Summary
Entamoeba histolytica insan enfeksiyon amebiazisli, tropikal ülkelerde ishal önemli bir nedeni yol açar. Enfeksiyon, hücre-hücre kontaktların açılmasına ve dolayısıyla ishal, bazen karaciğer enfeksiyonu tarafından takip edilen tahrik, intestinal epitel hücreleri ile patojenik etkileşimleri ile başlatılır. Bu makale Amebiazis patogenezinde anlayışımızı geliştirmek için erken konak-patojen değerlendirmek için bir model sunar.
Abstract
Entamoeba histolytica insan amebiazisli etkeni, tropikal ülkelerde ishal ve karaciğer apsesi önemli bir nedenidir. Enfeksiyon intestinal epitel hücreleri ile patojenin etkileşimle başlatılır. Bu etkileşim, örneğin sıkı bir birleşme (TJ) arası yapılar olarak bozulmasına yol açar. TJ bağırsak lümeninden ana doku ayırmak için epitel tabakasının sızdırmazlık sağlar. Son çalışmalar parazit protein EhCPADH112 tarafından TJ bozulma E. için bir ön koşul olduğunu kanıt epitel bariyeri disfonksiyonu eşlik histolytica işgali. Bu nedenle, E sırasında TJ sökme katılan moleküler mekanizmaların analizi histolytica işgali Amebiazis patogenezinde anlayışımızı geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Bu makale ilk konak-patojen etkileşimleri değerlendirme ve parazit işgali potansiyelini sağlayan kolay bir model sunuyor. Analiz edilecek parametreler t katmakransepithelial elektriksel direnç, epitel yüzey reseptörleri, ifade değişiklikleri ve epitel kavşak işaretleri ve epitel hücrelerin içinde parazit moleküllerin localisation ile EhCPADH112 etkileşimi.
Introduction
Entamoeba histolytica iltihabı ve ishal. E. neden insan amebiazisli, bir bağırsak enfeksiyonu sorumlu tek bir hücre protozoandır histolytica yıllık 50 milyon kişiye kadar bozar, fakat enfekte kişilerin sadece yaklaşık% 10 amebiazisli 1 ile ilişkili belirtiler gelişir. Enfeksiyon E. içeren kontamine gıda veya su yenmesi üzerine oluşur histolytica kistleri. Bağırsak, kolon kistler müsin uygun ve 2 çoğalan canlı trophozoit üretir. Trofozoitleri genellikle dışkı yoluyla atılır kistler oluşturur. Diğer durumlarda ve henüz bilinmeyen nedenlerle, trofozoitleri bağırsak epitel tabakası kırmak ve alttaki dokulara işgal. En kötü durumda, onlar kan dolaşımına girer ve bu tür karaciğer 3 gibi diğer organları da etkileyebilir.
Epitelyal bariyer kırma katıldığı epitel hücreleri korumak transmembranal yapıların bozulma gerektirir. Epitel hücreiletişim sıkı (tj) 'den oluşan apikal junctional kompleksi tarafından oluşturulur ve bağlantı yerleri (AJ) adherens ve 4 dezmozomlar edilir. En apikal kavşaklar TJ, ve bu nedenle, E affronted ilk engel vardır konak işgali sırasında histolytica ve diğer bazı patojenler. TJ örneğin, komşu hücre reseptörleri ile homo-ya da heterofilik etkileşimleri meşgul klaudin, occludin ve kavşak yapışma molekülleri (JAM) halinde transmembranal yapışma reseptörlerinin oluşmaktadır. Bunlar hücre içi epitel daha fazla mekanik güç sağlamak için aktin hücre iskeletinin yapışma alıcıları (ZO) aile zonula okludinler iskele molekülleri tarafından bağlanmıştır. TJ fazla su ve madde sızıntısını önlemek, bağırsak lümeninden bağırsak doku sızdırmazlık sorumludur. TJ parazit tarafından bozulur sonra Böylece, dokular işgal edilir. E. (i) Targ için amip yapışmasıyla dahil olanlar: histolytica gibi çeşitli moleküller salgılarve hücreler 5; Ekzositoz ile konakçı hücrelerin öldürülmesi katılan (ii) zar aktif faktörleri, örneğin adlandırılır iyon kanalı oluşturucu peptidler 6,7 amebaporlar; ve (iii) hücre dışı matriks proteinlerini yıkıma uğratma ve doku parçalanması aracılık proteinazlar, 5,8,9.
Birlikte EhCPADH112 kompleks meydana sistein proteaz EhCP112 ve adezyon molekülü EhADH112 iki E. vardır histolytica TJ 10 sökme de önemli bir rol oynamaktadır proteinleri virülansa. Canlı trofozoitleri, toplam lizatları ve salgılanan ürünler epitel bariyerin TJ karmaşık ve işlev bozuklukları moleküler değişikliklere sebep olur. Bu çalışmada, EhCP112 EhADH112 ve bu nedenle örneğin, kolaylaştırıcı, occludin ve içselleştirme ve hücre proteinleri degradasyonuna götüren Claudin-1 proteinleri ile etkileşim olduğu gösterilmiştir paraselüler yolu aracılığıyla histolytica giriş.
Bizim veri ve bu of diğer gruplar 11-17 şiddetle parazit istilasına izin özgü konak-patojen etkileşimleri gerekliliğini göstermektedir. Bu etkileşimlerin moleküler temelini çözülüp Amebiazis patogenezi daha iyi anlaşılması için büyük önem taşımaktadır. Artan paraselüler geçirgenliği ile karakterize trophozoit ile TJ selektif bozukluğu, transepitelyal, elektrik direncinde bir azalma (TER) ile ölçülebilir. Ev sahibi epitel doğru parazit proteinleri aktarım immünofloresan boyama ve konfokal lazer mikroskopisi, ayrıca olası doğrudan etkileşimleri gösteren epiteliyal birleşim yeri belirteçleri ile amoeba hastalık oluşturma faktörlerinin eş-lokalizasyonu ortaya bir yöntem ile belirlenebilir. Bu yazıda, epitel hücreleri ve trofozoitleri, ekili hasat ve konak-patojen etkileşimleri ve sonuçlarını incelemek için manipüle nasıl ayrıntılı olarak açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
E. 1.. Kuruluş ve Bakım histolytica Kültürler
- (Diğer tüm kirletici organizmaların tamamen ücretsiz) aksenik biçimde büyümeye Entamoeba histolytica gerginlik hml 1 x 10 5 trofozoitleri: IMSS Teflon liner vidalı kapaklar (ya da bir tek T-1 x 10 6 trofozoitleri ile 18 125 x 16 mm kültür tüpleri klonlamak Şişe, 25) ve 15 ml (veya TYI-S-33 ortamı içinde T-25 bir şişede 50 mi) (TYI suyu% 3 Diamond vitamin karışımı,% 10 ısı ile inaktive edilmiş yetişkin sığır serumu, 0.5 IU / ml penisilin ve 35 ug ile desteklenmiş / ml 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde streptomisin) 19
- 48-96 saatlik aralıklarla, genellikle, logaritmik büyüme fazının camdan yapılmış bir kültür tüpüne bağlı trophozoit serbest bırakmak için bir buz-su banyosu içinde 5-10 dakika için kültür tüpleri soğutma ile (Şekil 1) hasat trofozoitleri.
- Konik tüp içine kültür transferi ve cel dağıtmak için bunu birkaç kez ters çevirinls. Hemasitometre (Neubauer odası) kullanılarak hücre sayısını belirlemek ve taze TYI-S-33 orta içeren bir kültür tüpünün içine bir inokulum aktarın.
- Uzun inkübasyon sürelerine (~ 5 gün boyunca ~ 3 x 10 5 hücreleri) ve daha kısa süreler için daha yüksek bir sayı (~ 1 gün ~ 1 x 10 6 hücre) için amip düşük numaraları kullanın. Sayılır uygulanması gibi arzu edilir olsa da inokulum tahmini miktarlar mümkün olduğu kadar, kültürler kuruldu tahmin edilebilir hale gelir.
- Her deney için hücre sayıları optimize trophozoit miktarının titre edilir.
- Yanlışlıkla kirlenme veya tüp kırılması durumunda bir back-up için bir paralel yinelenen kültürünü korumak.
- Cap borular sıkı ve yatay açı hareket ettirildiğinde, 5 ° 'de 37 ° C'de inkübe.
- Kültürün aşırı büyüme çok lize edilmiş hücreler içeren olabilir çünkü, düzenli olarak görsel inceleme ile Kültürleri kontrol et.
MDCK Kültür 2.. Kuruluş ve Bakım </ P>
- (Madin Darby Köpek Böbrek) hücre / 0.08 U (insülin, penisilin (100 IU / ml), streptomisin (100 mg / ml) ile takviye edilmiş DMEM ortamı içinde, 10 ml ile tek T-75 şişelerinde I (yüksek direnç) tip MDCK büyümek 37 ° C'de,% 5 CO2 ve% 95 havadan oluşan nemli bir atmosferde mi) ve% 10 yeni doğmuş buzağı serumu
- Hücreleri bölmek için, ters bir mikroskop onları kontrol edin. Onlar ~% 85-100 konfluent olduğunda hücreleri bölün.
- , Steril bir başlık ve kültürden ortamı çıkarmak için steril bir cam Pasteur pipet bir vakum aspiratör kullanın. Hücreleri kazıma önlemek için, alt köşesinden ters şişesi ve aspirat medya açmak.
- Bir T-25 şişenin durumunda (5 mi bir T-75 şişe içine önceden ısıtılmış PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) 10 ml dağıtın ) ve yavaşça hücreleri yıkamak için şişeye sallayın. Vakum aspirasyon ile PBS çıkarın. Serum tripsin inhibe beri geniş yıkama gereklidir.
- (T-25 balonuna 0.5 ml kullanımı) ve yavaşça tripsin ile hücre katmanı kapsar için şişeyi kaya bir T-75 balon içine,% 0.05 tripsin 1.5 ml dağıtın.
- Inkübatör 5-10 dakika (tam olarak ne zaman tripsin aktivitesi bağlıdır) için inkübe edin.
- Işığa karşı şişeyi tutarak hücre dekolmanı kontrol edin ve hücreleri akan arayın. Hücre dekolmanı (yuvarlak hücreler) de bir mikroskop kullanılarak kontrol edilebilir. Çoğu zaman, hücreler, şişenin yan tarafına hızlı bir yumuşak, tokat ile hızlı serbest bırakın.
- Bir T-75 balonuna (a T-25 balonuna boyunca 5 mi) ile takviye edilmiş DMEM, 15 ml. Yukarı ve aşağı pipetleme 4 veya 5 kez hücreleri yeniden süspanse.
- Hücrelerini yaymak için, taze katkılı DMEM ile hücre süspansiyonu 01:05 sulandırmak. Hücreler sayısı da bir hemositometre kullanılarak bu noktada tespit edilebilir ancak bazı işlemler için özel biçimleri içine hücrelerin bölünmesi durumunda bu genellikle gereklidir.
Trophozoite Toplam Lizatlarmm 3. Hazırlanması
- Cu dan trophozoit AyırBir buz-su banyosu içinde 5-10 dakika için soğutma tüpü ile LTURE boruları. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 360 x g'de konik bir tüp ve santrifüj içine kültür aseptik olarak transfer Dikkatle, dekantasyon ile süpernatantı atmak topağa buz soğukluğunda PBS ekleyin, 10 dakika boyunca 360 x g hızında tekrar santrifüj hücreleri ve dağıtmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. TYI-S-33 orta tüm izlerini kaldırmak için iki kez bu adımı tekrarlayın.
- Hemasitometre kullanarak trofozoitleri numarasını belirler.
- Lyse donma-çözülme döngüleri trophozoit. 1 dakika boyunca sıvı azot içinde, buz gibi soğuk PBS içinde seyreltilmiş trophozoit ölçülü bir inokulum (600,000 trofozoitleri / ml) Kopma-dondurma. Kuvvetli bir şekilde 4 ° C ve vorteks de örnek etkisiz hale getirmek. Hücre parçalanmasını tamamlamak için donma ve çözülme 3 kez tekrarlayın.
- % 0.02 β-mersaptoetanol ihtiva eden lizatları içinde mevcut proteazlar etkinleştirir.
Trophozoite Salgılanmış Ürünler 4. Hazırlanması
- Adımları 3,1-3,2 gerçekleştirin.
- BelirlemekHemasitometre kullanarak ve tripan mavi dışlama testi 20 uygulayarak bu noktada hücre sayısı ve canlılığı:
- 50 ml konik tüp içine 9 x 10 6 3 ml buz gibi soğuk PBS trophozoit ve transfer hücreleri seyreltin. Bu süspansiyonun 10 ul alın ve% 0.4 tripan mavi stok solüsyonu pH değeri 7.2 olan 1 ul ekle.
- Düşük büyütmede hücreleri saymak için bir Neubauer odasını kullanın.
- Tüm hücre sayımı ve mavi hücrelerin boya içine alındı ve bu yüzden ölü kabul edilmelidir, çünkü mavi hücrelerin sayısını ayırın.
- Toplam hücre sayısına göre canlı hücre sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile canlı hücre yüzdesini hesaplayın.
- Yatay açıyı hareket ettirildiğinde, 5 ° 'de 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübatör içine trophozoite süspansiyonu içeren konik tüp aktarın.
- 10 dakika için 360 xg salgılanan ürünleri, santrifüj tüpleri toplamak için. Bir tek ve steril şırınga kullanmak ve dikkatle SU toplamakpernatant, topaklardan trophozoit ile örnekleri kirlenmesini önlemek. 0.22 mikron selüloz asetat membrandan süpernatan geçirilerek herhangi bir transfer hücreleri ortadan kaldırır. % 0.02 β-merkaptoetanol ile proteazlar etkinleştirir.
- Ölü hücrelerden salınan moleküllerin farazi istenmeyen kontaminasyonu silmek için, hücre canlılığı tripan mavi dışlama testi uygulamalısınız. Adım 4.2 'de elde edilen ve uygun bir hücre toplam sayısı ile aynı olmalıdır. Bu durumda değilse, toplanan süpernatan ihtiva edebilir salgılanan proteinleri, sadece ve atılmalıdır.
Trophozoit, trophozoite lizatları veya Salgılanmış Ürünleri MDCK Hücreler 5. Etkileşim
- Canlı trophozoit (1:1 lik bir MDCK-to-amip oranında) ile birleşik MDCK hücre mono tabakaları inkübe, trophozoite lizatları (bir MDCK-to-amip 1:2 oranı) veya salgılanan ürünleri (1 arasında bir MDCK-to-amip oranı : 10) 2 ve 30 dakika boyunca (Şekil 2A) boyunca 37 ° C'de.
- İlişkisiz molekülleri ya trophozoit ortadan kaldırmak için buz gibi soğuk PBS ile bir epitel hücreler beş kez yıkayın.
Immünofloresans için 6 Numunelerin. Hazırlanması
- 24-çok-yuvalı hücre kültürü çanağı içine yerleştirilmiş steril cam lamelleri Culture MDCK hücreleri. Bu izdiham 100% ulaşana kadar ters mikroskop hücreleri kontrol edin. Daha sonra, taze desteklenmiş DMEM aracı maddesi 1 ml orta yerine ve daha 24 saat boyunca bir 37 ° C inkübatöre plaka aktarın.
- Bir vakum aspiratör ve steril bir cam Pasteur pipet kullanılarak Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa ılık PBS 1 ml. PBS çıkarın ve taze PBS ile yıkama tekrarlayın. Cam pipet ile kuyunun dibinden hücreleri kazımak için özen gösterin.
- Canlı trofozoitleri (T), trophozoite total lizatları (TL) ve salgılanan ürünler (SP): Sıcak 1 ml PBS içinde seyreltilmiş trophozoit arasında farklı koşullar ekleyin.
- 2 ya da 30 dakika boyunca inkübatör kültür plakası koyun.
- MDCK hücreleri E. ile inkübe olmamalıdır biri seçildi süresi 0 dakika: iki kontrol koşulları hazırlamak histolytica ancak sıcak PBS ile 1 ml; ve bu durumda ikincil antikorlar kontrolü gibi başka bir durum, 2 ya da 30 dakika için T, TL veya SP MDCK inkübe ve primer antikorlar ile inkübasyon sayın.
- İlişkisiz molekülleri ya trophozoit yok etmek için soğuk PBS ile epitel hücreler beş kez yıkayın.
- Düzeltme ve -20 ° C'de 30 dakika boyunca% 96 etanol içinde 1 ml hücreleri permeabilize
- Etanolü ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında, 1 ml PBS ile üç hızlı yıkama yapar.
- Numunelerin kurutma önlemek için bir nemli odada, aşağıdaki adımları:
- Kapalı ve örnekleri güvenle yerleştirilebilir hangi bir ıslak kağıt havlu ile dolu olabilir mevcut herhangi bir düz kutusunu kullanın. Örneğin, boş bir pipet ucu kutusu de bu amaca hizmet eder.
- Bölmenin içinde, eşit bir Parafilm tabakası ve bir pipet bloğun 25 ul koyunher bir lamel için çözeltisi (% 0.5 BSA) ing.
- Ince forseps ile kuyulardan lamelleri almak, dikkatli bir filtre kağıdı ile kenarından aşırı sıvı kaldırmak ve hücreler engelleme çözüm bakacak engelleme solüsyonu (% 0.5 BSA) içeren damla içine lamel koydu. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
- PBS birincil antikor bir karışım hazırlayın: IgM, fare anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112, 1:10 seyreltme) ve tavşan anti-IgG ZO-1 (pα-ZO-1; 1:100 seyreltme).
- Nemli kutu ve pipetle her bir lamel için antikorlar çözeltisi 25 ul Parafilm yeni bir levha yerleştirin.
- , Bloke çözeltiden lamelleri kaldırın bir filtre kağıdı kullanılarak kenarlarında herhangi bir aşırı sıvı kuru ve hücreler, antikor çözeltisi gelecek şekilde damlalar içine yerleştirin. 4 ° C de bir gece inkübe edin
- (Üstte hücre tarafı) 24 çukurlu bir kuyuya her lamel koyun ve PBS 1 ml ekleyin.
- FITC bağlanmış keçi anti-fare IgM (1:100 dilüsyon) ve TRITC (1:50 seyreltme) bağlanmış keçi anti-tavşan IgG: PBS içinde floresan ikincil antikor bir karışım hazırlayın.
- Nemli kutusu ve pipet her lamel için ikincil antikorlar çözeltisi 25 ul içine Parafilm taze bir yaprak yerleştirin.
- 6.10 olarak örnekleri aktarın ve floresan boyaların ağartılmasını önlemek için karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. 6.11.1 adımı tekrarlayın.
- Nükleer boyama için, oda sıcaklığında, 0.05 mM DAPI çözeltisinin 200 ul ile 3 dakika boyunca inkübe edilir ve ışıktan korur. 6.11.1 adımı tekrarlayın.
- , Floresan boyalar tasarruf Vecta Shield cam mikroskop slaytlar üzerinde montaj çözümü antifade 5 ul içine lamelleri (hücreler aşağı bakacak şekilde) yerleştirin. Örnek kurumayı önlemek için oje kullanarak kapak fişleri Seal.
- Uzun süreli depolama için, slaytları tutmak-20 ° C'de mikroskop slayt kutusu
- Z-yığın bölümleri ve xz-düzlemi (Şekil 2A) ile konfokal mikroskopi tarafından hazırlıkları analiz.
Proteaz inhibitörleri ya da spesifik bir antikor ile trophozoit 7. Kuluçka
- Tekrarlayın 3,1-3,2 adımları. Her bir deney için, 4 ° C'de 20 dakika süreyle proteaz (komple 1 mM ve 40 ug / ml E-64) inhibitörleri veya EhCPADH112 (mαEhCPADH112) karşı 30 ug monoklonal antikor 21 (50 ul PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi) 1 x 10 5 trophozoit inkübe ° C (Şekil 2B). Adım 8.5 'de tarif edildiği gibi ko-inkubasyon deneyleri için, bu preparatlar kullanın.
8. Transepitelyal Elektrik Direnci Ölçümü (TER)
- Steril transwell geçirgen desteklerin (0.4 mikron gözenek boyutu) üzerine Kültür MDCK hücreleri. Üst bölme içinde, 100 hücre süspansiyonu ul ve alt bölmeye yerleştirmektakviye edilmiş DMEM ortamı içinde 600 ul koyun.
- Periyodik orta seviyesini kontrol edin. Gerektiği gibi taze ortam ilave edilebilir.
- Bu izdiham 100% ulaşana kadar ters bir mikroskop hücreleri kontrol edin. 2-3 günde bir orta değiştirin.
- Hücre eki (gerekirse) geliştirmek için, hücre süspansiyonuna eklenmeden önce DMEM içinde 37 ° C'de gece boyunca dengeye transwell filtreler.
- Etanol içine daldırma ile kaputu STX2 elektrotlar sterilize edin ve daha sonra steril PBS içinde UV ışık altında 15 dakika her biri için. Bir EVOM epitel voltohmmeter elektrotlar bağlayın ve direnç modunu seçin.
- Her transwell üst bölmesinden orta toplayın ve bunları havuzu. Bu karışım ortam 50 ul alın ve trofozoitleri süspansiyonu, 50 ul (PBS içinde 1 x 10 5 trofozoitleri) ile ya da sadece PBS (kontrol) ile birleştirin. Her transwell için de benzer bir karışımı kullanın.
- Her bir Transwell containin üst haznesine karışımları eklemeg MDCK hücreleri. Deney koşulları, trophozoit (kontrol) olmadan trophozoit ya da proteaz inhibitörleri ya da mαEhCPADH112 ile önceden inkübe trophozoit ile ortak-kültür MDCK hücreleri içerir. Filtreleri tarafından sağlanan direnci ortadan kaldırmak için, sadece ortam maddesi ile inkübe transwells kullanın. Her deneysel koşul kullanımı, en az üç transwells için.
- Hemen sonra, transwell her içine STX2 elektrotlar daldırılarak TER ölçer.
- Uzun elektrot, alt bölmenin alt dokunur ve kısa elektrot (Şekil 2B, bakınız), üst bölmeye ortamı ile kaplı olduğunu emin olun.
- Her zaman dik Elektrotları tutmak için emin olun. Bu önemli ölçüde, tekrarlanabilirlik artıracaktır. Bu verilerin değişimine yol açacak gibi hareketli veya ölçümler sırasında elektrot eğerek kaçının.
- Bu ölçüm, ilk TER değeri dikkate alınmalıdır. Ardından, aşağıdaki sırasında TER izlemek30 dakika.
- Nihai TER değerini hesaplamak için, sadece filtrelerin TER değeri çıkarın. Farklı deneylerden elde edilen sonuçları karşılaştırmak için% 100 (Şekil 2B) gibi, bu alan, başlangıç değerleri için her bir veri noktası normalize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir E için histolytica kültürü, iki önemli şartlar yerine getirilmelidir: logaritmik fazda aksenik koşulları ve hasat büyüme. E: Daha önce, kültürler histolytica kolayca bakteri veya tripanosomatidlerde 22 belirli türler ile birlikte kurulmuştur. Ancak, günümüzde bu metabolize bakteri, mantar, protozoa veya metazoan hücre serbest bir ortamda amip belirsiz bir subcultivation anlamı, bu parazitin aksenik ekimi olması yaygındır. Buna ek olarak, büyüme erken durağan faz için geç logaritmik sırasında trophozoit hasat uygulanabilir ve çoğalan hücreler 23 için çok önemlidir. Bu nedenle, birkaç gün boyunca ve aynı zamanda sağlam bir morfolojiye ve hızlı hareketin (Şekil 1) incelenerek trophozoit miktarının bu aşama ayırt etmek önemlidir.
Etkileşim çalışmaları için, epitelyal hücreler olması gerekiramoebas normal olarak vücutta karşılaşmak fizyolojik koşulları temsil eden bir konfluent tek tabaka. Yetiştirmek kolay birçok epitelyal hücre hatları kullanılabilir. Daha fizyolojik bir hücre modeli sistemi, Caco-2 ve T84 gibi bağırsak elde edilebilecek olsa da, bu hücre hatları oldukça yavaş büyür. Yaygın olarak incelenmiştir daha hızlı büyüyen bir hücre çizgisi MDCK hücreleri 24 vardır. Bu epitel hücreleri, böbrek kökenlidir ve yüksek TER güçlü TJ ve kolay kültivasyonu ile karakterizedir. Bu hücre hattı hücre kavşaklarda ve TJ kompozisyon biyolojisini yanı sıra TJ montaj ve demontaj mekanizmaları incelemek için yıllardır kullanılmaktadır. TJ fonksiyonları incelenirken Bu nedenlerle, MDCK hücreleri genellikle araştırmacılar tarafından seçilir. MDCK hücreleri, aynı zamanda yaygın amebiazisli 5,8,10,25-28 esnasında neden mekanizmaları üzerinde çalışılması için bir model olarak kullanılmıştır. Yeni bir çalışmada, soyun etkileşimi I l hücreleri ve bağırsak epitel Caco-2 hücreleri, MDCK bildirmiştirive amoebas, lisatlar ve amip ürünleri TJ kompozisyon ve TER 10 benzer etkilere neden oldu. Böylece, MDCK hücreleri amip epithelia etkileşimlerin mekanizmalarını incelemek için uygun bir model vardır. Bundan başka, çeşitli E. kullanımı histolytica ürünleri (bozulmamış trofozoitleri, trophozoite toplam lisatlar veya trofozoitleri yüzer kültür olarak hasat salgılanan ürünler), kullanılabilirlik, eylem, salgı, diğer moleküllerin katılımı modu ve tetikleyici olarak bu etkileşimlerin dahil molekülleri hakkında ek ve ilgili bilgileri sağlamak için çok önemlidir sinyal yolları.
Ortak akışkanlığa eriştikten birlikte, epitel hücreleri, TJ ve AJ ile stabilize edilir temas oluştururlar. Bu yapılar immünofloresans boyamalar özel antikorlar kullanılarak görüntülenebilir bazı moleküllerden oluşur. Örneğin, Şekil 3 'de, hücre iletişim TJ işaretleyici ZO-1 ve kırmızı flüoresan laboratuar karşı bir antikor ile görselleştirilmektedirikincil antikor ELED. Görüldüğü gibi, hücreler, herhangi bir delik olmayan yoğun bir mono-katman oluşturmak için yakın bir yerde toplanır. Bu şekilde, amoeba türetilmiş kompleks EhCPADH112 epitelyum yüzeyi ile bu kompleksin etkileşimini incelemek için bir yeşil floresan etiketli sekonder antikor ile tespit edilir bir monoklonal antikor kullanılarak boyandı edilmiştir. Bu kompleksin üç farklı kaynaklardan epitel tabakasına uygulanmıştır: Canlı trofozoitleri (T), trophozoite toplam lisatlar (TL) ve salgılanan ürünleri (SP). Çarpıcı bir şekilde, her durumda, ZO-1 EhCPADH112 eş-lokalizasyonu bu karmaşık E kolaylaştırmak için gerekli olduğunu belirten, (Şekil 3, oklar) görülmektedir epitel tek tabaka halinde histolytica nüfuz.
Bu etkileşim önce erken amip epitel hücre temas ettikten sonra 2 dakika olarak tespit edilebilir, ancak ZO-1 lekeleme hala c görünüyor, çünkü hücre tabakası daha bu etkileşim etkilenmezontinuous. Şekil 4'te gösterildiği gibi, bu tamamen uzun kuluçka sürelerinden sonra değişir. Burada, görsel üç farklı EhCPADH112 kaynaklarına maruz kalma 30 dakika sonra alındı. TJ net bir bozulma en belirgin etkisi T veya TL ile temas MDCK hücrede meydana gelen, hücre sınırlarında bir süreksiz ZO-1 boyaması (Şekil 4, oklar) tarafından görüntülenmiştir. Buna karşılık, ZO-1 içsel alır ve hücre içi veziküller görülür. Yan hücre zarları boyunca TJ veya AJ ile ya tam co-lokalizasyon sadece tek tabaka üstüne bakarak değil, hücre kişiler 29 bir "yan"-görünümünü alarak ayırt edilemez. Konfokal lazer mikroskopisi, Şekil 3 ve her bir görünümünde xy 4'de gösterildiği gibi xz ekseni boyunca böyle bir görünüm sağlar. Bu görüntüler oldukça bulunduğu takdirde proteinler yanal zarın en tepedeki kısmında TJ ile birlikte lokalize veya olmadığını net bir açıklama göstermekTJ altında veya üstünde TJ apikal membran. Şekil 3 (ok uçları), ZO-1 EhCPADH112 kompleksinin tam bir eş-lokalizasyonu açıkça bu hastalık oluşturma faktörü için eylem yeri olarak ortaya TJ, gözlemlenebilir. Bunun aksine, E gibi yanal zarı boyunca boyama (Şekil 4, ok uçları) olarak gösterdi histolytica işgali epitellerinden içine (etkileşimin 30 dakika) ilerledi, EhCPADH112 hücrelerarası boşluğa doğru nüfuz. Bu kompleks, sadece TJ değil etkileşim 10 2 dk AJ işaretleyici β-katenin ile ve occludin Claudin-1 işaretleri ile ko-lokalize çünkü son yazıda, bu yöntem bize TJ ve AJ ayırt bırakıldı.
TJ bileşenlerin İçselleştirilmesi, Şekil 4 'de imüno-boyamalar görülebileceği gibi, genellikle transepitelyal elektrik direnci (TER) ile ölçülebilir bariyer fonksiyonunun bir kayıp takip etmektedir. TERepitel tek tabaka boyunca iyon akışı yansıtır ve Şekil 2B'de gösterildiği gibi, elektrotlar kullanılarak ölçülebilir. Tek tabakalı henüz tam olarak oluşmuş veya bağlı hücre dışı uyaranlara kesintiye değilken, hücre tabakasının arasında iyonları serbest akışı düşük TER ile belirtilir. TER amoeba ürün veya mono tabakaları trophozoit ile temas içinde (Şekil 5) ile temas halinde olmamıştır bir kontrol konfluent tek tabaka içinde ölçülmüştür. Parazit iletişim kontrol mono tabakaları ile karşılaştırıldığında% 90 bir düşüşü ile gösterildiği TER epitelyal bariyer fonksiyonu bozulur. Trofozoitleri bariyer fonksiyonunu etkileyen hangi mekanizma ile araştırmak için, hedef hücre hasarı için önemli olan, bu karmaşık ve diğer proteazların proteolitik etkinliğini engellemek için bu kompleks, veya proteaz inhibitörleri ile yapışmasını önlemek için EhCPADH112 karşı bir antikor ile trophozoit önceden kuluçkalanmıştır. Her iki tedavi düşündüren, TER damla neredeyse tam bir ters yol açtığı proteolitik hem de aktivitesi ve yapışkan özellikleri E sırasında bu kompleksin önemli hastalık oluşturma faktörleri histolytica işgali.
Şekil 1.. Aksenik biçimde yetiştirilen E. tipik büyüme eğrisi E: 2 x 10 5 trophozoit arasında histolytica trofozoitleri. Aşı histolytica HMI-IMSS klon TYI A-S-33 ortamı ile 6 oyuklu tabaklar içerisinde büyütüldü ve her biri 24 saat sonra, hücre sayısı, bir hemasitometre ile tespit edildi. Hücre büyümesi, üst panelde gösterilmiştir büyüyen hücrelerin morfolojisi ve ışık mikroskobu ile izlenmiştir. Trophozoit miktarı 6 gün (d) için gözlenmiş ve değerler aşağıdaki grafikte işaretlenmiştir. Veriler ortalama ve üç bağımsız ölçümün, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Bar = 10 um./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
MDCK hücreleri ve E. farklı koşullar arasındaki etkileşimler Şekil 2.. Şematik gösterimi E. histolytica. A) Farklı koşullar histolytica gösterilmiştir: Canlı trophozoit (T), toplam trofozoitleri lizatlarını (TL) ve orta (SP) içine trophozoit tarafından salgılanan molekülleri. Herhangi bir deney şartlarında konfluent MDCK hücreleri ile inkübe 2 ve 30 dakika için tahlil edilmiştir. İnkübasyondan sonra, hücreler, MDCK bol trophozoit veya ilişkisiz parazit molekülleri çıkarmak için yıkandı. Daha sonra örnekler mαEhCPADH112 ve pαZO-1 antikorlar olarak kullanılarak, imüno-tahlilleri için işlenmiştiries, sırasıyla birlikte lokalize parazit karmaşık EhCPADH112 ve TJ işaretleyici ZO-1,. Trophozoit Daha sonra, farklı fluorochromes bağlanmış türe özel ikincil antikorlar eş odaklı mikroskopi ile her iki proteini tespit etmek için kullanılmıştır. B) eklenmesi, sadece ya da trofozoitleri transwells üst bölmesine 4 ° C'de mαEhCPADH112 ya da 20 dakika boyunca proteaz inhibitörleri ile önceden inkübe birleşik MDCK hücreleri ihtiva etmektedir. Epitel hücrelerinin TER 30 dakika boyunca, bir EVOM voltohmeter bağlı bir STX2 elektrot kullanılarak izlenmiştir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
MDCK monotabakaların TJ de EhCPADH112 Şekil 3.. Lokalizasyonu. MDCK hücreleri, incu idiCanlı trophozoit (T), total trofozoitleri lizatları (TL) ve 2 dakika boyunca orta (SP) içine trophozoit salgılanan moleküller ile nefese. Üst panel: MDCK hücrelerin faz kontrast görüntüleri. EhCPADH112 ve ZO-1 proteinlerinin mαEhCPADH112 ve pαZO-1 antikorları ile tespit edildi ve daha sonra, sırasıyla FITC-TRITC-ve ikincil antikorlar ile. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. Oklar: Hücre sınırlarda protein yerelleştirme. Xz-düzlemlerde Arrowheads: TJ de protein yerelleştirme. Bar = 10 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
MDCK hücrelerine EhCPADH112 Şekil 4.. İçselleştirilmesi. MDCK hücreleri, canlı trophozoit (T), total trofozoitleri lizatları (T ile kuluçkalanmıştırL) ve 30 dakika boyunca ortam (SP) içine trophozoit salgılanan moleküller. Üst panel: MDCK hücrelerin faz kontrast görüntüleri. EhCPADH112 ve ZO-1 proteinlerinin mαEhCPADH112 ve pαZO-1 antikorları ile tespit edildi ve daha sonra, sırasıyla FITC-TRITC-ve ikincil antikorlar ile. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. Oklar: Hücre sınırlarda protein yerelleştirme. Xz-düzlemlerde Arrowheads: yanal membran (ok başları) de protein yerelleştirme. Bar = 10 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5,. E. EhCPADH112 ile histolytica epitelyal bariyer bozulmaya neden olur. MDCK mono tabakalar canlı trophozoit ile kuluçkalanmıştır(T) ya da T, 30 dakika ve TER belirtilen zamanlarda değerlendirilmiştir için proteaz inhibitörü (PI) veya mαEhCPADH112 antikor (α) ile ön-kuluçkalanmıştır. TER her transwell için başlangıç değerine göre normalize edildi (~ 3.200 Ω · cm 2). Araçlarının ortalama ve standart hatalar her bir zaman noktası için temsil edilmektedir. İstatistiksel analizler tek yönlü ANOVA testi kullanılarak GraphPad 5 yazılımı ile yapıldı. *** P <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
E. tarafından epitel enfeksiyon sırasında in vitro konukçu-patojen etkileşimlerine incelemek için histolytica, epitel hücreleri ve trophozoit iki köklü kültürleri ile çalışmak için çok önemlidir. Örneğin, daha önce, E. histolytica kültürler genellikle bakteriler veya tripanosomatidlerde 22,23 belirli türleri ile birlikte kurulmuştur. E: Bununla birlikte, ko-kültivasyon konak hücreleri üzerinde gözlenen etkileri tümden ameobas isnat edilemedi ama yerine ko-kültür hücrelerinde bir etkisi olabilir, çünkü histolytica kültürleri konak-patojen etkileşimleri çalışma için zararlıdır. Böylece E: bir kültür axenical histolytica spesifik konak-patojen etkileşimleri inceleme için arzu edilir. Sağlanan protokol anlatıyor E. böyle bir aksenik ekimi histolytica özellikle enfeksiyon çalışmalar için bu kültürleri yararlanmak için elde edilebilir. Ayrıca, zamanlamaE. hasadına histolytica da önemlidir. E. histolytica hasat yüksek canlılığı ile hücrelerin yüksek verim sağlamak için üstel büyüme geç evrelerinde önerilir.
Öte yandan, epitel hücreleri köklü bir tek tabaka yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek de zorunludur. Fizyolojik olarak sıkı epiteliyal tek tabaka taklit etmek için, kültürlenmiş hücreler, doğru zamanlama kullanılabilir gerekir. Tek tabaka tamamen herhangi bir deliği olmayan şekillendirilecek sahiptir. Ayrıca, TJ ve AJ doğru oluşumu hücre temaslar kurulmuş sonra biraz zaman gerektirir. Genellikle, epitel hücreleri hücreler bu hücreleri büyüme bir gün vermek için genellikle daha iyidir, böylece bir birleşen tek tabaka çoğalan durdurmak, yani kontak engellenir. Ancak bu, temas inhibisyonu belirsiz olmayan ve hücreler bir noktada birbirine fazla büyümek başlayabilir Başlangıcı genişletilmiş olmamalıdır. Bu görülürse bölmek ya da disk için gerekli olacaktırHücreler ard olup deneylerde kullanın. Sıkı epiteliyal mono tabakalarının oluşumu iyi TER ölçülmesiyle kontrol edilir. Bununla birlikte, bu oldukça pahalı, transwell filtreler, büyüme gerektirir. İyi bir tek tabaka için bir göz geliştirmek için çeşitli hücre sayıları yaygınlaştırılması sonra aynı ekimi formatta hücre büyümesini karşılaştırmak için deneyimsiz deneyci için yararlı olabilir.
Konak-parazit etkileşimi testinin zamanlaması başka önemli faktördür. Etkileşim 2 dakika sonra, herhangi bir epitel hasarı gözlenebildiğini, fakat TJ molekülü ZO-1 EhCPADH112 bir etkileşim önceden belli oldu. TJ sökme ve TER bir damla (10 ve bu çalışma) ile belirtildiği gibi Bununla birlikte, 30 dakika etkileşim sonra, şiddetli epitel hasarı gözlemlendi. Bu veriler, apikal epitel yüzü erken bir yapışkan etkileşim temas gevşetmek ve katkı gibi proteazlar gibi diğer moleküllerin içeri geçmesine imkan vermek için gerekli olduğunu göstermektedirDiğer TJ, AJ ve desmosome moleküllerin bozulması. Trofozoitleri protein konsantrasyonu da önemlidir. Canlı trophozoit ya da sadece lizatlarını veya E. salgılanan ürünleri uygularken notun farklı sonuçlar gözlenebilir histolytica. Epitel hücrelerine trophozoit göreceli oranı, daha önce 10 ispatlandı ve amip ile MDCK-to-salgılanan-ürünlerin oranı (01:10) yüksek olduğunda bile, epitel hasarı gibi ağır değildi. Bu, tek bir hastalık oluşturma proteinin konsantrasyonu kritik ama aynı zamanda amip hızlı işgali izin vermek için etkili bir epitel hasara neden çeşitli faktörlerin etkileşimi olabilir ki, sadece gösterir. Örneğin, Chadee grubu epitel hasarı ve 16 ortaya çıkarmak için, başka bir amip türetilmiş proteaz, EhCP5 önemine değindi. Bu hastalık faktörlerinin bir etkileşim amebiazisli uyarmak için gerekli in vivo ve olmasıdır muhtemel görünüyor inhibitio nedeniyle eksik etkileşimleriTek bir proteinin n çoğu enfeksiyonlar sakin olması için sorumlu olabilir. Bu çerçevede, bu tür müsin gibi epitelyal ürünler, enfeksiyona karşı korumak için önemli olduğunu belirtmek de önemlidir. Özellikle, knock-out fareler mucin2 EhCP5 kaynaklı TJ değişiklikler ve enfeksiyon 16 daha yatkındır. Bu nedenle, epitel tarafında değişiklikleri de amoeba invaziv değerlendirmek için dikkate alınması gerekir.
Co-yerelleştirme algılamak için açıklanan teknolojilerden biri önemli kısıtlılığı tümden doğrudan etkileşim ispat olmamasıdır. Bu durumda, lokalizasyon bir ko-ya da etkileşim de sadece görüntülenmiştir olmayan başka bir protein tarafından aracılık edilebilir. Doğrudan teması tespit etmek için, rekombinant (örneğin GST ya da 10xHis gibi) etiketlenmiş proteinler üretmek ve diğer için, bir etiketi ve Western lekeleme için imüno gerçekleştirmek için gerekli olacaktır. Her neyse, immünofluoresans boyamaları bitirmre ifşa avantajı varct hücresel protein kompleksi yer ve deneyci Bu gibi bir in vitro etkileşim deneyinde test edilmelidir, proteinlerin bir fikir verir. Başka bir dezavantajı mevcuttur az sayıda amoeba özgü antikorlar olmasıdır. Böyle bir etkileşim çalışmalarda bazı amoeba proteinleri çalışma istiyorsa böylece, büyük olasılıkla bir antikorun üretilmesini gerektirir. Antikorlar kullanılabilir olup olmadığını, ancak, tarif edilen yöntemler evsahibi-patojen etkileşimlerinin diğer amoeba proteinlerin alaka (salgılanan veya yüzeye bağlı) incelemek için uygulanabilir.
Bu kağıt konak ve parazit molekülleri arasındaki işbirliği yerelleştirme ve etkileşimleri tespit etmek kolay bir model tanımlamaktadır. Bu hücre bazlı deneyler elde bilgi parazitinin konakçı işgali için fizyolojik uygunluğu doğrulamak için hamster veya fare kullanılarak in vivo enfeksiyon modellerinde uygulanabilir. Bu veriler daha sonra yeni bir tedavi stra geliştirilmesi için kullanılabilecektegies.
Özetle, biz E. yetiştirilmesi için ayrıntılı protokolleri sağlamak histolytica, özellikle konukçu-patojen etkileşim çalışmaları, eş-lokalizasyonu ve TJ sökme değerlendirilmesine izin tahlillerinde kullanım için epitel hücreleri. Kültürlerin zamanlama hem de her bir tahlil bu gibi elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için çok önemlidir. Kültürlerin zamanlama yaygın hücre sayısının değiştirilmesiyle etkilenir edilebilir olsa da, deneyler kendilerini zamanlama deneyi tipine ve incelenmiştir proteinlerin türüne bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I.
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M.
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H.
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S.
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
