Analisi del danno epiteliale Prodotto da Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51668

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Abigail Betanzos¹, Michael Schnoor², Rosario Javier-Reyna¹, Guillermina García-Rivera¹, Cecilia Bañuelos³, Jonnatan Pais-Morales¹, Esther Orozco¹

¹Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ²Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ³Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

Summary

L'infezione umana da Entamoeba histolytica porta ad amebiasi, una delle principali cause di diarrea nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da patogeno con cellule epiteliali intestinali, provocando l'apertura dei contatti cellula-cellula e di conseguenza diarrea, a volte seguita da infezione fegato. Questo articolo fornisce un modello per valutare le interazioni primi ospite-patogeno per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi.

Abstract

Entamoeba histolytica è l'agente eziologico di amebiasi umana, una delle principali cause di diarrea e di ascesso epatico nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da interazione del patogeno con le cellule epiteliali intestinali. Questa interazione porta alla rottura delle strutture intercellulari come giunzioni strette (TJ). TJ assicurare la chiusura dello strato epiteliale per separare tessuto ospite dal lume intestinale. Recenti studi forniscono prove che la rottura del TJ dalla proteina EhCPADH112 parassita è un prerequisito per E. invasione histolytica che è accompagnato da disfunzione della barriera epiteliale. Pertanto, l'analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nella TJ smontaggio durante E. histolytica invasione è di fondamentale importanza per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi. Questo articolo presenta un modello semplice che consente la valutazione delle interazioni iniziali ospite-patogeno e il potenziale parassita invasione. I parametri da analizzare sono transepithelial resistenza elettrica, l'interazione di EhCPADH112 con i recettori di superficie epiteliali, cambiamenti di espressione e la localizzazione di marcatori giunzionale epiteliali e la localizzazione delle molecole del parassita all'interno delle cellule epiteliali.

Introduction

Entamoeba histolytica è un singolo protozoo responsabile della amebiasi umana, un'infezione intestinale delle cellule causando infiammazione e diarrea. E. histolytica infetta fino a 50 milioni di persone ogni anno, ma solo circa il 10% delle persone infette sviluppano i sintomi associati a amebiasi ^1. L'infezione avviene per ingestione di alimenti contaminati o acqua contenente E. cisti histolytica. Nell'intestino, cisti producono trofozoiti vivi che aderiscono al colon mucina e proliferano ^2. Trofozoiti di solito si formano le cisti che vengono escreti con feci. In altri casi e per ragioni ancora sconosciute, trofozoiti rompere lo strato epiteliale intestinale e invadono i tessuti sottostanti. Nel peggiore dei casi, entrano nel flusso sanguigno e colpiscono altri organi come il fegato ^3.

Rompere la barriera epiteliale richiede interruzione di strutture transmembranal epiteliali che mantengono le cellule unite. Cellule epitelialicontatti sono formati dal complesso giunzionale apicale costituito stretto (TJ) e adherens giunzioni (AJ), e desmosomi ^4. Le giunzioni più apicali sono TJ, e quindi, sono la prima barriera offeso da E. histolytica e di alcuni altri agenti patogeni durante l'invasione host. TJ sono costituiti da recettori di adesione transmembranal come claudine, occludina e molecole di adesione giunzionale (JAM), che si impegnano in interazioni eterofili omo-o con i recettori della cellula vicina. Sono intracellulare vincolati da molecole impalcatura delle occludere zonula (SO) della famiglia che collegano recettori di adesione al citoscheletro di actina per fornire ulteriore resistenza meccanica all'epitelio. TJ sono responsabili per sigillare tessuto intestinale dal lume intestinale, impedendo all'acqua eccessiva e perdita soluto. Così, dopo TJ sono interrotti dal parassita, i tessuti sono invase. E. histolytica secerne diverse molecole quali: (i) quelli coinvolti nella adesione di amebe a targcellule et ^5; (Ii) fattori membrana attiva partecipano uccisione delle cellule ospiti per esocitosi, per esempio, i peptidi che formano canali ionici chiamati amoebapores ^6,7; e (iii) proteinasi che degradano le proteine ​​della matrice extracellulare e mediano tessuto disintegrazione ^5,8,9.

La cisteina proteasi EhCP112 e la molecola di adesione EhADH112 che insieme formano il complesso EhCPADH112 sono due E. histolytica virulenza proteine ​​che svolgono un ruolo importante nello smontaggio di TJ ^10. Trofozoiti vivi, loro lisati totali e prodotti secreti inducono cambiamenti molecolari nel TJ complesso e funzionale disturbo della barriera epiteliale. In questo studio, è dimostrato che EhCP112 e EhADH112 interagiscono con occludina e claudin-1 proteine ​​che portano alla internalizzazione e la degradazione delle proteine ​​cellulari, facilitando così E. ingresso histolytica attraverso la via paracellulare.

I nostri dati e quelli of altri gruppi di ^11-17 suggeriscono con forza la necessità di interazioni ospite-patogeno specifiche che consentono parassita invasione. Svelare le basi molecolari di queste interazioni è della massima importanza per una migliore comprensione della patogenesi amebiasi. Disturbo selettivo di TJ da trofozoiti, caratterizzate da un aumento della permeabilità paracellulare, può essere misurata da una diminuzione della resistenza elettrica transepiteliale (TER). Il trasferimento delle proteine ​​parassite verso epiteli ospitanti può essere determinato da immunofluorescenza e microscopia confocale, un metodo che può anche rivelare co-localizzazione di fattori di virulenza amebe con marcatori epiteliali giunzionale indicano possibili interazioni dirette. In questo articolo, descriviamo in dettaglio come le cellule epiteliali e trofozoiti sono coltivati, raccolti e manipolati per esaminare le interazioni ospite-patogeno e le loro conseguenze.

Protocol

1. Creazione e mantenimento di E. Culture histolytica

1. Crescere in condizioni asettiche (completamente libero di tutti gli altri organismi contaminanti) 1 x 10 ⁵ trofozoiti di Entamoeba histolytica ceppo HML: IMSS clonare un ¹⁸ a 16 x 125 mm tubi di coltura con teflon tappi a vite marittimo di linea (o 1 x 10 ⁶ trofozoiti in un usa e getta T- 25 beuta) e 15 ml (o 50 ml in T-25 pallone) di TYI-S-33 medio (TYI brodo supplementato con 3% Diamante vitamina miscela, siero inattivato bovino adulto 10% calore, 0,5 UI / ml di penicillina e 35 mg / ml streptomicina) ¹⁹ in un incubatore a 37 ° C.
2. Trofozoiti raccolto durante la fase di crescita logaritmica solito a intervalli 48-96 hr (Figura 1) raffreddando le provette di coltura per 5-10 minuti in un bagno di ghiaccio-acqua per liberare trofozoiti collegato al tubo di vetro cultura.
3. Trasferire la coltura in una provetta conica e capovolgere più volte per disperdere la cells. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro (camera di Neubauer), e trasferire un inoculo in una provetta di coltura contenente mezzo fresco TYI-S-33.
   1. Utilizzare basso numero di amebe per periodi più lunghi di incubazione (~ 3 x 10 ⁵ cellule per ~ 5 giorni) e un numero più elevato per periodi più brevi (~ 1 x 10 ⁶ cellule per ~ 1 giorno). Mentre inoculi contati sono auspicabili, culture stabiliti diventano prevedibili in modo che i volumi stimati di inoculi sono fattibili.
   2. Titolare l'importo trofozoiti per ottimizzare il numero di cellule per ogni esperimento.
   3. Mantenere una cultura duplicato parallelo di avere un back-up in caso di contaminazione accidentale o del tubo rottura.
4. Tubi tappo e li incubare a 37 ° C in un 5 ° angolo di inclinazione orizzontale.
5. Controllare le culture di ispezione visiva regolarmente, dal momento che una crescita eccessiva della cultura può contenere molte cellule lisate.

2. Creazione e mantenimento di MDCK Cultura </ P>

1. Grow MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cellule di tipo I (alta resistenza) in monouso T-75 beute da 10 ml di mezzo DMEM supplementato con penicillina (100 UI / ml), streptomicina (100 mg / ml), insulina (0,08 U / ml) e siero di vitello neonato 10% in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ e il 95% aria a 37 ° C.
2. Per dividere le celle, li controlla su un microscopio invertito. Dividere le celle quando sono ~ 85-100% confluenti.
3. Utilizzare un aspiratore a vuoto in una cappa sterile e sterile Pasteur pipetta di vetro per rimuovere il supporto dalla cultura. Per evitare di raschiare le cellule, girare il pallone di testa in giù e mezzi di aspirare dal basso.
4. Pipettare 10 ml di PBS preriscaldata (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4) in un pallone da T-75 (5 ml nel caso di un T-25 pallone ) e rock delicatamente il pallone per lavare le cellule. Rimuovere PBS tramite aspirazione a vuoto. Ampia lavaggio è richiesto dal siero inibisce la tripsina.
5. Pipettare 1,5 ml di 0,05% tripsina in un pallone T-75 (per T-25 pallone di usare 0,5 ml) e agitare delicatamente il pallone per coprire lo strato di cellule con tripsina.
6. Incubare per 5-10 minuti in incubatrice (il tempo esatto dipende dall'attività tripsina).
7. Verificare la presenza di distacco cella tenendo il pallone contro la luce e cercare scorre cellule. Distacco delle cellule (cellule arrotondate) può essere controllato utilizzando un microscopio. Spesso, cellule rilascio veloce con un breve, dolce slap al lato del pallone.
8. Aggiungere 15 ml di DMEM supplementato in un pallone T-75 (5 ml per un pallone T-25). Risospendere le cellule pipettando su e giù 4 o 5 volte.
9. Per propagare le celle, diluire sospensione cellulare 1:5 con fresco INTEGRAZIONI DMEM. Numero di celle può essere determinato anche, a questo punto con un emocitometro, ma questo è di solito necessario solo se dividere le celle in formati speciali per alcuni saggi.

3. Preparazione di Trofozoite totale lisati

1. Staccare trofozoiti da cutubi lture raffreddando la provetta per 5-10 minuti in un bagno di acqua e ghiaccio. Trasferire asetticamente coltura in una provetta conica e centrifugare a 360 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare attentamente il supernatante per decantazione, aggiungere PBS freddo al pellet, invertire la provetta diverse volte per disperdere le cellule e centrifugare di nuovo a 360 xg per 10 min. Ripetere questa operazione due volte per eliminare ogni traccia di Tyi-S-33 di media.
2. Determinare il numero trofozoiti con un emocitometro.
3. Lyse trofozoiti dai cicli di gelo-disgelo. Snap-congelare un inoculo misurata di trofozoiti (600.000 trofozoiti / ml) diluito in PBS freddo, in azoto liquido per 1 min. Sbloccare il campione a 4 ° C e agitare vigorosamente. Ripetere gelo e disgelo 3 volte per completare la lisi cellulare.
4. Attivare proteasi presenti nei lisati con 0,02% β-mercaptoetanolo.

4. Preparazione di Trofozoite secreto Prodotti

1. Eseguire le operazioni 3,1-3,2.
2. Determinarenumero di cellule e vitalità a questo punto con un emocitometro e applicando un test di esclusione del trypan blu ^20:
   1. Diluire 9 x 10 ⁶ trofozoiti in 3 ml di PBS freddo e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 ml. Prendere 10 ml di questa sospensione e aggiungere 1 ml di 0,4% trypan blu stock soluzione a pH 7.2.
   2. Utilizzare una camera di Neubauer per contare le cellule a basso ingrandimento.
   3. Contare tutte le cellule e separare il numero di cellule blu, poiché le cellule blu hanno preso il colorante e devono essere considerati morti.
   4. Calcolare la percentuale di cellule vitali dividendo il numero di cellule vitali per il numero totale di cellule e moltiplicando per 100.
3. Trasferire il tubo conico contenente la sospensione trofozoita in incubatore a 37 ° C per 2 ore in un 5 ° angolo di inclinazione orizzontale.
4. Per raccogliere i prodotti secreti, provette da centrifuga a 360 xg per 10 min. Usare una siringa monouso e sterile e raccogliere la su attenzionepernatant, evitando la contaminazione dei campioni con trofozoiti dal pellet. Eliminare tutte le cellule trasferite passando il surnatante attraverso una membrana di acetato di cellulosa 0,22 micron. Attivare proteasi con il 0,02% β-mercaptoetanolo.
5. Per eliminare putativo contaminazione indesiderata con molecole rilasciate dalle cellule morte, riapplicare il test di esclusione del trypan blu per la vitalità cellulare. Numero vitale e totale di celle deve essere lo stesso ottenuto nella fase 4.2. Se questo non è il caso, il supernatante raccolto può non solo contenere proteine ​​secrete e deve essere eliminata.

5. Interazione delle cellule MDCK con Trofozoiti, Trofozoite lisati o secrete Prodotti

1. Incubare confluenti monostrati cellulari MDCK con trofozoiti vivi (un rapporto MDCK-to-ameba 1:1), Trofozoite lisati (un rapporto di MDCK-to-ameba di 1:2) o di prodotti secreti (un rapporto MDCK-to-ameba di 1 : 10) a 37 ° C per 2 min e 30 (Figura 2A).
2. Lavare le cellule epiteliali cinque volte con PBS freddo per eliminare le molecole non legate o trofozoiti.

6. Preparazione dei campioni per immunofluorescenza

1. Cellule Cultura MDCK su vetrini sterili posti all'interno di una piastra di coltura cellulare di 24 multiwell. Ispezionare le celle del microscopio invertito fino a raggiungere il 100% di confluenza. Quindi, sostituire medio di 1 ml di DMEM fresco INTEGRATO medio e trasferire la piastra ad un incubatore a 37 ° C per 24 ore più.
2. Rimuovere il mezzo usando un aspiratore a vuoto e una sterile Pasteur pipetta di vetro e aggiungere 1 ml di PBS caldo a ciascun pozzetto. Rimuovere PBS e ripetere il lavaggio con PBS fresco. Fare attenzione a non raschiare cellule dal fondo del pozzetto con la pipetta di vetro.
3. Aggiungi diverse condizioni di trofozoiti diluito in 1 ml di PBS caldo: trofozoiti vivi (T), lisati totali trofozoita (TL) e prodotti secreti (SP).
   1. Mettere la piastra di coltura in incubatrice per 2 o 30 min.
   2. Preparare due condizioni di controllo: un tempo denominata 0 min, dove le cellule MDCK non devono essere incubate con E. histolytica ma solo con 1 ml di caldo PBS; e un'altra condizione come controllo anticorpi secondari, in questo caso incubare MDCK con T, TL o SP per 2 o 30 min e omettere incubazione con anticorpi primari.
4. Lavare le cellule epiteliali cinque volte con PBS freddo per eliminare le molecole non legate o trofozoiti.
5. Fissare e permeabilize le cellule con 1 ml di etanolo al 96% per 30 minuti a -20 ° C.
6. Per rimuovere l'etanolo, effettuare tre lavaggi rapidi di 1 ml di PBS a temperatura ambiente.
7. Effettuare le seguenti operazioni in una camera umida per evitare l'essiccamento dei campioni:
   1. Utilizzare qualsiasi scatola piatta disponibile che può essere chiuso e riempito con un tovagliolo di carta bagnata in cui i campioni possono essere inseriti in modo sicuro. Ad esempio, una casella di punta della pipetta vuota serve bene a questo scopo.
   2. All'interno della camera, in modo uniforme posizionare uno strato Parafilm e pipetta 25 ml di bloccoing soluzione (0,5% BSA) per ogni vetrino.
   3. Prendere coprioggetto su pozzetti con pinza sottile, rimuovere accuratamente il liquido in eccesso dal bordo con carta da filtro e mettere coprioggetto nella goccia contenente soluzione bloccante (0,5% BSA) con le cellule di fronte la soluzione di saturazione. Incubare i campioni per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Preparare una miscela di anticorpi primari in PBS: IgM anti-topo EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; 1:10) e IgG di coniglio anti-ZO-1 (pα-ZO-1; diluizione 1:100).
9. Mettere un foglio fresco Parafilm nella casella umida e pipetta 25 ml di soluzione di anticorpi per ogni vetrino.
10. Sollevare i coprioggetti dalla soluzione di blocco, asciugare il liquido in eccesso ai bordi con una carta da filtro, e metterli nelle gocce con le cellule di fronte alla soluzione di anticorpi. Incubare i campioni notte a 4 ° C.
11. Mettere ogni vetrino in un pozzo di 24 multipozzetto (lato cella in alto) e aggiungere 1 ml di PBS.
12. Preparare una miscela di anticorpi secondari fluorescenti in PBS: topo di capra anti-IgM accoppiato con FITC (diluizione 1:100) e di capra anti-IgG di coniglio accoppiato TRITC (diluizione 1:50).
13. Mettere un foglio fresco Parafilm in area umida e pipetta 25 ml di soluzione di anticorpi secondario per ogni vetrino.
14. Trasferire i campioni in 6.10 e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio per evitare sbianca dei coloranti fluorescenti. Ripetere passo 6.11.1.
15. Per la colorazione nucleare, incubare per 3 minuti con 200 ml di soluzione DAPI 0,05 mm a temperatura ambiente e proteggere dalla luce. Ripetere passo 6.11.1.
16. Per conservare i coloranti fluorescenti, posizionare i coprioggetti (cellule rivolti verso il basso) in 5 ml Vecta Shield antifade soluzione di montaggio su vetrini per microscopio. Sigillare le coprioggetto utilizzando smalto per evitare l'essiccazione del campione.
17. Per la conservazione a lungo termine, mantenere le diapositive di unabox vetrino da microscopio a -20 ° C.
18. Analizzare preparati mediante microscopia confocale attraverso tratti Z-stack e XZ-piani (Figura 2A).

7. Incubazione di Trofozoiti con inibitori della proteasi o anticorpo specifico

1. Ripetere i passaggi 3,1-3,2. Per ciascuna condizione sperimentale, incubare 1 x 10 ⁵ trofozoiti (risospese in 50 microlitri di PBS) con inibitori della proteasi (1 mM completi e 40 mcg / ml E-64) o 30 mg di anticorpo monoclonale contro EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ per 20 min a 4 ° C (Figura 2B). Utilizzare questi preparativi per saggi di co-incubazione come descritto al punto 8.5.

8. Misura della resistenza elettrica transepiteliale (TER)

1. Cultura cellule MDCK su sterili transwell supporti permeabili (0,4 micron di dimensione dei pori). Nel vano superiore, posizionare 100 microlitri di sospensione cellulare e nel vano inferioreVersare 600 ml di mezzo DMEM integrato.
   1. Controllare il livello medio periodicamente. Mezzo fresco può essere aggiunto come richiesto.
   2. Ispezionare le cellule su un microscopio invertito fino a raggiungere il 100% di confluenza. Cambiare medio ogni 2-3 giorni.
   3. Per migliorare l'adesione delle cellule (se necessario), equilibrare i filtri transwell notte a 37 ° C in DMEM prima dell'aggiunta della sospensione cellulare.
2. Sterilizzare elettrodi stx2 nella cappa per immersione in etanolo e poi in PBS sterile per 15 min ciascuno, sotto luce UV. Collegare gli elettrodi ad un epiteliale voltohmmeter Evom e selezionare la modalità di resistenza.
3. Raccogliere mezzo dal vano superiore di ogni transwell e piscina. Introdurre 50 ml di questa miscela Mezzi e combinarlo con 50 ml di sospensione trofozoiti (1 x 10 ⁵ trofozoiti in PBS) o con solo PBS (controllo). Utilizzare una miscela simile per ogni transwell.
4. Aggiungere miscele verso la camera superiore di ogni contenent transwellg cellule MDCK. Condizioni sperimentali includono cellule MDCK senza trofozoiti (controllo), una co-coltura con trofozoiti o con trofozoiti pre-incubate con inibitori della proteasi o mαEhCPADH112. Per eliminare la resistenza fornita dai filtri, utilizzare transwells incubate con solo mezzo. Per ciascuna condizione sperimentale usare almeno tre transwells.
5. Immediatamente, misurare TER immergendo gli elettrodi stx2 in ogni transwell.
   1. Assicurarsi che l'elettrodo non tocchi il fondo della camera inferiore e che l'elettrodo inferiore è coperta dal fluido nel vano superiore (vedere la Figura 2B).
   2. Assicurati di tenere gli elettrodi perpendicolarmente ogni volta. Ciò permetterà di migliorare la riproducibilità, in modo significativo. Evitare di spostare o inclinare l'elettrodo durante le misurazioni in quanto questo porterà alla variazione dei dati.
6. Questa misura dovrebbe essere considerato il valore iniziale TER. Poi, monitorare il TER durante la seguente30 min.
7. Per calcolare il valore TER finale, sottrarre il valore TER di soli filtri. Per confrontare i risultati di diversi esperimenti di normalizzare ogni punto dati ai valori iniziali, prendendo questi come 100% (Figura 2B).

Representative Results

Per un E. successo cultura histolytica, due importanti condizioni devono essere soddisfatte: la crescita in condizioni axeniche e raccolto in fase logaritmica. In precedenza, colture di E. histolytica erano facilmente stabilita in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids ^22. Tuttavia, al giorno d'oggi è comune avere la coltivazione axenic di questo parassita che significa un subcoltivazione indefinito di amebe in un ambiente privo di batteri che metabolizzano, funghi, protozoi, o cellule metazoi. Inoltre, la raccolta dei trofozoiti durante la fine del logaritmica ai primi di fase stazionaria della crescita è fondamentale avere cellule vitali e proliferanti ^23. Pertanto, è importante distinguere questa fase dalla quantificazione dei trofozoiti lungo diversi giorni e anche esaminando la loro morfologia intatta e locomozione rapida (Figura 1).

Per gli studi di interazione, le cellule epiteliali devono esserein un monostrato confluente di rappresentare condizioni fisiologiche che amebe normalmente incontrare nel corpo. Diverse linee cellulari epiteliali, facile da coltivare, sono disponibili. Mentre un più fisiologico sistema modello cellule deriverebbe dall'intestino come Caco-2 o T84, queste linee cellulari crescono piuttosto lentamente. Una linea cellulare a crescita più rapida che è stato ampiamente studiato sono cellule MDCK ^24. Queste cellule epiteliali sono di origine renale e sono caratterizzati da elevata TER, forte TJ e facile coltivazione. Questa linea cellulare è stata utilizzata per decenni per studiare la biologia cellulare delle giunzioni e la composizione TJ, nonché meccanismi di montaggio e smontaggio TJ. Per queste ragioni, cellule MDCK sono spesso scelti dai ricercatori studiando funzioni TJ. Cellule MDCK sono state anche ampiamente utilizzato come modello per lo studio dei meccanismi indotti durante amebiasi ^{5,8,10,25-28.} In un recente studio, abbiamo riportato che l'interazione del ceppo I MDCK cellule epiteliali intestinali e le cellule Caco-2 con lamebe Ive, lisati e prodotti ameba causato effetti simili sulla composizione TJ e TER ^10. Così, le cellule MDCK sono un modello adatto per studiare i meccanismi di interazione ameba-epiteli. Inoltre, l'uso di vari E. prodotti histolytica (trofozoiti intatte, trofozoita lisati totali o prodotti secreti raccolte come la cultura trofozoiti surnatante) è fondamentale per fornire informazioni aggiuntive e pertinenti sulle molecole coinvolte in queste interazioni, come la disponibilità, la modalità di azione, la secrezione, la partecipazione di altre molecole e attivazione di vie di segnalazione.

Mentre raggiungendo confluenza, le cellule epiteliali formano contatti che vengono stabilizzati da TJ e AJ. Queste strutture sono composti di molecole che possono essere visualizzati utilizzando anticorpi specifici in colorazioni di immunofluorescenza. Per esempio, nella Figura 3, i contatti cellulari vengono visualizzati mediante un anticorpo contro il marcatore TJ ZO-1 e un laboratorio fluorescente rossoELED anticorpo secondario. Come si può notare, le cellule si riuniscono in prossimità di formare una fitta monostrato senza alcun foro. In questa figura, il complesso EhCPADH112 ameba-derivato è stato macchiato utilizzando un anticorpo monoclonale che viene rilevata da un anticorpo secondario fluorescente verde per studiare l'interazione del complesso con la superficie epiteliale. Tre diverse fonti di questo complesso sono stati applicati per il monostrato epiteliale: trofozoiti vivi (T), lisati totali trofozoita (TL) e prodotti secreti (SP). Sorprendentemente, in tutti i casi, co-localizzazione di EhCPADH112 con ZO-1 può essere osservato (Figura 3, frecce), indicando che questo complesso potrebbe essere necessaria per facilitare E. penetrazione histolytica nel monostrato epiteliale.

Sebbene questa interazione può già essere osservata fin da 2 minuti dopo il contatto cellulare ameba-epiteliali, lo strato di cellule non è ancora influenzato da questa interazione in quanto la ZO-1 colorazione sembra ancora continuous. Questo cambia completamente dopo tempi di incubazione più lunghi come mostrato in Figura 4. Qui, le immagini sono state effettuate dopo 30 minuti di esposizione alle tre diverse fonti EhCPADH112. Una chiara discontinuità TJ è visualizzata con un discontinuo ZO-1 colorazione a bordi delle celle (Figura 4, frecce), con l'effetto più evidente che si verificano in cellule MDCK in contatto con T o TL. Per contro, ZO-1 viene internalizzata ed è visto in vescicole intracellulari. Esatta co-localizzazione sia con TJ o AJ lungo le membrane cellulari laterali non può essere distinto da solo guardando sulla cima del monostrato ma ottenendo un "lato" vista dei contatti cellulari ^29. Microscopio laser confocale consente una tale vista lungo l'asse xz come mostrato nelle figure 3 e 4 ogni vista xy. Queste immagini mostrano una chiara dichiarazione se le proteine ​​co-localizzano con TJ nella porzione più apicale della membrana laterale o se sono invece ubicatisotto o sopra TJ TJ sulla membrana apicale. In Figura 3 (frecce), un esatto co-localizzazione del complesso EhCPADH112 con ZO-1 possono essere osservate, chiaramente rivelando TJ come luogo di azione per questo fattore di virulenza. Al contrario, come E. histolytica invasione progredito (30 min di interazione) nel epiteli, EhCPADH112 penetrato verso lo spazio intercellulare come la colorazione lungo la membrana laterale ha mostrato (Figura 4, frecce). Nel nostro recente lavoro, questo metodo ci ha permesso di distinguere tra TJ e AJ, perché questo complesso unico co-localizzato con il TJ marcatori occludina e claudin-1, ma non con l'AJ marcatori β-catenina a 2 min di interazione ^10.

Internalizzazione di componenti TJ, come si può vedere nelle colorazioni di immunofluorescenza in figura 4, è di solito accompagnata da una perdita della funzione di barriera che può essere misurata con resistenza elettrica transepiteliale (TER). TERriflette il flusso di ioni attraverso il monostrato epiteliale e può essere misurata usando elettrodi come illustrato nella Figura 2B. Quando il monostrato non è ancora completamente formato o interrotto a causa di segnali extracellulari, un libero flusso di ioni attraverso lo strato di cellule è indicato da una bassa TER. TER è stata misurata di un monostrato confluente controllo che non è stato in contatto con i prodotti ameba o monostrati a contatto con trofozoiti (Figura 5). Contatto parassita interrotto funzione della barriera epiteliale indicato da una goccia TER del 90% rispetto ai monostrati di controllo. Per studiare i meccanismi con cui trofozoiti influenzano la funzione di barriera, si pre-incubate trofozoiti con un anticorpo contro EhCPADH112 per impedire l'adesione di questo complesso o con inibitori della proteasi, per bloccare l'attività proteolitica di questo complesso e di altre proteasi importanti per i danni alle cellule bersaglio. Entrambi i trattamenti hanno portato ad un rovesciamento quasi completa di TER goccia, suggerendo che sia proteolitica attività e adesivi proprietà sono importanti fattori di virulenza di questo complesso durante E. invasione histolytica.

Figura 1. Curva di crescita tipica di condizioni asettiche coltivata E. trofozoiti histolytica. inoculi di 2 x 10 ⁵ trofozoiti di E. histolytica HMI-IMSS clone A sono state coltivate in piatti 6 pozzetti con Tyi-S-33 medio e dopo ogni 24 numeri cellulari hr sono stati determinati utilizzando un hematocytomer. Crescita cellulare è stata monitorata mediante microscopia ottica e la morfologia delle cellule in crescita è raffigurato nel pannello superiore. La quantità di trofozoiti è stato monitorato per 6 giorni (d) e valori sono stati tracciati nel grafico qui sotto. I dati rappresentano la media e l'errore standard della media di tre misurazioni indipendenti. Barra = 10 micron./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Rappresentazione schematica delle interazioni tra cellule MDCK e le diverse condizioni di E. histolytica. A) Diverse condizioni di E. histolytica sono presenti: trofozoiti vivi (T), in totale trofozoiti lisati (TL) e molecole secrete dai trofozoiti nel mezzo (SP). Qualsiasi condizione sperimentale è stato saggiato per 2 e 30 min di incubazione con cellule MDCK confluenti. Dopo l'incubazione, le cellule MDCK sono stati abbondantemente lavati per rimuovere trofozoiti o molecole non legate parassiti. Poi i campioni sono stati processati per le analisi di immunofluorescenza, impiegando mαEhCPADH112 e pαZO-1 antibodzioni di co-localizzare il parassita EhCPADH112 complesso e il marcatore TJ ZO-1, rispettivamente. Successivamente, anticorpi secondari specie-specifici accoppiati a diversi fluorocromi sono stati usati per rilevare entrambe le proteine ​​mediante microscopia confocale. B) aggiunta di trofozoiti solo o trofozoiti pre-incubate con mαEhCPADH112 o inibitori della proteasi per 20 min a 4 ° C nella zona superiore del transwells contenente cellule MDCK confluenti. TER delle cellule epiteliali è stata monitorata utilizzando un elettrodo stx2 collegato ad un voltohmeter Evom, durante 30 min. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Localizzazione di EhCPADH112 a TJ di monostrati MDCK. Cellule MDCK erano incusospeso con trofozoiti vivi (T), in totale trofozoiti lisati (TL) e molecole secrete dai trofozoiti nel mezzo (SP) per 2 min. Pannello superiore: immagini a contrasto di fase di cellule MDCK. EhCPADH112 e ZO-1 proteine ​​sono state identificate da mαEhCPADH112 e pαZO-1 anticorpi e poi con FITC e TRITC-anticorpi secondari, rispettivamente. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Frecce: localizzazione delle proteine ​​a bordi delle celle. Punte di freccia in xz piani: localizzazione proteica a TJ. Bar = 10 micron. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Internalizzazione di EhCPADH112 in cellule MDCK. Cellule MDCK sono state incubate con trofozoiti vivi (T), in totale trofozoiti lisati (TL) e molecole secrete da trofozoiti nel mezzo (SP) per 30 min. Pannello superiore: immagini a contrasto di fase di cellule MDCK. EhCPADH112 e ZO-1 proteine ​​sono state identificate da mαEhCPADH112 e pαZO-1 anticorpi e poi con FITC e TRITC-anticorpi secondari, rispettivamente. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Frecce: localizzazione delle proteine ​​a bordi delle celle. Punte di freccia in xz piani: localizzazione proteica a membrana laterale (punte di freccia). Bar = 10 micron. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. E. histolytica via EhCPADH112 induce perturbazione barriera epiteliale. monolayers MDCK sono state incubate con trofozoiti vivi(T) o T pre-incubate con inibitori della proteasi (PI) o mαEhCPADH112 anticorpo (α) per 30 min e TER è stato valutato a tempi indicati. TER è stata normalizzata in base al valore iniziale per ciascun transwell (~ 3200 Ω · cm ^2). Mezzi e errori standard dei mezzi sono rappresentati per ogni punto temporale. L'analisi statistica è stata effettuata con il software GraphPad Prism 5 utilizzando il test ANOVA. *** P <0,001.

Discussion

Per studiare in vitro le interazioni ospite-patogeno in corso di infezione da E. epiteliale histolytica, è fondamentale lavorare con le culture consolidate di entrambe le cellule epiteliali e trofozoiti. Ad esempio, in passato, E. culture histolytica erano stati di solito stabiliti in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids ^22,23. Tuttavia, co-coltivazione di E. culture histolytica è controproducente per lo studio delle interazioni ospite-patogeno perché gli effetti osservati sulle cellule ospiti non potevano inequivocabilmente essere attribuiti alle ameobas ma potrebbe piuttosto essere un effetto delle cellule co-coltivate. Così, una cultura axenical di E. histolytica è auspicabile per l'esame di specifiche interazioni ospite-patogeno. Il protocollo fornito descrive come un tale coltura axenic di E. histolytica può essere realizzato appositamente per sfruttare al meglio tali colture per gli studi di infezione. Inoltre, i tempidel raccolto di E. histolytica è anche critico. E. raccolto histolytica è raccomandato durante ultimi stadi di crescita esponenziale per garantire un elevato rendimento di cellule con alta vitalità.

D'altra parte, un monostrato consolidata di cellule epiteliali è inoltre obbligatorio ottenere risultati riproducibili. Per emulare un monostrato epiteliale fisiologicamente stretto, cellule coltivate devono essere utilizzati al tempo giusto. Il monostrato deve essere completamente formato senza fori. Inoltre, la corretta formazione del TJ e AJ richiede un certo tempo dopo contatti cellulari sono stabiliti. Di solito, le cellule epiteliali sono contatto inibito, il che significa che le cellule proliferanti fermano in un monostrato confluente, in modo che di solito è meglio dare le cellule altro giorno di crescita. Tuttavia, questo non deve essere ampliato poiché questa inibizione da contatto non è indefinita e cellule può ad un certo punto inizia a invadere l'altro. Se questa è osservato sarà necessario dividere o discocellule ARD e non li usano nei test. La formazione di monostrati epiteliali stretti è meglio controllata misurando TER. Tuttavia, ciò richiede crescita transwell filtri, che sono piuttosto costosi. Per sviluppare un occhio per una buona monostrato può essere utile per lo sperimentatore inesperto per confrontare la crescita delle cellule nello stesso formato di coltivazione dopo la diffusione di vari numeri di cellulare.

La tempistica del saggio interazione ospite-parassita è un altro fattore cruciale. Dopo 2 min di interazione, nessun danno epiteliale potrebbe essere osservata ma un'interazione di EhCPADH112 con la molecola TJ ZO-1 era già evidente. Tuttavia, dopo 30 min interazione, grave danno epiteliale è stato osservato come indicato da TJ smontaggio e una goccia di TER ⁽¹⁰ e questo studio). Questi dati suggeriscono che una rapida interazione adesivo con il lato epiteliale apicale è necessario allentare i contatti e consentire la penetrazione di altre molecole come proteasi che poi contribuiscono adegradazione di altri TJ, AJ e desmosomi molecole. La concentrazione delle proteine ​​trofozoiti è importante. Da segnalare, diversi risultati potrebbero essere osservati quando si applicano trofozoiti vivi o solo lisati o prodotti secreti di E. histolytica. La proporzione relativa dei trofozoiti a cellule epiteliali è stato precedentemente dimostrato ¹⁰ e anche quando il rapporto di MDCK-to-secreto-prodotti da amebe era alto (1,10), il danno epiteliale non era così grave. Questo non solo indica che la concentrazione di una singola proteina virulenza è critica ma che potrebbe anche essere l'interazione di vari fattori che provocano danno epiteliale efficace per consentire una rapida invasione di amebe. Ad esempio, il gruppo di Chadee ha sottolineato l'importanza di un altro proteasi ameba-derivato, EhCP5, di suscitare danno epiteliale ^16. Sembra probabile che un gioco di fattori di virulenza in vivo è necessaria per indurre amebiasi e che le interazioni mancanti a causa di inhibition di una singola proteina può spiegare il fatto che nella maggior parte dei casi le infezioni sono quiescenti. A questo proposito, è anche importante ricordare che i prodotti epiteliali come mucine sono importanti per la protezione contro l'infezione. In particolare, mucin2 knock-out topi sono più suscettibili ad alterazioni TJ EhCP5-indotte e le infezioni ^16. Così, alterazioni sul lato epiteliale anche bisogno di essere considerati per valutare ameba invasività.

Una importante limitazione delle tecnologie descritte per rilevare co-localizzazione è che non inequivocabilmente dimostrare una interazione diretta. In questo caso, un'interazione co-localizzazione o potrebbe essere mediato anche da un'altra proteina che non è solo visualizzato. Per rilevare una interazione diretta, sarà necessario produrre ricombinanti targhetta (come GST o 10xHis) proteine ​​ed eseguire immunoprecipitazione per una tag e Western blot per l'altro. In ogni modo, colorazioni di immunofluorescenza hanno il vantaggio di rivelare la exalocalizzazione cellulare ct del complesso proteico e dare sperimentatore un'idea delle proteine ​​che devono essere testate in un tale saggio di interazione in vitro. Un altro inconveniente è che ci sono solo pochi anticorpi specifici amebe disponibili. Così, se si vuole studiare alcune proteine ​​amebe in tali studi di interazione, molto probabilmente comportare la produzione di un anticorpo. Tuttavia, se gli anticorpi sono disponibili, i metodi descritti possono essere applicati a studiare la rilevanza di altre proteine ​​amebe (secreto oppure superficie-bound) per interazioni ospite-patogeno.

Questo articolo descrive un modello facile da rilevare co-localizzazione e le interazioni tra le molecole di ospite e parassita. Le conoscenze acquisite da questi esperimenti a base di cellule può essere applicato in vivo in modelli di infezione con criceti o topi per corroborare la rilevanza fisiologica per l'invasione ospite dal parassita. Questi dati possono poi essere utilizzati per lo sviluppo di nuovi trattamenti Strategie.

In sintesi, forniamo protocolli dettagliati per la coltivazione di E. histolytica e le cellule epiteliali per l'utilizzo in studi di interazione ospite-patogeno, in particolare, le analisi che consentano la valutazione di co-localizzazione e TJ smontaggio. La tempistica delle culture così come quella di ogni saggio è fondamentale per garantire la riproducibilità dei risultati ottenuti. Mentre tempistica delle culture può essere influenzata variando il numero di cellule disseminate, i tempi degli esperimenti stessi dipende dal tipo di dosaggio e il tipo di proteine ​​indagate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution