Analyse de l'altération de l'épithélium Produit par Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51668

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Abigail Betanzos¹, Michael Schnoor², Rosario Javier-Reyna¹, Guillermina García-Rivera¹, Cecilia Bañuelos³, Jonnatan Pais-Morales¹, Esther Orozco¹

¹Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ²Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ³Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

Summary

L'infection humaine par E. histolytica conduit à l'amibiase, une cause majeure de diarrhée dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction d'agents pathogènes sur des cellules épithéliales de l'intestin, provoquant l'ouverture des contacts cellule-cellule et par conséquent, une diarrhée, parfois suivie d'une infection du foie. Cet article fournit un modèle pour évaluer les premières interactions hôte-pathogène pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase.

Abstract

Entamoeba histolytica est l'agent causal de l'amibiase humaine, une cause majeure de diarrhée et abcès du foie dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction de l'agent pathogène aux cellules épithéliales de l'intestin. Cette interaction conduit à la rupture des structures intercellulaires tels que les jonctions serrées (TJ). TJ assurer l'étanchéité de la couche epitheliale pour séparer le tissu de l'hôte à partir de lumière de l'intestin. Des études récentes fournissent la preuve que la perturbation de la EhCPADH112 TJ en protéine de parasite est une condition préalable à E. invasion de histolytica qui est accompagné par un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Ainsi, l'analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans TJ démontage pendant E. invasion de histolytica est d'une importance capitale pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase. Cet article présente un modèle simple qui permet l'évaluation des interactions initiales hôte-pathogène et le potentiel d'invasion de parasites. Paramètres à analyser sont trésistance électrique ransepithelial, l'interaction de EhCPADH112 avec les récepteurs de surface épithéliales, changements dans l'expression et la localisation de marqueurs de jonction épithéliales et la localisation des molécules du parasite dans les cellules épithéliales.

Introduction

Entamoeba histolytica est un protozoaire responsable de l'amibiase humaine, une infection intestinale cellule causant l'inflammation et la diarrhée. E. histolytica infecte jusqu'à 50 millions de personnes chaque année, mais seulement 10% des personnes infectées développent les symptômes associés à l'amibiase ^1. L'infection se produit lors de l'ingestion d'aliments ou d'eau contaminés contenant E. kystes histolytica. Dans l'intestin, les kystes produisent trophozoïtes vivants qui adhèrent à côlon mucine et prolifèrent ^2. Trophozoïtes forment habituellement des kystes qui sont excrétés par les selles. Dans d'autres cas et pour des raisons encore inconnues, trophozoïtes briser la couche épithéliale intestinale et envahissent les tissus sous-jacents. Dans le pire des cas, ils entrent dans la circulation sanguine et affectent d'autres organes tels que le foie ^3.

Briser la barrière épithéliale nécessite bouleversement des structures transmembranaires épithéliales qui maintiennent les cellules jointes. Cellules épithélialesdes contacts sont formés par le complexe constitué de jonction étanche apical (TJ), et des jonctions adhérentes (AJ), et des desmosomes ^4. Les jonctions apicales sont plus TJ, et par conséquent, ils sont la première barrière offensé par E. histolytica et d'autres agents pathogènes lors de l'invasion de l'hôte. TJ sont constitués de récepteurs d'adhésion transmembranaires telles que claudines occludine, et des molécules d'adhésion jonctionnelle (JAM) qui s'engagent dans des homo-ou des interactions hétérophiles avec les récepteurs de la cellule voisine. Ils sont liés par voie intracellulaire des molécules d'échafaudage des zonula occludens (ZO) de la famille qui relient les récepteurs d'adhésion à cytosquelette d'actine de fournir un complément de résistance mécanique à l'épithélium. TJ sont responsables de tissu intestinal d'étanchéité à partir de la lumière intestinale, ce qui empêche l'excès d'eau et les fuites de soluté. Ainsi, après TJ sont perturbés par le parasite, les tissus sont envahis. E. histolytica sécrète plusieurs molécules telles que: (i) ceux qui sont impliqués dans l'adhésion des amibes à targET cellules ^5; (Ii) les facteurs de membrane active qui participent à la destruction des cellules hôtes par exocytose, par exemple les peptides formant des canaux-ioniques appelés amoebapores ^6,7; et (iii) des protéinases qui dégradent les protéines de la matrice extracellulaire et la médiation de tissu désintégration ^5,8,9.

La cysteine ​​protease EhCP112 et la molécule d'adhésion EhADH112 que forment ensemble le complexe EhCPADH112 sont deux E. histolytica virulence des protéines qui jouent un rôle majeur dans le démontage de TJ ^10. Trophozoïtes vivants, de leurs lysats totaux et produits sécrétés induisent des changements moléculaires dans la perturbation complexe et fonctionnelle TJ de la barrière épithéliale. Dans cette étude, il est démontré que EhCP112 et EhADH112 interagissent avec occludine et la claudine-1 protéines menant à l'internalisation et la dégradation des protéines cellulaires, facilitant ainsi E. entrée de histolytica par la voie paracellulaire.

Nos données et celles of autres groupes ^11-17 suggèrent fortement la nécessité des interactions hôte-pathogène spécifiques qui permettent l'invasion du parasite. Éclaircir la base moléculaire de ces interactions est d'une importance capitale pour une meilleure compréhension de la pathogenèse amibiase. Perturbation sélective de trophozoites en TJ, caractérisé par augmentation de la perméabilité paracellulaire, peut être mesurée par une diminution de la résistance électrique trans-épithéliale (TER). Le transfert des protéines parasitaires vers l'épithélium de l'hôte peut être déterminé par une coloration par immunofluorescence et microscopie confocale à balayage laser, une méthode qui peut également révéler la co-localisation des facteurs de virulence amibes avec des marqueurs épithéliaux jonctionnels indiquant des interactions directes possibles. Dans cet article, nous décrivons en détail comment les cellules épithéliales et les trophozoïtes sont cultivés, récoltés et manipulés pour examiner les interactions hôte-pathogène et leurs conséquences.

Protocol

1. Mise en place et entretien de E. Cultures histolytica

1. Cultivez axéniquement (entièrement libre de tous les autres organismes contaminants) 1 x 10 ⁵ trophozoïtes de la souche de Entamoeba histolytica HML: IMSS cloner un ¹⁸ en 16 x 125 tubes de culture en mm avec revêtement Téflon capsules à vis en ligne (ou 1 x 10 ⁶ trophozoïtes dans un jetable T- 25 flacon) et 15 ml (ou 50 ml en flacon T-25) de TYI-S-33 moyen (bouillon TYI complété avec 3% d'un mélange de diamant de la vitamine, 10% de sérum de chaleur de bovin adulte inactivé, 0,5 UI / ml de pénicilline et 35 pg / ml de streptomycine) ¹⁹ dans un incubateur à 37 ° C.
2. trophozoites de récolte au cours de la phase de croissance logarithmique habituellement à des intervalles de 48 à 96 hr (figure 1) en refroidissant les tubes de culture pendant 5-10 min dans un bain d'eau glacée pour libérer trophozoites attachés au tube de culture en verre.
3. Transférer la culture dans un tube conique et inverser plusieurs fois pour disperser la cells. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hématimètre (de Neubauer), et transférer un inoculum dans un tube de culture contenant du milieu TYI-S-33 frais.
   1. Utilisez faible nombre de amibes pour de plus longues périodes d'incubation (~ 3 x 10 ⁵ cellules pour ~ 5 jours) et un nombre plus élevé pour des périodes plus courtes (~ 1 x 10 ⁶ cellules pour ~ 1 jour). Alors que inoculum comptés sont souhaitables, cultures établies deviennent prévisibles de sorte que les volumes estimés de inoculums sont réalisables.
   2. Titrer la quantité de trophozoites d'optimiser le nombre de cellules pour chaque expérience.
   3. Maintenir une culture double parallèle d'avoir un back-up en cas de contamination accidentelle ou rupture du tube.
4. tubes de Cap hermétiquement et les incuber à 37 ° C en 5 ° inclinés angle horizontal.
5. Voir les cultures par inspection visuelle régulièrement, depuis une croissance excessive de la culture peut contenir plusieurs cellules lysées.

2. Mise en place et entretien de MDCK Culture </ P>

1. Cultivez MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cellules de type I (haute résistance) en jetables flacons T-75 avec 10 ml de milieu DMEM complété avec de la pénicilline (100 UI / ml), la streptomycine (100 mg / ml), l'insuline (0,08 U / ml) et 10% de sérum de veau nouveau-né dans une atmosphère humidifiée de 5% _de CO2 et 95% d'air à 37 ° C.
2. Pour diviser les cellules, les vérifier sur un microscope inversé. Fractionner les cellules quand ils sont ~ 85-100% de confluence.
3. Utiliser un aspirateur à vide dans une hotte stérile et d'une pipette Pasteur en verre stérile pour retirer une feuille à partir de la culture. Pour éviter le grattage des cellules, tourner le ballon à l'envers et les médias d'aspiration de l'angle inférieur.
4. Distribuer 10 ml de PBS préchauffé (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) dans un flacon T-75 (5 ml dans le cas d'un flacon T-25 ) et balancer doucement le flacon pour laver les cellules. Retirer du PBS par aspiration sous vide. Lavage approfondie est nécessaire car le sérum inhibe la trypsine.
5. Distribuer 1,5 ml de trypsine à 0,05% dans un flacon T-75 (T-25 pour utilisation flacon 0,5 ml) et doucement basculer le flacon pour couvrir la couche de cellules avec de la trypsine.
6. Incuber pendant 5-10 min dans l'incubateur (heure exacte dépend de l'activité de la trypsine).
7. Vérifiez le détachement des cellules en tenant ballon contre la lumière et rechercher des cellules circulant. détachement cellulaire (cellules arrondies) peut également être contrôlé à l'aide d'un microscope. Souvent, les cellules libèrent plus vite avec un rapide, claque douce sur le côté du ballon.
8. Ajouter 15 ml de DMEM complémenté dans un flacon T-75 (5 ml pour un flacon T-25). Remettre les cellules par aspiration et refoulement 4 ou 5 fois.
9. Pour propager les cellules, diluer la suspension cellulaire à 1:5 avec frais DMEM supplémenté. nombre de cellules peut également être déterminée à ce point à l'aide d'un hémocytomètre mais ce n'est généralement nécessaire que si le fractionnement des cellules dans des formats spéciaux pour certaines analyses.

3. Préparation de Trophozoïte totale Lysats

1. Détachez trophozoïtes de cudes tubes de refroidissement LTURE par le tube pendant 5-10 min dans un bain d'eau glacée. Transférer de manière aseptique la culture dans un tube à centrifuger conique et à 360 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter soigneusement le surnageant par décantation, ajouter du PBS glacé à la pastille, inverser le tube plusieurs fois pour disperser les cellules et centrifuger à nouveau à 360 x g pendant 10 min. Répétez cette étape deux fois pour éliminer toute trace de milieu TYI-S-33.
2. Déterminer le nombre de trophozoïtes utilisant un hématimètre.
3. Lyse trophozoïtes par les cycles de gel-dégel. Snap-geler un inoculum mesurée de trophozoïtes (600 000 trophozoïtes / ml) dilué dans du PBS glacé, dans l'azote liquide pendant 1 min. Libérer l'échantillon à 4 ° C et vortex vigoureusement. Répéter congélation et de décongélation trois fois pour terminer la lyse des cellules.
4. Activer des protéases présentes dans les lysats avec 0,02% de β-mercaptoéthanol.

4. Préparation de trophozoite sécrétées produits

1. Effectuer les étapes 3.1 à 3.2.
2. Déterminernombre de cellules et la viabilité à ce point à l'aide d'un hémocytomètre et l'application d'un test d'exclusion au bleu trypan ^20:
   1. Diluer 9 x 10 ⁶ trophozoites dans 3 ml de PBS glacé et les cellules de transfert dans un tube conique de 50 ml. Prenez 10 pi de cette suspension et ajouter 1 pl de 0,4% solution de bleu trypan stock pH 7,2.
   2. Utilisez une Neubauer à compter les cellules à faible grossissement.
   3. Compter toutes les cellules et séparer le nombre de cellules bleues, puisque les cellules bleues ont pris le colorant et doivent être considérés comme morts.
   4. Calculer le pourcentage de cellules viables en divisant le nombre de cellules viables par le nombre total de cellules et en multipliant par 100.
3. Transférer le tube conique contenant la suspension de trophozoite dans l'incubateur à 37 ° C pendant 2 heures dans un 5 ° inclinés angle horizontal.
4. Pour collecter les produits sécrétés, tubes de centrifugation à 360 g pendant 10 min. Utilisez une seringue jetable et stérile et soigneusement recueillir les supernatant, en évitant la contamination des échantillons avec des trophozoïtes de la pastille. Éliminer toutes les cellules transférées en faisant passer le surnageant à travers une membrane d'acétate de cellulose de 0,22 um. Activer protéases avec 0,02% β-mercaptoéthanol.
5. Pour supprimer la contamination indésirable présumée à des molécules libérées par les cellules mortes, appliquez de nouveau le test d'exclusion au bleu trypan pour la viabilité cellulaire. Viable nombre total de cellules et doit être le même que celui obtenu à l'étape 4.2. Si ce n'est pas le cas, le surnageant recueilli peut non seulement contenir des protéines sécrétées et doit être jeté.

5. Interaction des cellules MDCK avec Trophozoïtes, Trophozoïte Lysats ou sécrétées produits

1. Incuber des monocouches de cellules confluentes MDCK avec trophozoïtes vivants (un ratio MDCK-à-amibe de 1:1), trophozoite lysats (un rapport MDCK-à-amibe de 1:2) ou de produits sécrétés (un ratio MDCK-à-amibe de 1 : 10) à 37 ° C pendant 2 min et 30 (figure 2A).
2. Laver les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS glacé pour éliminer les molécules non liées ou des trophozoites.

6. Préparation des échantillons pour immunofluorescence

1. Culture des cellules MDCK sur des lamelles de verre stériles placées à l'intérieur d'une boîte de culture cellulaire à 24 puits multiples. Inspecter les cellules sur le microscope inversé jusqu'à ce qu'ils atteignent 100% de confluence. Ensuite, remplacez moyenne avec 1 ml de milieu frais DMEM supplémenté et transférer la plaque à un incubateur à 37 ° C pendant 24 heures de plus.
2. Supprimer le milieu à l'aide d'une trompe à vide et d'une pipette Pasteur en verre stérile et ajouter 1 ml de PBS chaud à chaque puits. Retirer du PBS et répéter le lavage avec du PBS frais. Prendre soin de ne pas racler les cellules à partir du fond du puits à la pipette en verre.
3. Ajouter des conditions différentes de trophozoïtes dilué dans 1 ml de PBS chaud: trophozoïtes vivants (T), lysats totaux trophozoïtes (TL) et de produits sécrétés (SP).
   1. Mettez la plaque de culture dans l'incubateur pendant 2 ou 30 min.
   2. Préparer deux conditions de contrôle: un temps nommé 0 min, où les cellules MDCK doivent être non incubés avec E. histolytica, mais seulement avec 1 ml de PBS chaud; et une autre condition que le contrôle des anticorps secondaires, dans ce cas incuber MDCK avec T, TL ou SP pour 2 ou 30 min et omettre incubation avec des anticorps primaires.
4. Laver les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS froid pour éliminer les molécules non liées ou des trophozoïtes.
5. Fixer et perméabiliser les cellules avec 1 ml d'éthanol à 96% pendant 30 min à -20 ° C.
6. Pour éliminer l'éthanol, effectuer trois lavages rapides avec 1 ml de PBS à température ambiante.
7. Effectuez les étapes suivantes dans une chambre humide pour éviter le séchage des échantillons:
   1. Utilisez une boîte plate disponible qui peut être fermé et rempli avec une serviette de papier humide sur lequel les échantillons peuvent être placés en toute sécurité. Par exemple, une boîte de pointe de la pipette vide sert bien cet effet.
   2. Intérieur de la chambre, placer une couche uniforme de Parafilm et pipette 25 ul de blocsolution (0,5% de BSA) tion pour chaque lamelle.
   3. Prendre des lamelles sur les puits avec une pince fine, enlever soigneusement le liquide en excès à partir du bord avec un papier filtre et mis lamelle couvre-objet dans la goutte contenant une solution de blocage (0,5% de BSA) avec les cellules en regard de la solution de blocage. Incuber les échantillons pendant 1 heure à température ambiante.
8. Préparer un mélange d'anticorps primaires dans PBS: souris IgM anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; dilution 1:10) et IgG de lapin anti-ZO-1 (pα-ZO-1; dilution 1:100).
9. Placer une nouvelle feuille de Parafilm dans la zone humide et pipette 25 ul de solution d'anticorps pour chaque lamelle.
10. Soulever les lamelles couvre-objet à partir de la solution de blocage, sécher tout excès de liquide au niveau des bords à l'aide d'un papier filtre, et les placer dans les gouttes avec les cellules faisant face à la solution d'anticorps. Incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C.
11. Mettez chaque lamelle dans un puits d'une 24 puits multiples (côté pile sur le dessus) et ajouter 1 ml de PBS.
12. Préparer un mélange d'anticorps secondaires fluorescents dans PBS: souris anti-IgM de chèvre couplé au FITC (dilution 1:100) et de chèvre anti-IgG de lapin couplé à TRITC (dilution 1:50).
13. Placer une nouvelle feuille de Parafilm dans la zone humide et pipette 25 ul de la solution d'anticorps secondaire pour chaque lamelle.
14. Transférer les échantillons comme dans l'6,10 et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité pour éviter la décoloration des colorants fluorescents. Répétez l'étape 6.11.1.
15. Pour la coloration nucléaire, incuber pendant 3 min avec 200 ul d'une solution 0,05 mM de DAPI à la température ambiante et l'abri de la lumière. Répétez l'étape 6.11.1.
16. Pour conserver les colorants fluorescents, placer les lamelles (cellules vers le bas) dans 5 pi Vecta Bouclier Antifade solution de montage sur des lames de microscope en verre. Sceller les lamelles à l'aide de vernis à ongles pour éviter le séchage de l'échantillon.
17. Pour le stockage à long terme, maintenir les diapositives d'uneBoîte de lame de microscope à -20 ° C.
18. Analyser les préparatifs de la microscopie confocale à travers les sections Z-stack et XZ-avions (figure 2A).

7. Incubation de trophozoïtes avec inhibiteurs de protéase ou des anticorps spécifiques

1. Répétez les étapes 03.01 à 03.02. Pour chaque condition expérimentale, incuber 1 x 10 ⁵ trophozoïtes (remises en suspension dans 50 pl de PBS) avec des inhibiteurs de la protéase (1 mm complètes et 40 pg / ml E-64) ou 30 mg d'anticorps monoclonal contre EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ pendant 20 min à 4 ° C (figure 2B). Utilisez ces préparations pour essais de co-incubation, comme décrit dans l'étape 8.5.

8. Mesures de résistance électrique transépithéliale (TER)

1. Culture des cellules MDCK sur des supports perméables Transwell stériles (0,4 um de taille de pore). Dans le compartiment supérieur, placer 100 pl de suspension cellulaire et dans le compartiment inférieurplacer 600 ul de milieu DMEM supplémenté.
   1. Vérifiez périodiquement le niveau moyen. Du milieu frais peut être ajouté au besoin.
   2. Inspecter les cellules sur un microscope inversé jusqu'à ce qu'ils atteignent 100% de confluence. Changer le milieu tous les 2-3 jours.
   3. Pour améliorer la fixation des cellules (si nécessaire), équilibrer les filtres Transwell pendant une nuit à 37 ° C dans du DMEM avant addition de la suspension cellulaire.
2. Stériliser électrodes de STX2 dans la hotte par immersion dans de l'éthanol et ensuite dans de la PBS stérile pendant 15 min chacune, sous lumière UV. Connecter les électrodes à un épithéliale voltohmmeter EVOM et sélectionner le mode de résistance.
3. Recueillir milieu du compartiment supérieur de chaque puits transversal commun et les. Prenez 50 pi de ce mélange de médias et les combiner avec 50 pi de trophozoïtes suspension (1 x 10 ⁵ trophozoïtes dans PBS) ou avec seulement PBS (contrôle). Utilisez un mélange similaire pour chaque transwell.
4. Ajouter des mélanges à la chambre supérieure de chaque containin transwellg les cellules MDCK. Les conditions expérimentales comprennent les cellules MDCK sans trophozoïtes (contrôle), une co-culture avec des formes végétatives ou trophozoïtes pré-incubées avec les inhibiteurs de protéase ou mαEhCPADH112. Pour éliminer la résistance offerte par les filtres, utiliser transwells incubées avec seulement moyen. Pour chaque condition l'utilisation expérimentale d'au moins trois transwells.
5. Immédiatement, mesurer TER en immergeant les électrodes de STX2 dans chaque transwell.
   1. Faire en sorte que l'électrode ne touche plus le fond de la chambre inférieure et plus courte que l'électrode est recouverte par le compartiment supérieur en moyenne (voir figure 2B).
   2. Assurez-vous de tenir les électrodes perpendiculairement à chaque fois. Cela permettra d'améliorer la reproductibilité, de manière significative. Évitez de déplacer ou incliner l'électrode pendant les mesures, car cela conduira à une variation des données.
6. Cette mesure doit être considérée comme la valeur du TER initiale. Ensuite, suivre le TER au cours de la suivante30 min.
7. Pour calculer la valeur de TER finale, soustraire la valeur du TER de seulement filtres. Pour comparer les résultats de différents essais normaliser chaque point de données pour les valeurs initiales, celles-ci prenant comme 100% (Figure 2B).

Representative Results

Pour un succès E. culture histolytica, deux conditions importantes doivent être remplies: la croissance dans des conditions axéniques et récolte en phase logarithmique. Auparavant, les cultures de E. histolytica ont facilement créé en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés ^22. Cependant, de nos jours, il est courant d'avoir la culture axénique de ce parasite qui signifie une sous-culture indéfinie des amibes dans un environnement exempt de bactéries qui métabolisent, champignons, protozoaires, ou des cellules de métazoaires. En outre, la récolte des trophozoïtes à la fin logarithmique de début de phase stationnaire de croissance est crucial d'avoir des cellules viables et prolifèrent ^23. Par conséquent, il est important de distinguer la phase de quantification des trophozoites le long de plusieurs jours et aussi en examinant leur morphologie intacte et de la locomotion rapide (Figure 1).

Pour les études d'interaction, les cellules épithéliales doivent êtredans une monocouche confluente à représenter des conditions physiologiques que les amibes sont normalement rencontrés dans le corps. Plusieurs lignées de cellules épithéliales, facile à cultiver, sont disponibles. Bien qu'un système de modèle de cellule plus physiologique tirerait de l'intestin telles que la Caco-2 ou T84, ces lignées cellulaires se développent assez lentement. Une lignée de cellules à croissance plus rapide qui a largement été étudiées sont des cellules MDCK ^24. Ces cellules épithéliales sont d'origine rénale et sont caractérisées par une forte TER, forte TJ et culture facile. Cette lignée cellulaire a été utilisé pendant des décennies pour étudier la biologie de la cellule de jonctions et de la composition TJ ainsi que des mécanismes de TJ montage et le démontage. Pour ces raisons, les cellules MDCK sont souvent choisis par les chercheurs pour l'étude des fonctions TJ. Cellules MDCK ont également été largement utilisé comme modèle pour l'étude des mécanismes induits lors amibiase ^{5,8,10,25-28.} Dans une étude récente, nous avons signalé que l'interaction de la souche I MDCK et épithéliales cellules intestinales Caco-2 avec lamibes Ive, lysats et produits d'amibes entraîné des effets similaires sur la composition TJ et TER ^10. Ainsi, les cellules MDCK sont un modèle approprié pour étudier les mécanismes d'interactions amibe-épithéliales. En outre, l'utilisation de plusieurs E. produits histolytica (de trophozoïtes intactes, lysats totaux trophozoïtes ou de produits sécrétés récoltés que la culture de trophozoïtes surnageant) est crucial pour fournir des informations supplémentaires et pertinentes sur les molécules impliquées dans ces interactions, telles que la disponibilité, le mode d'action, la sécrétion, la participation d'autres molécules et le déclenchement de voies de signalisation.

En accédant à la confluence, les cellules épithéliales forment des contacts qui sont stabilisés par TJ et AJ. Ces structures sont composées de certaines molécules qui peuvent être visualisées en utilisant des anticorps spécifiques à des colorations par immunofluorescence. Par exemple, sur la figure 3, les contacts de cellules sont visualisés par un anticorps dirigé contre le marqueur TJ ZO-1 et une fluorescence rouge laboratoirefirent du anticorps secondaire. Comme on peut le voir, les cellules se rassemblent à proximité étroite pour former une monocouche dense sans aucun trou. Sur cette figure, le complexe EhCPADH112 amibe dérivé a été teinté en utilisant un anticorps monoclonal qui est détecté par un anticorps secondaire marqué par fluorescence verte pour étudier l'interaction du complexe avec la surface de l'épithélium. Trois sources différentes de ce complexe ont été appliqués à la monocouche épithéliale: trophozoites vivants (T), des lysats totaux trophozoites (TL) et les produits sécrétés (SP). Étonnamment, dans tous les cas, la co-localisation de EhCPADH112 avec ZO-1 peut être observé (figure 3, les flèches), indiquant que ce complexe pourrait être nécessaire pour faciliter E. pénétration du histolytica dans la monocouche épithéliale.

Bien que cette interaction peut déjà être observée dès 2 min après le contact de la cellule épithéliale amibe, la couche de cellules n'est pas encore affectée par cette interaction depuis la ZO-1 coloration semble encore cCONTINUE. Cela change complètement après des temps d'incubation plus longues comme montré à la figure 4. Ici, les images ont été prises après 30 min d'exposition à des sources de ces trois EhCPADH112 différentes. Une perturbation claire de TJ est visualisée par un discontinue ZO-1 coloration aux frontières cellulaires (figure 4, les flèches), avec effet le plus évident se produisant dans la cellule MDCK en contact avec T ou TL. En revanche, ZO-1 se intériorisée et se voit dans des vésicules intracellulaires. Co-localisation exacte avec soit TJ AJ ou le long des membranes cellulaires latérales ne peut être distingué en regardant juste au-dessus de la monocouche, mais plutôt par l'obtention d'une "face" à la carte des points de contact de la cellule ^29. La microscopie confocale laser permet un tel point de vue le long de l'axe xz comme montré sur les figures 3 et 4 ci-dessous chaque vue xy. Ces images montrent une déclaration claire si les protéines co-localisent avec TJ à la partie la plus apicale de la membrane latérale ou si elles sont plutôt situésTJ ci-dessous ou au-dessus TJ à la membrane apicale. Dans la figure 3 (pointes de flèches), une co-localisation exacte du complexe EhCPADH112 avec ZO-1 peuvent être observées, révélant clairement TJ comme le lieu de l'action de ce facteur de virulence. En revanche, comme E. invasion de histolytica progressé (30 min d'interaction) dans l'épithélium, EhCPADH112 pénétré vers l'espace intercellulaire comme la coloration le long de la membrane latérale a montré (Figure 4, pointes de flèches). Dans notre récent article, cette méthode nous a permis de distinguer entre TJ et AJ parce que ce complexe ne co-localisé avec le TJ Marqueurs occludine et la claudine-1, mais pas avec le marqueur β-caténine AJ à 2 min de l'interaction ^10.

L'internalisation des composants TJ, comme on peut le voir dans les colorations par immunofluorescence de la figure 4, est habituellement accompagné par une perte de la fonction de barrière qui peut être mesurée par la résistance électrique trans-épithéliale (TER). TERreflète le flux d'ions à travers la monocouche epitheliale et qui peut être mesurée au moyen d'électrodes comme représenté sur la Figure 2B. Quand la monocouche n'est pas encore complètement formé ou perturbé en raison de signaux extracellulaires, la libre circulation des ions à travers la couche de cellules est indiqué par une faible TER. TER a été mesurée d'une monocouche confluente de contrôle qui n'a pas été en contact avec des produits ou des monocouches amibes en contact avec trophozoïtes (figure 5). Parasite contact perturbé la fonction de barrière épithéliale indiqué par une chute de 90% de TFE par rapport aux monocouches de contrôle. Pour étudier les mécanismes par lesquels les trophozoïtes affectent la fonction de barrière, nous pré-incubé les trophozoïtes avec un anticorps dirigé contre EhCPADH112 pour empêcher l'adhésion de ce complexe ou avec les inhibiteurs de protéase, pour bloquer l'activité protéolytique de ce complexe et d'autres protéases importantes pour les dommages de la cellule cible. Les deux traitements ont conduit à une inversion presque complète de la chute de TER, ce qui suggère que les deux protéolytique activité et adhésifs propriétés sont des facteurs de virulence importants de ce complexe pendant E. invasion de histolytica.

Figure 1. Courbe de croissance typique de E. axéniquement cultivé trophozoïtes histolytica. inoculums de 2 x 10 ⁵ trophozoïtes de E. histolytica HMI IMSS clone A ont été cultivées dans des boîtes à 6 puits avec TYI-S-33 milieu et après chaque période de 24 le nombre de cellules h ont été déterminés en utilisant un hematocytomer. La croissance cellulaire a été contrôlée par microscopie optique et la morphologie des cellules en croissance est représentée dans le panneau supérieur. Le montant de trophozoïtes a été surveillée pendant 6 jours (d) et les valeurs ont été tracés dans le tableau ci-dessous. Les données représentent la moyenne et l'erreur standard de la moyenne de trois mesures indépendantes. Bar = 10 um./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Représentation schématique des interactions entre les cellules MDCK et des conditions différentes de E. histolytica. A) Des conditions différentes de E. histolytica sont présentées: trophozoïtes vivants (T), le total des lysats de trophozoïtes (TL) et des molécules sécrétées par les trophozoïtes dans le milieu (SP). Toute condition expérimentale a été testée pour 2 et 30 min d'incubation avec des cellules confluentes MDCK. Après incubation, les cellules MDCK ont été abondamment lavées pour éliminer trophozoïtes ou de molécules parasitaires non liés. Ensuite, les échantillons ont été traités pour des tests d'immunofluorescence, en utilisant mαEhCPADH112 et pαZO-1 antibods à co-localiser le complexe EhCPADH112 parasite et le marqueur TJ ZO-1, respectivement. Plus tard, des anticorps secondaires spécifiques aux espèces couplées à des fluorochromes différents ont été utilisés pour détecter à la fois des protéines par microscopie confocale. B) Addition de trophozoites seulement ou trophozoites pré-incubées avec mαEhCPADH112 ou des inhibiteurs de protéase pour 20 min à 4 ° C dans le compartiment supérieur de transwells contenant des cellules MDCK confluentes. TER des cellules épithéliales a été contrôlée à l'aide d'une électrode de STX2 connecté à un voltohmeter EVOM, pendant 30 min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Localisation de EhCPADH112 à TJ de monocouches de cellules MDCK. Cellules MDCK ont été incuretenant avec trophozoïtes vivants (T), le total des lysats de trophozoïtes (TL) et des molécules sécrétées par les trophozoïtes dans le milieu (SP) pendant 2 min. Panneau supérieur: les images à contraste de phase de cellules MDCK. EhCPADH112 et ZO-1 protéines ont été identifiées par mαEhCPADH112 et pαZO-1 anticorps et puis avec FITC et TRITC-anticorps secondaires, respectivement. Noyaux ont été marqués au DAPI. Flèches: la localisation des protéines aux frontières cellulaires. Pointes de flèches à XZ-avions: la localisation des protéines à TJ. Bar = 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. L'internalisation des EhCPADH112 dans les cellules MDCK. Cellules MDCK ont été incubées avec des trophozoïtes vivants (T), le total des lysats de trophozoïtes (TL) et des molécules sécrétées par les trophozoites dans le moyen (SP) pendant 30 min. Panneau supérieur: les images à contraste de phase de cellules MDCK. EhCPADH112 et ZO-1 protéines ont été identifiées par mαEhCPADH112 et pαZO-1 anticorps et puis avec FITC et TRITC-anticorps secondaires, respectivement. Noyaux ont été marqués au DAPI. Flèches: la localisation des protéines aux frontières cellulaires. Pointes de flèches à XZ-avions: la localisation des protéines à la membrane latérale (têtes de flèches). Bar = 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. E. histolytica par EhCPADH112 induit rupture de la barrière épithéliale. monocouches de cellules MDCK ont été incubées avec des trophozoïtes direct(T) ou T pré-incubées avec des inhibiteurs de la protéase (IP) ou anticorps mαEhCPADH112 (de α) pendant 30 min et TER a été évaluée à temps indiqués. TER a été normalisée en fonction de la valeur initiale pour chaque transwell (~ 3 200 Ω · cm ^2). Moyennes et les erreurs-types des moyens sont représentés pour chaque point de temps. L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel GraphPad Prism en utilisant le test 5 ANOVA à une voie. *** P <0,001.

Discussion

Afin d'étudier in vitro les interactions hôte-pathogène dans lors de l'infection par E. épithéliale histolytica, il est essentiel de travailler avec des cultures bien établies des deux cellules épithéliales et trophozoïtes. Par exemple, autrefois, E. cultures histolytica habituellement avaient été mis en place en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés ^22,23. Cependant, la co-culture de E. cultures histolytica est contre-productif pour l'étude des interactions hôte-pathogène parce que les effets observés sur les cellules hôtes ne pouvaient pas être attribués sans équivoque aux ameobas mais pourraient plutôt être un effet des cellules co-cultivées. Ainsi, une culture de E. axenical histolytica est souhaitable pour l'examen des interactions spécifiques hôte-pathogène. Le protocole décrit la manière dont une telle culture axénique de E. histolytica peut être réalisé à exploiter spécifiquement ces cultures pour des études d'infection. En outre, le momentde la récolte de E. histolytica est également critique. E. récolte histolytica est recommandé pendant les derniers stades de croissance exponentielle pour assurer un rendement élevé de cellules à haute viabilité.

D'autre part, une monocouche bien établie de cellules épithéliales est également obligatoire d'obtenir des résultats reproductibles. Pour émuler une monocouche épithéliale physiologiquement serré, cellules en culture doivent être utilisés au moment approprié. La monocouche doit être formée complètement sans aucun trou. En outre, la formation correcte de TJ et AJ nécessite un certain temps après des contacts cellulaires sont établies. Habituellement, les cellules épithéliales sont inhibées par contact, ce qui signifie que les cellules cessent de proliférer dans une monocouche confluente, de sorte qu'il est généralement préférable de donner aux cellules un jour de croissance. Toutefois, cela ne devrait pas être élargi depuis cette inhibition de contact n'est pas illimitée et les cellules peuvent à un moment donné commencer à envahir l'autre. Si cela est observé, il sera nécessaire de séparer ou d'un disquecellules ARD et pas les utiliser dans des essais. La formation de monocouches épithéliales serrés est mieux contrôlée par la mesure de TER. Cependant, cela nécessite une croissance dans des filtres Transwell, qui sont assez coûteux. Pour développer un oeil pour une bonne monocouche il peut être utile pour l'expérimentateur inexpérimenté pour comparer la croissance des cellules dans le même format de culture après la diffusion de divers numéros de cellulaires.

Le moment de l'analyse de l'interaction hôte-parasite est un autre facteur crucial. Après 2 min de l'interaction, aucune altération de l'épithélium a pu être observée, mais une interaction de EhCPADH112 avec la molécule TJ ZO-1 était déjà apparente. Cependant, après 30 min d'interaction, des lésions épithéliales sévère n'a été observée, comme indiqué par TJ démontage et une goutte de TER ⁽¹⁰ et cette étude). Ces données suggèrent que l'interaction adhesive au début avec le côté apical épithéliale est nécessaire de desserrer les contacts et permettre la pénétration d'autres molécules telles que des protéases qui contribuent alors àla dégradation d'autres TJ, AJ et desmosome molécules. La concentration des protéines de trophozoites est également importante. Fait à noter, les résultats ont pu être observés lors de l'application trophozoïtes vivants ou seulement lysats ou de produits sécrétés de E. histolytica. La proportion relative des trophozoïtes à cellules épithéliales a déjà été prouvée ¹⁰ et même lorsque le rapport de MDCK-à-sécrétée produits par amibe était élevé (1:10), l'altération de l'épithélium n'était pas aussi grave. Ceci indique non seulement que la concentration d'une seule protéine de virulence est critique, mais qu'il pourrait également être l'interaction de divers facteurs qui entraînent des lésions épithéliales efficace pour permettre l'invasion rapide des amibes. Par exemple, le groupe de Chadee a souligné l'importance d'une autre protéase amibe dérivés, EhCP5, à léser l'épithélium ^16. Il semble probable que l'interaction de facteurs de virulence in vivo est nécessaire pour induire l'amibiase et que les interactions manquantes dues à inhibition d'une seule protéine qui peut expliquer le fait que dans la plupart des cas d'infections sont au repos. A cet égard, il est aussi important de mentionner que les produits tels que les mucines epitheliales sont importants pour protéger contre une infection. En particulier, mucin2 knock-out souris sont plus sensibles aux modifications de TJ EhCP5-induits et de l'infection ^16. Ainsi, les modifications sur le côté épithélial doivent également être pris en considération pour évaluer amibe envahissant.

Une limitation importante des technologies décrites pour détecter la co-localisation est que cela ne prouve pas de façon univoque une interaction directe. Dans ce cas, une interaction ou une co-localisation peut être également médiée par une autre protéine qui est tout simplement pas visualisée. Pour détecter une interaction directe, il sera nécessaire de produire des protéines recombinantes marqué (comme TPS ou 10xHis) et effectuer une immunoprécipitation pour une étiquette et transfert de Western pour l'autre. Quoi qu'il en soit, les colorations d'immunofluorescence ont l'avantage de révéler l'exact localisation cellulaire du complexe protéique et l'expérimentateur donner une idée des protéines qui doivent être testés dans un tel dosage in vitro de l'interaction. Un autre inconvénient est qu'il n'y a que peu d'anticorps spécifiques amibes disponibles. Ainsi, si l'on veut étudier certaines protéines d'amibes dans les études d'interaction, il sera très probablement nécessiter la production d'un anticorps. Toutefois, si des anticorps sont disponibles, les méthodes décrites peuvent être appliquées pour étudier la pertinence d'autres protéines d'amibes (sécrétée ou lié à la surface) pour les interactions hôte-pathogène.

Cet article décrit un modèle facile à détecter la co-localisation et des interactions entre les molécules de l'hôte et le parasite. Les connaissances acquises à partir de ces expériences à base de cellules peut être appliquée dans des modèles in vivo de l'infection en utilisant les hamsters ou les souris à corroborer la pertinence physiologique de l'invasion de l'hôte par le parasite. Ces données pourraient ensuite être utilisées pour le développement de nouveaux traitements stragies.

En résumé, nous fournissons des protocoles détaillés pour la culture de E. histolytica et les cellules épithéliales de l'utilisation d'études d'interactions hôte-pathogène, en particulier, les essais qui permettent l'évaluation de la co-localisation et TJ démontage. Le moment choisi pour les cultures, ainsi que celle de chaque essai est essentielle pour garantir la reproductibilité des résultats obtenus. Alors que le calendrier des cultures peut être influencée en faisant varier le nombre de cellules disséminées, le moment des expériences elles-mêmes dépend du type de dosage et le type de protéines étudiées.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution