Summary
Инфекции человека на Entamoeba гистолитика приводит к амебиаза, одной из основных причин диареи в тропических странах. Инфекция инициируется патогена взаимодействия с эпителиальных клеток кишечника, провоцируя открытие межклеточных контактов и, следовательно, понос, иногда с последующим инфекции печени. Эта статья представляет собой модель для оценки ранние хост-патогенных взаимодействия для улучшения нашего понимания амебиаза патогенеза.
Abstract
Entamoeba гистолитика является возбудителем человеческого амебиаза, одной из основных причин диареи и печеночной абсцесса в тропических странах. Заражение инициируется взаимодействием возбудителя с эпителиальных клеток кишечника. Это взаимодействие приводит к нарушению межклеточных структур, таких как плотных контактов (TJ). TJ обеспечить герметизацию эпителиального слоя, чтобы отделить ткани хозяина от просвета кишечника. Недавние исследования свидетельствуют, что нарушение TJ паразитной EhCPADH112 белка является необходимым условием для Е. гистолитика вторжение, которое сопровождается эпителиального барьера дисфункции. Таким образом, анализ молекулярных механизмов, вовлеченных в TJ разборки во E. гистолитика вторжение имеет первостепенное значение для улучшения нашего понимания амебиаза патогенеза. В данной статье представлен простой модель, которая позволяет оценку начальных хост-патогенных взаимодействий и паразит вторжения потенциал. Параметры, которые будут проанализированы включают тransepithelial электрическое сопротивление, взаимодействие EhCPADH112 с эпителиальных поверхностных рецепторов, изменения в экспрессии и локализации эпителиальных соединительных маркеров и локализации молекул паразита внутри эпителиальных клеток.
Introduction
Entamoeba гистолитика является одним простейшим ответственность человеческой амебиаза, кишечной инфекции клеток вызывая воспаление и диарею. E. гистолитика заражает до 50 млн. человек в год, но только около 10% инфицированных людей развивается симптомы, связанные с амебиаза 1. Заражение происходит при употреблении зараженной пищи или воды, содержащее Е. гистолитика кисты. В кишечнике, кисты производят живые трофозоиты, которые придерживаются толстой кишки муцина и размножаться 2. Трофозоиты обычно образуют цисты, которые выводятся из организма через стул. В других случаях и для еще неизвестным причинам, трофозоиты сломать кишечного эпителиального слоя и вторгнуться подлежащих тканей. В худшем случае, они входят в кровь и влияют на другие органы, такие как печень 3.
Разорвать эпителиальный барьер требуется разрушение эпителиальных transmembranal структур, которые поддерживают клетки присоединились. Эпителиальных клетокконтакты образованы апикальной соединительного комплекса, состоящего из жесткой (TJ) и слипчивых соединений (AJ), и десмосомы 4. Наиболее вершинные узлы: TJ, и поэтому они являются первым барьером оскорблена Е. гистолитика и некоторые другие патогены во время пребывания вторжения. TJ состоят из transmembranal рецепторов адгезии, таких как клаудины, occludin и соединительных молекул адгезии (джем), которые участвуют в гомо-или гетерофильных взаимодействий с рецепторами соседней камере. Они внутри клетки связаны молекул лесов этих блокатора малой зоны (ZO) семьи, которые соединяют адгезионные рецепторы к цитоскелета предоставить дополнительную механическую прочность эпителия. TJ ответственны за герметизации кишечной ткани из просвета кишечника, предотвращая чрезмерную утечку воды и растворенного вещества. Таким образом, после TJ нарушается паразитом, ткани вторглись. Е. гистолитика выделяет несколько молекул, таких как: (I), кто участвует в адгезии амеб в ТаргET клетки 5; (II) мембранные-активные факторы, участвующие в гибели клеток-хозяев по экзоцитоза, например ионного канала формирования пептиды названы amoebapores 6,7; и (III) протеиназы, унижающие белки внеклеточного матрикса и опосредуют ткани распада 5,8,9.
Цистеин протеазы EhCP112 и молекулы адгезии EhADH112, что вместе образуют комплекс EhCPADH112 два Е. гистолитика вирулентности белки, которые играют важную роль в разборки TJ 10. Текущие трофозоиты, их всего лизаты и секретируется продукты индуцируют молекулярные изменения в TJ сложной и функционального нарушения эпителиального барьера. В этом исследовании, было показано, что EhCP112 и EhADH112 взаимодействовать с occludin и Claudin-1 белков, приводящих к интернализации и деградации клеточных белков, способствуя тем самым E. вход гистолитика через парацеллюлярной пути.
Наши данные и те, ое другие группы 11-17 настоятельно рекомендуем необходимость конкретных принимающих-патоген взаимодействий, которые позволяют паразита вторжение. Раскрытие молекулярную основу этих взаимодействий имеет первостепенное значение для лучшего понимания амебиаза патогенеза. Селективный нарушение TJ по трофозоитов, характеризующихся повышенной проницаемостью парацеллюлярной, может быть измерена путем уменьшения трансэпителиального электрического сопротивления (TER). Перенос паразитных белков к хост-эпителии может быть определена путем иммунофлуоресценции окрашивание и конфокальной лазерной микроскопии, методом, который также может выявить совместную локализацию амебы факторов вирулентности с эпителиальными соединительных маркеры, указывающие на возможные прямые взаимодействий. В этой статье мы подробно описывают, как эпителиальные клетки и трофозоиты культивируются, собирают и манипулировать, чтобы изучить хост-патогенных взаимодействий и их последствия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установление и поддержание Е. гистолитика Культуры
- Расти axenically (полностью свободного от всех других загрязняющих организмов) 1 х 10 5 трофозоиты гистолитика штамма Entamoeba Hml: ИМСС клонировать 18 в 16 х 125 мм культуры трубы с тефлоновый винтовых колпачков (или 1 х 10 6 трофозоиты в одноразовые Т- 25 колбы) и 15 мл (или 50 мл в Т-25 колбу) из Tyi-S-33 среды (Tyi в бульоне с добавлением 3% Алмазный витаминной смеси, 10% инактивированной нагреванием сыворотки взрослого быка, 0,5 МЕ / мл пенициллина и 35 мкг / мл стрептомицина) 19 в инкубаторе при 37 ° С
- Урожай трофозоиты во время логарифмической фазе роста обычно на 48-96 час интервалами (рис. 1) путем охлаждения агаровые пробирки в течение 5-10 мин в ледяной бане, чтобы освободить трофозоиты прикрепленные к стеклянной пробирку.
- Перевести культуру в конической трубе и инвертировать его несколько раз, чтобы разогнать CELлевая сторона Определение количества клеток с помощью гемоцитометра (Neubauer камеры) и передать инокулята в культуральную пробирку, содержащую свежий Tyi-S-33 среды.
- Используйте небольшое число амеб на более длительные периоды инкубации (~ 3 х 10 5 клеток на ~ 5 дней) и более высоким номером на более короткие периоды (~ 1 х 10 6 клеток для ~ 1 день). В то время как рассчитывали посевной желательны, установленные культуры становятся предсказуемыми, так что по оценкам объемы посевного материала вполне осуществимы.
- Titrate количество трофозоитов для оптимизации количества клеток для каждого эксперимента.
- Поддерживать параллельный дубликат культуру, чтобы иметь резервную копию в случае непреднамеренного загрязнения или трубки поломки.
- Cap трубы плотно и инкубировать их при 37 ° С в течение 5 ° наклонных горизонтального угла.
- Проверка культур путем визуального осмотра регулярно, так как чрезмерный рост культуры может содержать много лизированных клеток.
2. Установление и поддержание МДСК культуры </ Р>
- Grow MDCK (Madin Darby Canine Kidney) клеток типа I (высокое сопротивление) в одноразовых T-75 колбах с 10 мл DMEM среде с пенициллином (100 МЕ / мл), стрептомицин (100 мг / мл), инсулин (0,08 U / мл) и 10% новорожденных сыворотки теленка в увлажненной атмосфере 5% СО 2 и 95% воздуха при 37 ° С
- Чтобы разделить клетки, проверить их на инвертированный микроскоп. Сплит клетки, когда они ~ 85-100% сливной.
- С помощью вакуумного аспиратора в стерильной капот и стерильной пипетки Пастера стекло, чтобы удалить носитель из культуры. Чтобы избежать соскоб клеток, включите колбу с ног на голову и аспирации массовой информации в нижнем углу.
- Внесите 10 мл предварительно нагретого PBS (140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4) в Т-75 колбу (5 мл в случае Т-25 колбу ) и осторожно встряхнуть флакон, чтобы промыть клетки. Удалить PBS вакуумной аспирации. Обширная стиральная требуется, так как сыворотка ингибирует трипсин.
- Разлить 1,5 мл 0,05% трипсина в Т-75 колбу (на Т-25 колбу используют 0,5 мл) и осторожно раскачивать колбу, чтобы покрыть клеточный слой с трипсином.
- Инкубировать в течение 5-10 мин в инкубаторе (точное время зависит от активности трипсина).
- Проверьте для открепления клеток путем проведения колбу против света и отыскать течет клетки. Сотовый отряд (закругленные клетки) также могут быть проверены с помощью микроскопа. Часто клетки выделяют быстрее, с быстрым, мягким шлепком в сторону колбы.
- Добавить 15 дополненной мл DMEM с Т-75 колбу (5 мл для T-25 колбу). Ресуспендируют клеток с помощью пипетки вверх и вниз 4 или 5 раз.
- Для распространения клеток, развести клеточной суспензии 1:05 со свежим дополнен DMEM. Число клеток может быть определена в этой точке с помощью гемоцитометра но это обычно необходимо только, если разбиение ячеек в специальные форматы для некоторых анализов.
3. Подготовка трофозоита лизате
- Снять трофозоиты от у.е.lture трубы охлаждением трубку в течение 5-10 мин в ледяной бане. Передача культуры асептически в коническую пробирку и центрифугируют при 360 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Осторожно отбросить супернатант путем декантации, добавить ледяной PBS к осадку, инвертировать трубки несколько раз, чтобы диспергировать клетки и центрифуги снова при 360 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг дважды, чтобы удалить все следы Tyi-S-33 среды.
- Определение количества трофозоиты помощью гемоцитометра.
- Lyse трофозоиты по циклов замораживания-оттаивания. Snap-заморозить отмеренное затравтку трофозоитов (600000 трофозоиты / мл) разводят в ледяной PBS, в жидком азоте в течение 1 мин. Разморозить образца при 4 ° С и вихря энергично. Повторите замораживать и размораживать 3 раза, чтобы завершить лизиса клеток.
- Активация протеаз, присутствующих в лизатах с 0,02% β-меркаптоэтанола.
4. Подготовка трофозоита секретируется Товаров
- Выполните шаги 3,1 до 3,2.
- Определятьчисло клеток и жизнеспособность в этой точке с помощью гемоцитометра и применения трипанового синего тест 20:
- Развести 9 х 10 6 трофозоиты в 3 мл ледяной PBS и передачи клеток в 50 мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл этой суспензии и добавить 1 мкл 0,4% трипанового синий исходного раствора рН 7,2.
- Используйте камеру Нейбауера для подсчета клеток при малом увеличении.
- Подсчет всех ячеек и отделить количество синих клеток, так как синие клетки взяли на себя краску и должны рассматриваться мертвым.
- Вычислить процент жизнеспособных клеток путем деления количества жизнеспособных клеток на общее количество клеток и умножением на 100.
- Передача коническую трубку, содержащую трофозоита суспензии в инкубаторе при 37 ° С в течение 2 часов в 5 ° наклонных горизонтального угла.
- Для сбора, выделяемые продукты, центрифужные пробирки при 360 мкг в течение 10 мин. Используйте одноразовые и стерильные шприцы и тщательно собирать Суpernatant, избегая загрязнения образцов с трофозоитов от осадка. Устранить любые переданные клетки пропусканием супернатанта через ацетат целлюлозы 0,22 мкм мембрану. Активация протеаз с 0,02% β-меркаптоэтанола.
- Чтобы отменить предполагаемый нежелательного загрязнения с молекулами, освобожденных из мертвых клеток, повторно применить трипановый тест синий исключения для жизнеспособности клеток. Жизнеспособных и общее число клеток должно быть таким же, полученного на стадии 4.2. Если это не так, то собирали супернатант может содержать не только секретируемые белки и должен быть отброшен.
5. Взаимодействие MDCK клеток с трофозоиты, трофозоита лизатов или секретируемые продукты
- Выдержите сливной монослоев MDCK клеток с живыми трофозоитов (соотношение MDCK к амебы 1:1), трофозоита лизаты (соотношение MDCK к амебы 1:2) или секретируемые продукты (соотношение MDCK к амебы из 1 : 10) при 37 ° С в течение 2 и 30 мин (рис. 2а).
- Промыть эпителиальных клеток пять раз охлажденным на льду PBS, чтобы устранить несвязанных молекул или трофозоиты.
6. Получение образцов для иммунофлуоресценции
- Культура MDCK клетки на стерильные стеклянные покровные размещенных в 24-многоямного клеточной культуры блюдо. Проверьте ячейки на инвертированный микроскоп, пока они не достигают 100% от слияния. Затем заменить носитель с 1 мл свежей среды DMEM, дополненной и передавать пластину в инкубаторе 37 ° C в течение 24 часов более.
- Снимите среду с помощью вакуумного аспиратора и стерильный стекло пипетки Пастера и добавить 1 мл теплой PBS в каждую лунку. Удалить PBS и повторить мытье с пресной PBS. Будьте осторожны, не царапать клетки со дна колодца с стеклянной пипетки.
- Добавить различные условия трофозоитов разбавленных в 1 мл теплой PBS: В прямом эфире трофозоиты (T), трофозоита лизате (TL) и выделяемые продукты (SP).
- Поставьте культуры пластину в инкубаторе в течение 2 или 30 мин.
- Приготовьте два условия управления: один по имени времени 0 мин, где MDCK клетки должны быть не инкубировали с Е. гистолитика но только с 1 мл теплой PBS; и еще одно условие как контроль вторичных антител, в этом случае инкубировать с MDCK T, TL или SP в течение 2 или 30 мин и опустить инкубацию с первичными антителами.
- Вымойте эпителиальных клеток в пять раз с холодной PBS устранить несвязанных молекул или трофозоиты.
- Fix и клетки проницаемыми 1 мл 96% этанола в течение 30 мин при -20 ° С
- Для удаления этанола, выполните три быстрых промывок по 1 мл PBS при комнатной температуре.
- Выполните следующие действия во влажной камере, чтобы избежать высыхания образцов:
- Использовать все имеющиеся плоскую коробку, которая может быть закрыта и наполненный влажным бумажным полотенцем, на котором образцы могут быть безопасно помещен. Например, пустая коробка пипетки служит этой цели хорошо.
- Внутри камеры, равномерно разместить парафином слой и пипетки 25 мкл блокеING раствор (0,5% BSA) для каждого покровное.
- Возьмем покровные из скважин с тонким пинцетом, осторожно удалить лишнюю жидкость от края через фильтровальную бумагу и положить покровное в каплю, содержащую блокирующий раствор (0,5% BSA) с клетки перед блокирующим раствором. Инкубируйте образцы в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Приготовить смесь из первичных антител в PBS: IgM мыши анти-EhCPADH112 (Ма-EhCPADH112; разведение 1:10) и IgG кролика против ZO-1 (Ра-ЗО-1; разбавление 1:100).
- Поместите чистый лист парафильмом во влажном поле и пипетки 25 мкл антител решение для каждого покровное.
- Поднимите покровные от блокирующим раствором, высушить лишнюю жидкость по краям с помощью фильтровальной бумаги, и поместить их в капли с клетки сталкиваются раствор антител. Инкубируйте образцы в течение ночи при 4 ° С.
- Положите каждый покровное в лунку 24-многоямного (стороне клеточной сверху) и добавить 1 мл PBS.
- Приготовить смесь из флуоресцентных вторичных антител в PBS: козий анти-IgM мыши, соединенный с FITC (разбавление 1:100) и козьего анти-IgG кролика, соединенный с TRITC (разведение 1:50).
- Поместите чистый лист Parafilm в влажной камере и пипеткой 25 мкл вторичных антител решение для каждого покровное.
- Передача образцов как в 6,10 и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте, чтобы избежать отбеливания флуоресцентных красителей. Повторите шаг 6.11.1.
- Для ядерного окрашивания, инкубировать в течение 3 мин с 200 мкл 0,05 мМ раствора DAPI при комнатной температуре и защите от света. Повторите шаг 6.11.1.
- Для экономии флуоресцентные красители, разместить покровные (клетки лицевой стороной вниз) в 5 мкл Vecta Щит antifade монтажный раствор на предметные стекла микроскопа. Уплотнение крышки скользит с помощью лака для ногтей, чтобы избежать сушки образца.
- Для длительного хранения, держать слайдов вмикроскопа окно при -20 ° С.
- Анализ препараты от конфокальной микроскопии по разделам Z-Stack и XZ-плоскостей (рис. 2А).
7. Инкубация трофозоиты с ингибиторов протеазы или специфических антител
- Повторите шаги 3,1 до 3,2. Для каждой экспериментальной условии, инкубировать 1 × 10 5 (трофозоиты ресуспендировали в 50 мкл PBS) с ингибиторами протеазы (1 мМ полным и 40 мкг / мл E-64) или 30 мкг моноклонального антитела против EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 течение 20 мин при 4 ° C (фиг. 2В). Используйте эти препараты для совместной инкубации анализов, как описано в шаге 8.5.
8. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TER)
- Культура MDCK клеток на стерильных Transwell проницаемых опор (размер пор 0,4 мкм). В верхнем отделении, поместите 100 мкл суспензии клеток и в нижнем отделенииразместить 600 мкл DMEM, дополненной среде.
- Периодически проверяйте уровень среднего. Свежую среду могут быть добавлены при необходимости.
- Проверьте ячейки на инвертированный микроскоп, пока они не достигают 100% от слияния. Изменение средней каждые 2-3 дня.
- Чтобы улучшить прикрепление клеток (при необходимости), уравновешивания Transwell фильтры в течение ночи при 37 ° С в среде DMEM перед добавлением суспензии клеток.
- Стерилизовать Stx2 электроды в капюшоне погружением в этаноле, а затем в стерильной PBS в течение 15 мин каждый, под ультрафиолетовым светом. Подключите электроды к эпителиального voltohmmeter EVOM и выберите режим сопротивления.
- Сбор среды из верхней камеры каждого Transwell и объединить их. Возьмите 50 мкл этого медиа смеси и объединить его с 50 мкл трофозоиты подвески (1 х 10 5 трофозоиты в PBS) или только с PBS (контроль). С помощью аналогичной смеси для каждого Transwell.
- Добавить смеси в верхнюю палату каждого Transwell containinг в MDCK клетки. Экспериментальные условия включают MDCK клетки, не трофозоитов (контроль), cо-культуру с трофозоитов или с трофозоитов преинкубировали с ингибиторами протеазы или mαEhCPADH112. Чтобы исключить стойкость, обеспечиваемую фильтры, использовать transwells инкубированные только с среды. Для каждой экспериментальной условием использования по крайней мере три transwells.
- Сразу же, измерить TER путем погружения Stx2 электроды в каждом Transwell.
- Убедитесь, что чем дольше электрод касается нижней части нижней камеры и, что более короткий электрод покрыт среды в верхней камере (см. фиг.2В).
- Убедитесь в том, чтобы держать электроды перпендикулярно каждый раз. Это позволит улучшить воспроизводимость, значительно. Избегайте перемещения или наклона электрода в процессе измерений, так как это приведет к изменению данных.
- Это измерение следует рассматривать начальное значение TER. Тогда, следить за ТЭР в течение следующих30 мин.
- Для расчета окончательного значения TER, вычтите значение тер только фильтров. Для сравнения результатов из разных экспериментов нормализовать каждую точку данных на начальные значения, принимая их как 100% (рис. 2В).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для успешного Е. гистолитика культура, два важных условия должны быть выполнены: рост аксенными условий и урожая в логарифмической фазе. Ранее культуры Е. гистолитика были легко установить в сотрудничестве с некоторыми видами бактерий или trypanosomatids 22. Тем не менее, в настоящее время он является общим для аксенными культивирование этого паразита означает неопределенный субкультивирования из амеб в среде, свободной от метаболизирующих бактерий, грибов, простейших, или многоклеточных клеток. Кроме того, уборки трофозоиты в конце логарифмической к ранней стационарной фазе роста важно иметь жизнеспособных и размножающихся клеток 23. Поэтому, важно, чтобы отличить эту фазу путем количественного трофозоитов вместе несколько дней, а также путем изучения их нетронутыми морфологии и быстрое передвижение (рис. 1).
Для исследований взаимодействия, эпителиальные клетки должны бытьв сливной монослоя представлять физиологические условия, что амебы обычно сталкиваются в организме. Несколько эпителиальные клеточные линии, легко культивировать, имеются. В то время как более физиологичным модель сотового система будет выводить из кишечника, таких как Сасо-2 или T84, эти клеточные линии растут довольно медленно. Быстрее растет клеточная линия, которая широко изучались являются MDCK клетки 24. Эти эпителиальные клетки почки происхождения и характеризуются высокой TER, сильный TJ и легкого культивирования. Эта клеточная линия была использована на протяжении десятилетий для изучения клеточной биологии из узлов и TJ состава, а также механизмы TJ сборки и разборки. По этим причинам, MDCK клетки часто выбираются исследователями при изучении функции TJ. MDCK клетки были также широко используется в качестве модели для изучения механизмов индуцированных во амебиаза 5,8,10,25-28. В недавнем исследовании, мы сообщили, что взаимодействие штамма Я MDCK клетки и кишечные эпителиальные клетки Сасо-2 с лIve амебы, лизаты и амебы продукты вызвало подобные влияния на TJ состава и TER 10. Таким образом, MDCK клетки подходящей моделью для изучения механизмов амеба-эпителии взаимодействий. Кроме того, использование нескольких Е. гистолитика продукты (неповрежденные трофозоиты, трофозоита всего лизаты или секретируемые продукты, собранные как трофозоиты супернатанта культуры) имеет решающее значение для обеспечения дополнительной и актуальную информацию о молекул, участвующих в этих взаимодействий, таких как доступность, способ действия, секреции, участие других молекул и срабатывание сигнальных путей.
В то время как достижения слияния, эпителиальные клетки образуют контакты, которые стабилизированные TJ и AJ. Эти структуры состоят из определенных молекул, которые могут быть визуализированы с использованием специфических антител в иммунофлюоресценции окрашивания. Например, на фиг.3, клеточные контакты визуализировали с помощью антитела против маркера TJ ZO-1 и красной флуоресцентно лабораторииELED вторичного антитела. Как можно видеть, клетки собирают в непосредственной близости к образуют плотный монослой без отверстия. На этой фигуре амеба, полученных комплекс EhCPADH112 была окрашивали с использованием моноклонального антитела, который обнаруживается зеленой флуоресцентно-меченного вторичного антитела изучить взаимодействие этого комплекса с поверхностью эпителиальных. Три различные источники этого комплекса были применены к эпителиальной монослоя: живые трофозоиты (T), трофозоита всего лизаты (TL) и выделяемые продукты (SP). Поразительно, во всех случаях, ко-локализация EhCPADH112 с ZO-1 можно наблюдать (рис. 3, стрелки), указывая, что этот комплекс может потребоваться для содействия E. Проникновение гистолитика в эпителиальной монослоя.
Хотя это взаимодействие уже можно наблюдать уже в 2 мин после амебы-эпителиальных контакта клеток, слой клеток еще не затронуты этим взаимодействия с окрашивание ZO-1 по-прежнему выглядит грontinuous. Это полностью меняет после длительного инкубационного периода, как показано на рисунке 4. Здесь снимки были сделаны после 30 минут воздействия трех различных источников EhCPADH112. Четкое нарушение TJ визуализируется разрывной ZO-1 окрашивания на границы ячеек (рис. 4, стрелки), с наиболее очевидным эффект, возникающий в MDCK клетки в контакте с Т или TL. В противоположность этому, ZO-1 получает интернализации и рассматривается во внутриклеточных везикул. Точное совместная локализация либо TJ или AJ вдоль боковых клеточных мембран не могут быть выделены только смотря на верхней части монослоя, а путем получения "побочный"-вид клеточных контактов 29. Конфокальной лазерной микроскопии позволяет такой вид вдоль оси хг как показано в фигурах 3 и 4 ниже каждого вида ху. Эти изображения показывают четкое указание ли белки ко-локализуются с TJ в наиболее апикальной части боковой мембраны или, если они довольно расположенныйниже TJ или выше TJ на апикальной мембране. На рисунке 3 (наконечники стрел), точная совместная локализация комплекса EhCPADH112 с ZO-1 можно наблюдать, четко показывая TJ как место действия для этого фактора вирулентности. В противоположность этому, как E. гистолитика вторжение прогрессировала (30 мин взаимодействия) в эпителии, EhCPADH112 проник в направлении межклеточном пространстве, как окрашивание вдоль боковой мембраны показало (рис. 4, стрелок). В нашей недавней работе, этот метод позволил проводить различие между РТ и AJ, потому что этот комплекс только колокализуются с TJ маркеры occludin и Claudin-1, но не с AJ маркерные β-катенина в 2 мин взаимодействия 10.
Интернализация компонентов TJ, как можно видеть в иммунофлюоресценции окрашивания на рисунке 4, как правило, сопровождается потерей барьерной функции, что может быть измерена трансэпителиальной электрического сопротивления (TER). ТЕРотражает поток ионов через эпителиальный монослой и может быть измерена с помощью электродов, как показано на фиг.2В. Когда монослой не полностью сформирована или нарушена из-за внеклеточных сигналов, свободный поток ионов через клеточную слоем определяется низкой TER. ТЕР измеряли контрольной сливной монослоя, который не был в контакте с амебы продукции или монослоев в контакте с трофозоитов (рис. 5). Паразит контакт нарушается эпителиальных барьерную функцию, указанную капли тер 90% в сравнении с контрольными монослоев. Чтобы исследовать механизмы, посредством которых трофозоиты влияют на барьерную функцию, мы предварительно инкубировали в трофозоиты с антителом против EhCPADH112, чтобы предотвратить прилипание этот комплекс или с ингибиторами протеазы, чтобы блокировать протеолитическую активность комплекса и других протеаз, важных для повреждения клетки-мишени. Оба вида лечения привело к почти полной отмене падения ТЕР, предполагая, что оба протеолитический Активность и адгезионные свойства являются важными факторами вирулентности этого комплекса во E. гистолитика вторжение.
Рисунок 1. Типичный кривая роста axenically культивируемых Е. гистолитика трофозоиты. Инокуляты 2 х 10 5 трофозоитов Е. гистолитика HMI-ИМСС клон культивировали в чашках 6-луночных с Tyi-S-33 среды и после каждого номера 24 час клеток определяли с помощью hematocytomer. Клеточного роста контролировали с помощью световой микроскопии и морфологии растущих клеток показан на верхней панели. Количество трофозоитов контролировали в течение 6 дней (д) и значения были нанесены на графике ниже. Данные представляют собой среднее значение и стандартное отклонение от среднего из трех независимых измерений. Bar = 10 мкм./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схематическое изображение взаимодействий между MDCK клеток и различных условиях Е. гистолитика. A) Разные условия Е. гистолитика показаны: живые трофозоиты (T), всего трофозоиты лизатов (TL) и молекулы, выделяемые трофозоитов в среду (SP). Любое экспериментальных условиях анализируют на 2 и 30 мин инкубации с сливной MDCK клеток. После инкубации MDCK клетки обильно промывают, чтобы удалить трофозоиты или несвязанных паразитные молекулы. Тогда Образцы были обработаны для иммунофлюоресценции анализов, используя mαEhCPADH112 и pαZO-1 antibodх годов к сотрудничеству локализовать паразитный комплекс EhCPADH112 и TJ маркер ZO-1, соответственно. Позже, видоспецифических вторичные антитела, соединенные с различными флюорохромами были использованы для выявления оба белка с помощью конфокальной микроскопии. B) добавление только трофозоитов или трофозоиты предварительно инкубировали с mαEhCPADH112 или ингибиторов протеазы в течение 20 мин при 4 ° С в верхний отсек transwells содержащий сливные MDCK клетки. ТЕР эпителиальных клеток подвергали мониторингу с использованием Stx2 электрод, подключенный к voltohmeter EVOM, в течение 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Локализация EhCPADH112 на TJ из MDCK монослоя. MDCK клетки INCUзатаив с живыми трофозоитов (Т), всего трофозоиты лизатов (TL) и молекул, выделяемых трофозоитов в среду (SP) в течение 2 мин. Верхняя панель: контрастные изображения фазовые MDCK клеток. EhCPADH112 и ZO-1 белки идентифицировали, mαEhCPADH112 и pαZO-1 антител, а затем с FITC-и TRITC-вторичных антител, соответственно. Ядра окрашивали DAPI. Стрелки: локализация белка в клеточных границ. Стрелки в XZ-плоскостях: локализация белка в TJ. Бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Интернализация EhCPADH112 в MDCK клеток. MDCK клетки инкубировали с живыми трофозоитов (Т), всего трофозоиты лизатов (ТЛ) и молекулы, секретируемые трофозоитов в среду (SP) в течение 30 мин. Верхняя панель: контрастные изображения фазовые MDCK клеток. EhCPADH112 и ZO-1 белки идентифицировали, mαEhCPADH112 и pαZO-1 антител, а затем с FITC-и TRITC-вторичных антител, соответственно. Ядра окрашивали DAPI. Стрелки: локализация белка в клеточных границ. Стрелки в XZ-плоскостях: локализация белка при боковом мембраны (наконечники стрел). Бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Е. гистолитика через EhCPADH112 вызывает эпителиальных разрушению барьера. MDCK монослоя инкубировали с живыми трофозоитов(T) T или предварительно инкубировали с ингибиторами протеазы (PI) или mαEhCPADH112 антитела (α) в течение 30 мин и TER оценивали в указанные моменты времени. TER была нормализована в соответствии с первоначальным значением для каждого Transwell (~ 3200 Ω · см 2). Средства и стандартные ошибки средств представлены для каждого момента времени. Статистический анализ был выполнен с GraphPad Prism 5 программного обеспечения с помощью теста ANOVA односторонний. *** P <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для изучения в пробирке хост-патогенных взаимодействий во время эпителиальной инфекции E. гистолитика, очень важно работать с хорошо известными культурами обеих эпителиальных клеток и трофозоитов. Например, ранее, Е. гистолитика культуры были, как правило, были созданы в сотрудничестве с некоторыми видами бактерий или trypanosomatids 22,23. Тем не менее, совместное культивирование E. гистолитика культуры является контрпродуктивным для изучения хост-патогенных взаимодействий потому наблюдаемые эффекты на клетки-хозяева не могли однозначно отнести к ameobas но может скорее эффект совместного культивируемых клеток. Таким образом, axenical культура Е. гистолитика желательно для рассмотрения конкретных хост-патогенных взаимодействий. При условии, протокол описывает, как такой стерильный выращивание Е. гистолитика может быть достигнуто в специально использовать такие культуры для инфекции исследований. Кроме того, времяурожая Е. гистолитика также имеет важное значение. Е. урожай гистолитика рекомендуется во время поздних стадиях экспоненциального роста для обеспечения высокого выхода клеток с высокой жизнеспособностью.
С другой стороны, хорошо установленный монослой эпителиальных клеток также является обязательным, чтобы получить воспроизводимые результаты. Для эмуляции физиологически плотный эпителиальный монослой, культивируемые клетки должны быть использованы в правильном ритме. Монослой должен быть полностью сформирован без каких-либо отверстий. Кроме того, правильное формирование TJ и AJ требуется некоторое время после сотовые контакты установлены. Как правило, эпителиальные клетки контакт-ингибируется, а это означает, что клетки остановить пролиферирующих в сливной монослоя, так что она, как правило, лучше, чтобы дать клеткам еще один день роста. Тем не менее, это не должно быть расширена, так как это контакт ингибирование не является бесконечным и клетки могут в какой-то момент начинают зарастают друг с другом. Если это наблюдается необходимо будет разделить или дискARD клетки и не использовать их в анализах. Формирование плотных эпителиальных монослоев лучше контролируется путем измерения ТЭР. Однако это требует роста Transwell фильтрами, которые довольно дорого. Чтобы развить глаз для хорошего монослоя это может быть полезно для неопытных экспериментатора, чтобы сравнить рост клеток в том же формате выращивания после распространения различных числа клеток.
Сроки паразит-хозяин взаимодействия анализа является еще одним важным фактором. Через 2 мин взаимодействия, независимо от эпителиальных повреждений не наблюдалось, но взаимодействие EhCPADH112 с молекулой TJ ZO-1 был уже очевиден. Однако после 30 мин взаимодействия, тяжелая эпителиальных повреждений наблюдалось, как указано TJ разборки и капли тер (10 и это исследование). Эти данные позволяют предположить, что в начале клей взаимодействие с апикальной эпителиальной стороне необходимо ослабить контакты и позволяют проникновению других молекул, таких как протеазы, которые затем вносят вклад вдеградация другой TJ, AJ и десмосома молекул. Концентрация трофозоиты белков также имеет важное значение. Следует отметить, что различные результаты можно было наблюдать при применении живых трофозоиты или просто лизатов или секретируемые продукты Е. гистолитика. Удельный вес трофозоитов в эпителиальных клетках было ранее доказано 10 и даже, когда отношение MDCK-к-секретируемых продуктов по амеба была высокой (1:10), эпителиальных повреждений не было столь серьезным. Это указывает не только что концентрация одного белка вирулентности является критическим, но что она также может быть взаимодействие различных факторов, которые приводят к эффективному эпителиальных повреждений, чтобы позволить быстрое вторжение амебы. Например, группа Chadee особое внимание обращается на важность другого амебы полученных протеазы, EhCP5, чтобы вызвать повреждение эпителия 16. Вполне вероятно, что взаимодействие факторов вирулентности в естественных условиях, необходимых для индукции амебиаз и что недостающие взаимодействия из-за inhibitioн из одного белка может объяснить тот факт, что в большинстве случаев инфекции находятся в состоянии покоя. В этом отношении также важно отметить, что эпителиальные продукты, такие как муцин важны для защиты от инфекции. В частности, mucin2 нокаут мышей более восприимчивы к EhCP5-индуцированных TJ изменений и инфекции 16. Таким образом, изменения на эпителиальной стороне также необходимо учитывать для оценки амеба инвазивность.
Одним из важных ограничений из описанных технологий для обнаружения совместную локализацию в том, что он не однозначно доказать непосредственное взаимодействие. В этом случае взаимодействие совместная локализация или может быть также опосредовано другим белком, который просто не визуализируется. Для обнаружения непосредственное взаимодействие, будет необходимо производить рекомбинантные помечены (например, GST или 10xHis) белки и выполнять иммунопреципитации для одного тега и вестерн-блоттинга для другого. В любом случае, иммунофлюоресценции окрашивания имеют то преимущество, раскрывая EXAКТ сотовой расположение белкового комплекса и дать экспериментатор представление о том, белков, которые должны быть проверены в таком взаимодействия анализа в пробирке. Еще одним недостатком является то, что есть только несколько амеба-специфические антитела доступные. Таким образом, если человек хочет учиться определенные белки амеба в таких исследованиях взаимодействия, то, скорее всего, потребуется поколение антитела. Однако, если доступны антитела, описанные методы могут быть применены для изучения актуальность других белков, секретируемых амебы (или поверхностно-связанный) для хост-патоген взаимодействий.
Эта статья описывает простой модели для обнаружения совместной локализации и взаимодействия между молекулами хозяина и паразита. Знания, полученные в этих экспериментах на клеточной основе могут быть применены в в естественных условиях моделей инфекции с использованием хомяков или мышей, чтобы подтвердить физиологическое значение для принимающей вторжения паразитом. Эти данные затем могут быть использованы для разработки новых лечения стратеtegies.
Таким образом, мы предоставляем подробные протоколы для выращивания E. гистолитика и эпителиальные клетки для использования в принимающих-патоген исследований взаимодействия, в частности, анализов, которые позволяют оценить совместной локализации и TJ разборки. Сроки культур, а также, что из каждого анализа имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимости полученных результатов. В то время как временная из культур могут оказывать влияние изменения количества распространяемых клеток, сроки самих экспериментов зависит от типа анализа и типа белков исследуемых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
