकता है. आमतौर पर, उपकला कोशिकाओं कोशिकाओं यह कोशिकाओं के विकास का एक और दिन देने के लिए आम तौर पर बेहतर है, इसलिए है कि एक मिला हुआ monolayer में proliferating रोक जिसका अर्थ है कि संपर्क हिचकते हैं. हालांकि, यह इस संपर्क निषेध अनिश्चितकालीन नहीं है और कोशिकाओं कुछ बिंदु पर एक दूसरे को अधिक बढ़ना शुरू हो सकता है के बाद से विस्तार नहीं किया जाना चाहिए. इस मनाया जाता है यह विभाजन या डिस्क के लिए आवश्यक हो जाएगाएआरडी कोशिकाओं और नहीं assays में उन्हें इस्तेमाल करते हैं. तंग उपकला monolayers के गठन सर्वश्रेष्ठ आतंकवाद को मापने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. हालांकि, इस बल्कि महंगे हैं जो transwell फिल्टर, में वृद्धि की आवश्यकता है. एक अच्छा monolayer के लिए एक आंख विकसित करने के लिए विभिन्न सेल नंबर प्रसार के बाद ही खेती प्रारूप में सेल के विकास की तुलना करने के अनुभवहीन प्रयोगकर्ता के लिए मददगार हो सकता है.

मेजबान परजीवी बातचीत परख के समय एक और महत्वपूर्ण कारक है. बातचीत के 2 मिनट बाद, कोई उपकला क्षति मनाया जा सकता है लेकिन टी जे अणु ZO-1 के साथ EhCPADH112 की एक बातचीत पहले से ही स्पष्ट था. टी जे disassembly और आतंकवाद की एक बूंद (10 और इस अध्ययन) ने संकेत दिया लेकिन, जैसा कि 30 मिनट बातचीत के बाद, गंभीर उपकला क्षति मनाया गया. इन आंकड़ों शिखर उपकला पक्ष के साथ एक प्रारंभिक चिपकने बातचीत संपर्कों को ढीला और उसके बाद के लिए योगदान है कि इस तरह के proteases के रूप में अन्य अणुओं के प्रवेश को अनुमति देने के लिए आवश्यक है कि सुझाव हैअन्य टी जे, ए जे और desmosome अणुओं की गिरावट. ट्रोफोजोइट्स प्रोटीन की एकाग्रता भी महत्वपूर्ण है. लाइव ट्रोफोजोइट्स या बस lysates या ई. के स्रावित उत्पादों को लागू करने जब ​​ध्यान से, अलग परिणाम देखा जा सकता है हिस्टोलिटिका. उपकला कोशिकाओं को ट्रोफोजोइट्स के रिश्तेदार अनुपात में पहले 10 में सिद्ध किया गया था और अमीबा द्वारा MDCK से स्रावित उत्पादों का अनुपात (1:10) उच्च था, तब भी जब उपकला क्षति के रूप में गंभीर नहीं था. यह एक एकल डाह प्रोटीन की एकाग्रता महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी amoebas का तेजी से आक्रमण की अनुमति के लिए प्रभावी उपकला नुकसान में परिणाम है कि विभिन्न कारकों की परस्पर क्रिया हो सकता है कि न केवल इंगित करता है. उदाहरण के लिए, Chadee समूह उपकला क्षति 16 बटोर, एक और अमीबा व्युत्पन्न प्रोटीज, EhCP5 के महत्व पर प्रकाश डाला. यह डाह कारकों में से एक परस्पर क्रिया amoebiasis प्रेरित करने के लिए आवश्यक विवो में और है कि संभावना है कि inhibitio के कारण लापता बातचीतएक प्रोटीन का पता ज्यादातर मामलों में संक्रमण मौन हैं कि इस तथ्य के लिए खाते सकता है. इस संबंध में, यह इस तरह के mucins रूप उपकला उत्पादों संक्रमण के खिलाफ की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं कि उल्लेख करना भी महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, नाक आउट mucin2 चूहों EhCP5 प्रेरित टी जे परिवर्तन और संक्रमण से 16 अतिसंवेदनशील होते हैं. इस प्रकार, उपकला ओर परिवर्तन भी अमीबा invasiveness का आकलन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए.

सह स्थानीयकरण का पता लगाने में वर्णित तकनीकों में से एक महत्वपूर्ण सीमा है कि यह स्पष्ट है एक सीधी बातचीत को साबित नहीं करता है. इस मामले में, एक सह स्थानीयकरण या बातचीत भी सिर्फ कल्पना नहीं है कि एक और प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता हो सकता है. एक सीधी बातचीत का पता लगाने के लिए, यह पुनः संयोजक (जैसे जीएसटी या 10xHis के रूप में) टैग प्रोटीन का उत्पादन और अन्य के लिए एक टैग और पश्चिमी धब्बा के लिए immunoprecipitation प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. वैसे भी, immunofluorescence stainings EXA खुलासा करने का फायदा हैसीटी सेलुलर प्रोटीन परिसर के स्थान और प्रयोगकर्ता के इस तरह के एक में इन विट्रो बातचीत परख में परीक्षण किया जाना चाहिए कि प्रोटीन की एक विचार दे. एक और दोष उपलब्ध ही कुछ अमीबा विशिष्ट एंटीबॉडी है कि वहाँ है. ऐसा ही एक बातचीत पढ़ाई में कुछ अमीबा प्रोटीन का अध्ययन करना चाहता है, तो इस प्रकार, यह सबसे अधिक संभावना एक एंटीबॉडी की पीढ़ी की आवश्यकता होगी. एंटीबॉडी उपलब्ध हैं हालांकि, अगर वर्णित विधि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के लिए अन्य अमीबा प्रोटीन की प्रासंगिकता (स्रावित या सतह वाली) का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

इस पत्र में मेजबान और परजीवी के अणुओं के बीच सह स्थानीयकरण और बातचीत का पता लगाने के लिए एक आसान मॉडल का वर्णन करता है. इन सेल आधारित प्रयोगों से प्राप्त ज्ञान परजीवी द्वारा होस्ट आक्रमण के लिए शारीरिक प्रासंगिकता की पुष्टि करने के लिए हैम्स्टर्स या चूहों का उपयोग vivo में संक्रमण के मॉडल में लागू किया जा सकता है. ये आंकड़े तो उपन्यास उपचार रणनीति के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैtegies.

संक्षेप में, हम ई. की खेती के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान हिस्टोलिटिका और विशेष रूप से मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पढ़ाई, सह स्थानीयकरण और टी जे disassembly के मूल्यांकन की अनुमति है कि assays में उपयोग के लिए उपकला कोशिकाओं. संस्कृतियों के समय के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक परख के रूप में प्राप्त परिणामों के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. संस्कृतियों के समय फैलाया कोशिकाओं की संख्या अलग से प्रभावित हो सकता है, प्रयोगों के लिए खुद के समय को परख के प्रकार और जांच प्रोटीन के प्रकार पर निर्भर करता है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A  IMSS Hospital, Mexico Without/number Virulent trophozoites18 
TYI broth Becton, Dickinson and Company
Merck
Merck
Merck
J.T. Baker
Reproquifin
SIGMA-Aldrich
SIGMA-Aldrich		 211862
K35625437 626
21578
4873
3252-01
CAS 50-81-7
C7880
F-5879		 3.45% BBL Biosate peptone
58 mM glucose
39 mM NaCl
5 mM KH2PO4
6.5 mM K2HPO4
16.3 mM ascorbic acid
8.1 mM L-cysteine
0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult Microlab , Labs., Mex. SU146 Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80 In vitro SR-07 Use at 3%
Penicillin  Lakeside,  Méx. 34564SSA IV 0.5 IU/ml
Streptomycin  Lakeside,  Méx. 75757SSA IV 35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps Corning-Pyrex 9826-16X 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well Corning-Costar 3516 Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask Corning-Costar 430168 Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I American Type Culture Collection CCL34 Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium  Gibco  12800-017 Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum In vitro S-02 Use at 10%.  
Penicillin/Streptomycin mixture  In vitro  A-01 Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin   AMSA 398MJ94SSA IV Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution  In vitro EN-005 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask Corning-Costar 430720 Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports Corning-Costar 3470 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish   Corning-Costar 3524 Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini Roche 11836 153 001 Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM 
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) SIGMA-Aldrich E3132 Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1  Invitrogen 402200 IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112 Homemade antibody Without/ Number IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM Zymed 62-6811 Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) Zymed 816114 Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode World Precision Instrument  102711 Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter World Precision Instrument  12111 Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber MEARIENFELD 610610 Hemocytometer 
Leica TCS_SP5_MO Leica Without/number Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield Vector Laboratories, Inc. H-1000 Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) SIGMA D-9542 0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A-1310 0.5%  final concentration for blocking solution

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 88, EhCPADH112 सेल आसंजन MDCK Caco -2 तंग जंक्शन विघटन amoebiasis मेजबान रोगज़नक़ बातचीत संक्रमण मॉडल actin cytoskeleton
द्वारा उत्पादित उपकला नुकसान का विश्लेषण<em&gt; एटामोइबा हिस्टोलिटिका</em&gt; संक्रमण
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Betanzos, A., Schnoor, M.,… More

Betanzos, A., Schnoor, M., Javier-Reyna, R., García-Rivera, G., Bañuelos, C., Pais-Morales, J., Orozco, E. Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection. J. Vis. Exp. (88), e51668, doi:10.3791/51668 (2014).

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