Summary
Mänsklig infektion med Entamoeba histolytica leder till amoebiasis, en viktig orsak till diarré i tropiska länder. Infektion initieras av patogen interaktioner med intestinala epitelceller, provocera öppnandet av cell-cellkontakter och därmed diarré, ibland följt av leverinfektion. Den här artikeln innehåller en modell för att bedöma de tidiga värd-patogen interaktioner för att förbättra vår förståelse av amoebiasis patogenes.
Abstract
Entamoeba histolytica är vilka smittämnen av humant amoebiasis, en viktig orsak till diarré och lever abscess i tropiska länder. Infektion initieras genom interaktion av patogenen med tarmepitelceller. Denna interaktion leder till störningar av intercellulära strukturer som tight junctions (TJ). TJ säkra tätning av epitelskiktet att skilja värdvävnad från tarmlumen. Nya studier visar att störning av TJ från parasitprotein EhCPADH112 är en förutsättning för E. histolytica invasion som åtföljs av epitelbarriär dysfunktion. Således, analys av molekylära mekanismer som är involverade i TJ demontering under E. histolytica invasion är av största vikt för att förbättra vår förståelse av amoebiasis patogenes. I denna artikel presenteras en enkel modell som gör det möjligt att bedöma inledande värd-patogen interaktioner och parasiten invasionen potential. Parametrar som skall analyseras innefattar transepithelial elektriskt motstånd, interaktion av EhCPADH112 med epitel ytreceptorer, förändringar i uttryck och lokalisering av epiteliala junctionala markörer och lokalisering av parasit molekyler i epitelceller.
Introduction
Entamoeba histolytica är en enda cell protozo ansvarig för mänsklig amoebiasis, en tarminfektion som orsakar inflammation och diarré. E. histolytica infekterar upp till 50 miljoner människor varje år, men endast omkring 10% av smittade människor utvecklar symptom i samband med amoebiasis 1. Infektion sker vid intag av förorenad mat eller vatten som innehåller E. histolytica cystor. I tarmen, cystor producerar levande trofozoiter som följer kolon mucin och föröka 2. Trofozoiter bildar vanligtvis cystor som utsöndras via avföringen. I andra fall, och för ännu okänd anledning, trofozoiter bryter tarmens epitel lagret och invadera underliggande vävnader. I värsta fall, de går in i blodomloppet och påverkar andra organ såsom lever 3.
Breaking epitelbarriären kräver avbrott i epithelial transmembran strukturer som upprätthåller celler förenade. Epithelial cellkontakter är bildade genom den apikala Junktional komplex bestående av tät (TJ) och adherensgränssnitten korsningar (AJ), och desmosomer 4. De mest apikala korsningar är TJ, och därför är de den första barriären förolämpad av E. histolytica och några andra patogener under värd invasion. TJ består av transmembran adhesionsreceptorer såsom claudins, occludin och Junktional adhesionsmolekyler (JAM) som bedriver homo-eller heterofila interaktioner med receptorer i granncellen. De är intracellulärt bundna av ställnings molekyler av zonula occludens (ZO) familj som ansluter adhesionsreceptorer till aktin cytoskelettet att ge ytterligare mekanisk hållfasthet till epitelet. TJ är ansvariga för att täta tarmvävnad från tarmlumen, förhindra alltför vatten och lösta ämnen läckage. Således, efter TJ störs av parasiten, är vävnaderna invaderade. E. histolytica utsöndrar flera molekyler såsom: (i) de som är involverade i vidhäftning av amöbor till Target celler 5; (II), membranaktiva faktorer som deltar i avlivning av värdceller genom exocytos, exempelvis jon-kanalbildande peptider benämnda amoebapores 6,7; och (iii) proteinaser som bryter ned extracellulära matrisproteiner, och medierar vävnadssönderfalls 5,8,9.
Den cysteinproteas EhCP112 och adhesionsmolekylen EhADH112 som tillsammans bildar EhCPADH112 komplexet är två E. histolytica virulens proteiner som spelar en viktig roll vid demonteringen av TJ 10. Live trofozoiter, deras totala lysat och utsöndrade produkter inducerar molekylära förändringar i TJ komplex och funktionell störning av epiteliala barriären. I denna studie visas det att EhCP112 och EhADH112 samverka med occludin och claudin-1-proteiner som leder till internalisering och nedbrytning av cellproteiner, vilket underlättar E. histolytica ingång genom paracellulära vägen.
Våra data och de som of andra grupper 11-17 tyder starkt nödvändigheten av specifika värd-patogen interaktioner som tillåter parasit invasion. Reda ut den molekylära grunden för dessa interaktioner är av största betydelse för en bättre förståelse av amoebiasis patogenes. Selektiv störning av TJ av trofozoiter, kännetecknade av ökad paracellulär permeabilitet, kan mätas genom en minskning i transepitelial elektrisk resistans (TER). Den överföring av parasitproteiner mot värd epitel kan bestämmas genom immunofluorescens färgning och konfokal laser mikroskopi, en metod som också kan avslöja co-lokalisering av amöba virulensfaktorer med epithelial junctionala markörer som anger eventuella direkta interaktioner. I den här artikeln beskriver vi i detalj hur epitelceller och trofozoiter odlas, skördas och manipuleras för att undersöka värd-patogen interaktioner och deras konsekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Upprättande och underhåll av E. histolytica Kulturer
- Väx axeniskt (helt fri från alla andra kontaminerande organismer) 1 x 10 5 trofozoiter av Entamoeba histolytica stam HML: IMSS klona en 18 i 16 x 125 mm odlingsrör med Teflon liner skruvlock (eller 1 x 10 6 trofozoiter i en engångs T- 25 kolv) och 15 ml (eller 50 ml i T-25-kolv) av TYI-S-33-medium (TYI-buljong kompletterad med 3% Diamond vitaminblandning, 10% värmeinaktiverat serum från vuxna nötkreatur, 0,5 lU / ml penicillin och 35 | ig / ml streptomycin) 19 i en inkubator vid 37 ° C.
- Harvest trofozoiter under den logaritmiska tillväxtfasen vanligtvis vid 48 till 96 timmars intervall (Figur 1) genom kylning av odlingsrör för 5 till 10 minuter i ett is-vattenbad för att släppa trofozoiter fästa vid glaset odlingsrör.
- Överför kulturen i ett koniskt rör och vänd den flera gånger för att skingra CELls. Bestäm antalet celler med hjälp av en hemocytometer (Neubauer kammare), och överför ett inokulat i en kultur rör som innehåller färsk TYI-S-33-medium.
- Använd lågt antal amöbor för längre inkubationstid (~ 3 x 10 5 celler för ~ 5 dagar) och ett högre nummer för kortare perioder (~ 1 x 10 6 celler för ~ 1 dag). Samtidigt räknade inokulat är önskvärda, etablerade kulturer blir förutsägbar, så att uppskattade volymer av inokulat är genomförbara.
- Titrera mängden trofozoiter att optimera cell nummer för varje experiment.
- Upprätthålla en parallell duplikat kultur att ha en back-up i händelse av oavsiktlig kontaminering eller rör brott.
- Förslut rören väl och inkubera dem vid 37 ° C i en 5 ° lutande horisontell vinkel.
- Kontrollera kulturer genom visuell inspektion regelbundet, eftersom en överdriven tillväxt av kulturen kan innehålla många lyserade celler.
2. Upprättande och underhåll av MDCK Kultur </ P>
- Väx MDCK (Madin Darby Canine Kidney)-celler av typ I (hög resistans) i engångs T-75-kolvar med 10 ml DMEM-medium kompletterat med penicillin (100 lU / ml), streptomycin (100 mg / ml), insulin (0,08 U / ml) och 10% neonatal kalvserum i en fuktig atmosfär av 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C.
- För att dela upp cellerna, kontrollera dem på ett inverterat mikroskop. Dela upp celler när de är ~ 85-100% sammanflytande.
- Använd en vakuumsuganordning i en steril huva och en steril glas pasteurpipett för avlägsnande av materialet från kulturen. För att undvika att skrapa celler, vrid kolven upp och ner och aspirera media från det nedre hörnet.
- Dispensera 10 ml förvärmd PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) till en T-75-kolv (5 ml i fallet med en T-25-kolv ) och försiktigt vicka kolven att tvätta cellerna. Ta bort PBS genom vakuumsugning. Omfattande tvättning krävs eftersom serum hämmar trypsin.
- Fördela 1,5 ml 0,05% trypsin i en T-75 kolv (för T-25 kolv använder 0,5 ml) och försiktigt vicka kolven att täcka cellagret med trypsin.
- Inkubera i 5-10 min i inkubatorn (exakt tid beror på trypsin aktivitet).
- Kontrollera om cell lossnar genom att hålla flaskan mot ljuset och leta efter strömmande celler. Kan också kontrolleras cell lossnar (rundade celler) med hjälp av ett mikroskop. Ofta celler släpper snabbare med en snabb, skonsam smäll på sidan av kolven.
- Tillsätt 15 ml kompletterat DMEM till en T-75 kolv (5 ml till en T-25-kolv). Resuspendera cellerna genom pipettering upp och ned fyra eller fem gånger.
- Att propagera celler, späd cellsuspensionen 1:05 med färskt kompletterat DMEM. Celler nummer kan också bestämmas på denna punkt med hjälp av en hemocytometer men det är oftast bara nödvändigt om att dela upp celler i specialformat för vissa analyser.
3. Beredning av trophozoite Totalt Lysates
- Drag av trofozoiter från culture rör genom kylning av röret i 5 till 10 minuter i ett is-vattenbad. Överför odlings aseptiskt i ett koniskt rör och centrifugera vid 360 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Försiktigt kassera supernatanten genom dekantering, lägga iskall PBS till pellets, vänd röret flera gånger för att skingra celler och centrifugera igen vid 360 xg under 10 minuter. Upprepa detta steg två gånger för att avlägsna alla spår av TYI-S-33-medium.
- Bestäm trofozoiter nummer med hjälp av en hemocytometer.
- Lyse-trofozoiter genom frysnings-upptiningscykler. Snap-frysa en uppmätt inokulat av trofozoiter (600.000 trofozoiter / ml) utspädd i iskall PBS, i flytande kväve i 1 min. Frigöra provet vid 4 ° C och skaka kraftigt. Upprepa frysning och upptining 3 gånger för att avsluta cellslys.
- Aktivera proteaser närvarande i lysaten med 0,02% β-merkaptoetanol.
4. Beredning av trophozoite utsöndrade produkter
- Utför steg från 3,1 till 3,2.
- Bestämceller nummer och livskraft på denna punkt med hjälp av en hemocytometer och tillämpa en trypanblåttuteslutning testet 20:
- Späd 9 x 10 6 trofozoiter i 3 ml iskall PBS och överföringsceller i en 50 ml koniska rör. Ta 10 | il av denna suspension och tillsätt 1 pl av 0,4% trypanblått stamlösning pH 7,2.
- Använd ett Neubauer kammare för att räkna celler vid låg förstoring.
- Räkna alla celler och separera antalet blå celler, eftersom blå celler har tagit upp färgen och måste betraktas som död.
- Beräkna den procentuella andelen livsdugliga celler genom att dividera antalet livskraftiga celler med det totala antalet celler och multiplicera med 100.
- Överför det koniska röret innehållande den trofozoit suspensionen i inkubator vid 37 ° C under 2 h i en 5 ° lutande horisontell vinkel.
- För att samla de utsöndrade produkter, centrifugrör vid 360 xg under 10 min. Använd en engångs och steril spruta och noggrant samla supernatant undvika kontaminering av prover med trofozoiter från pelleten. Eliminera eventuella överförda cellerna genom passage av supernatanten genom ett 0,22 | im cellulosaacetat-membran. Aktivera proteaser med 0,02% β-merkaptoetanol.
- Om du inte vill förmodade oönskad förorening med molekyler frigörs från döda celler, återigen tillämpa trypanblåttuteslutning test för cellernas livskraft. Livskraftig och totala antalet celler bör vara samma som erhålls i steg 4.2. Om detta inte är fallet, kan den uppsamlade supernatanten inte bara innehåller utsöndrade proteiner och skall kasseras.
5. Interaktion av MDCK celler med Trophozoites, trophozoite Lysates eller utsöndras produkter
- Inkubera sammanflytande MDCK cellen monolager med levande trofozoiter (en kvot MDCK-till-amöba 1:1), trophozoite lysat (ett förhållande MDCK-till-amöba 1:2) eller utsöndrade produkter (en kvot MDCK-till-amöba av 1 : 10) vid 37 ° C i 2 och 30 min (Figur 2A).
- Tvätta epitelceller fem gånger med iskall PBS för att avlägsna obundna molekyler eller trophozoites.
6. Beredning av prover för immunofluorescens
- Kultur MDCK celler på sterila täckglas placeras i en 24-multispot cellodlingsskål. Inspektera cellerna på inverterat mikroskop tills de når 100% av sammanflöde. Därefter ersätta mediet med 1 ml färskt kompletterat DMEM-medium och överföra plattan till en 37 ° C inkubator i 24 timmar mer.
- Avlägsna medium med användning av en vakuumsuganordning och en steril glas pasteurpipett och tillsätt 1 ml av varm PBS till varje brunn. Ta bort PBS och upprepa tvätt med färsk PBS. Se till att inte skrapa cellerna från botten av brunnen med glaspipett.
- Lägg till olika villkor för trofozoiter utspädda i 1 ml varmt PBS: levande trofozoiter (T), trophozoite totala lysates (TL) och utsöndrade produkter (SP).
- Sätt odlingsplattan i inkubatorn under 2 eller 30 min.
- Bered två kontrollförhållanden: en namngiven tid 0 min, där MDCK celler bör inte inkuberas med E. histolytica men endast med 1 ml varm PBS; och ett annat tillstånd som sekundära antikroppar kontroll, i detta fall inkubera MDCK med T, TL eller SP för 2 eller 30 min och utelämna inkubation med primära antikroppar.
- Tvätta epitelceller fem gånger med kall PBS för att avlägsna obundna molekyler eller trophozoites.
- Fixa och permeabilisering av cellerna med 1 ml 96% etanol under 30 min vid -20 ° C.
- För att avlägsna etanol, utför tre snabba tvättningar med 1 ml PBS vid rumstemperatur.
- Utför följande steg i en fuktig kammare för att undvika uttorkning av prover:
- Använd alla tillgängliga platt låda som kan stängas och fylld med en våt pappershandduk på vilka prover säkert kan placeras. Till exempel tjänar en tom pipettspetsen låda detta syfte väl.
- Inne i kammaren, jämnt placera en Parafilm lager och pipett 25 pl blocketningslösning (0,5% BSA) för varje täckglas.
- Ta täck ur brunnarna med fin pincett, försiktigt bort överflödig vätska från kanten med ett filterpapper och sätta täckglas i droppen som innehåller blockerande lösningen (0,5% BSA) med cellerna mot blockerande lösningen. Inkubera proverna i 1 h vid rumstemperatur.
- Förbered en blandning av primära antikroppar i PBS: IgM-mus anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112, spädning 1:10) och IgG-kanin anti-ZO-1 (pα-ZO-1, 1:100 utspädning).
- Placera ett nytt pappersark av Parafilm i den fuktiga rutan och pipett 25 pl antikroppar lösningen för varje täckglas.
- Lyft täckglasen från den blockerande lösningen, torka eventuellt överskott av vätska vid kanterna med ett filterpapper, och placera dem i dropparna med cellerna mot antikroppslösningen. Inkubera proverna över natten vid 4 ° C.
- Placera varje täckglas i en brunn på en 24-multispot (cellsidan överst) och tillsätt 1 ml PBS.
- Förbered en blandning av fluorescerande sekundära antikroppar i PBS: get-anti-IgM mus kopplad till FITC (1:100 utspädning) och get-anti-IgG-kanin kopplat till TRITC (1:50 spädning).
- Placera ett nytt pappersark av Parafilm i fuktig låda och pipettera 25 | il av den sekundära antikroppar lösningen för varje täckglas.
- Överför proverna såsom i 6,10 och inkubera under 1 h vid rumstemperatur i mörker för att undvika blekning av de fluorescerande färgämnena. Upprepa steg 6.11.1.
- För nukleär färgning, inkubera i 3 min med 200 pl 0,05 mM DAPI-lösning i rumstemperatur och skydda mot ljus. Upprepa steg 6.11.1.
- För att spara de fluorescerande färgämnen, placera täckglas (celler nedåt) i 5 pl Vecta Shield antifade monteringslösning på objektglas. Täta täckglas med hjälp av nagellack för att undvika provtorkning.
- För långtidsförvaring, hålla bilder i enobjektglas box vid -20 ° C.
- Analysera förberedelser konfokalmikroskopi genom Z-stack sektioner och xz-plan (Figur 2A).
7. Inkubation av Trophozoites med proteashämmare eller specifik antikropp
- Upprepa steg från 3,1 till 3,2. För varje försöksbetingelse, inkubera 1 x 10 5 trofozoiter (återsuspenderades i 50 | il PBS) med proteashämmare (1 mM, Complete och E-64 40 ^ g / ml) eller 30 | ig monoklonal antikropp mot EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 under 20 min vid 4 ° C (Figur 2B). Använd dessa preparat för samtidig inkubering analyser såsom beskrivs i steg 8,5.
8. Mätning av transepitelial elektriskt motstånd (TER)
- Kultur MDCK celler på sterila Transwell genomsläppstöd (0,4 ìm porstorlek). I det övre facket, placera 100 ^ cell fjädring och i det nedre facketPlacera 600 l av kompletterat DMEM-medium.
- Kontrollera medelhög nivå med jämna mellanrum. Färskt medium kan tillsättas efter behov.
- Inspektera cellerna på ett inverterat mikroskop tills de når 100% av sammanflöde. Ändra medel var 2-3 dagar.
- För att förbättra cellvidhäftning (om nödvändigt), jämviktas Transwell filter över natten vid 37 ° C i DMEM före tillsats av cellsuspension.
- Sterilisera stx2 elektroder i huven genom nedsänkning i etanol och därefter i steril PBS i 15 minuter vardera, under UV-ljus. Anslut elektroderna till en EVOM epitelial voltohmmeter och väljer motstånd läge.
- Samla medium från det övre utrymmet för varje transwell och slå dem. Ta 50 l av denna medieblandning och kombinera det med 50 l av trofozoiter fjädring (1 x 10 5 trofozoiter i PBS) eller med enbart PBS (kontroll). Använd en liknande blandning för varje transwell.
- Lägg blandningar till den övre kammaren i varje transwell containing MDCK cellerna. Experimentella förhållanden inkluderar MDCK celler utan trofozoiter (kontroll), en co-kultur med trofozoiter eller med trofozoiter förinkuberats med proteashämmare eller mαEhCPADH112. För att eliminera det motstånd som tillhandahålls av filter, använd transwells inkuberade med bara medium. För varje experimentell skick använd minst tre transwells.
- Omedelbart, mäta TER genom att doppa de stx2 elektroder i varje transwell.
- Säkerställ att den längre elektroden vidrör botten av den nedre kammaren och att den kortare elektroden täcks av mediet i den övre avdelningen (se Figur 2B).
- Se till att hålla elektroderna vinkelrätt varje gång. Detta kommer att förbättra reproducerbarhet, avsevärt. Undvik att flytta eller luta elektroden under mätningarna eftersom detta kommer att leda till variation av uppgifter.
- Denna mätning bör betraktas initial TER värdet. Därefter, övervaka TER under följande30 min.
- För att beräkna det slutliga TER värdet, subtrahera TER värdet av endast filter. För att jämföra resultat från olika experiment normalisera varje datapunkt till de ursprungliga värdena, tar dessa som 100% (Figur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För en lyckad E. histolytica kultur, måste två viktiga villkor uppfyllas: tillväxt i axeniska förhållanden och skörd i logaritmisk fas. Tidigare, kulturer av E. histolytica var lätt etablerade i samband med vissa arter av bakterier eller trypanosomatids 22. Men numera är det vanligt att ha axenisk odling av denna parasit betyder obestämd subkulturer av amöbor i en miljö fri från metaboliserande bakterier, svampar, protozoer, eller flercelliga celler. Dessutom är avgörande skörda trophozoites under den sena logaritmiska till tidiga stationära tillväxtfasen för att ha livskraftiga och förökar cellerna 23. Därför är det viktigt att skilja denna fas genom kvantifiering av trofozoiter längs flera dagar och även genom att granska deras intakta morfologi och snabb förflyttning (Figur 1).
För interaktionsstudier, epitelceller måstei ett sammanflytande monolager att representera fysiologiska förhållanden som amöbor normalt skulle stöta i kroppen. Flera epitelcellinjer, lätta att odla, är tillgängliga. Medan en mer fysiologisk cellmodellsystem skulle komma från tarmen såsom Caco-2 eller T84, dessa cellinjer växer ganska långsamt. En snabbare växande cellinje som i stor utsträckning har studerats är MDCK celler 24. Dessa epitelceller är av njur ursprung och kännetecknas av hög TER, stark TJ och enkel odling. Denna cellinje har använts i årtionden för att studera cellbiologi av korsningar och TJ sammansättning samt mekanismer för TJ montering och demontering. Av dessa skäl är MDCK celler ofta väljs av forskare när de studerar TJ funktioner. MDCK celler har också i stor utsträckning som en modell för studier av mekanismer som induceras under amoebiasis 5,8,10,25-28. I en nyligen genomförd studie, rapporterade vi att samverkan mellan stam jag MDCK celler och tarm Caco-2-celler med lIve amöbor, lysat och amöbaprodukter orsakade liknande effekter på TJ sammansättning och TER 10. Således MDCK celler är en lämplig modell för att studera mekanismerna för amöba-epitel interaktioner. Vidare har användningen av flera E. histolytica produkter (intakta trofozoiter, trophozoite totala lysat eller utsöndrade produkter som skördas som trofozoiter kultursupernatant) är avgörande för att ge ytterligare och relevant information om molekyler som är inblandade i dessa interaktioner, såsom tillgänglighet, verkningsmekanism, sekretion, medverkan av andra molekyler och utlösning av signalvägar.
Samtidigt når konfluens, epitelceller bildar kontakter som stabiliseras av TJ och AJ. Dessa strukturer består av vissa molekyler som kan visualiseras genom användning av specifika antikroppar i immunfluorescensfärgningar. Till exempel i figur 3, är cell-kontakter visualiseras genom en antikropp mot TJ markör ZO-1 och en röd fluorescerande labbELED sekundär antikropp. Som det kan ses, celler samlas nära varandra för att bilda ett tätt monolager utan hål. I denna siffra har amöba-härledd komplex EhCPADH112 varit färgas med en monoklonal antikropp som detekteras av ett grönt fluorescerande sekundär antikropp för att studera interaktionen av denna komplexa med epitelytan. Tre olika källor av denna komplexa har tillämpats på den epiteliala cellslager: levande trofozoiter (T), trophozoite totala lysates (TL) och utsöndrade produkter (SP). Påfallande, i alla fall, kan observeras co-lokalisering av EhCPADH112 med ZO-1 (Figur 3, pilar), vilket indikerar att denna komplexa kan krävas för att underlätta E. histolytica tränger in i epithelial monolager.
Även om redan kan observeras denna interaktion så tidigt som 2 min efter amöba-epitelceller kontakt, är cellskiktet ännu inte påverkats av detta samspel eftersom ZO-1 färgning ser fortfarande continuous. Detta ändrar helt efter längre inkuberingstider enligt Figur 4. Här var bilderna togs efter 30 minuter av exponering för de tre olika EhCPADH112 källor. En tydlig störning av TJ visualiseras av en diskontinuerlig ZO-1 färgning på cellkantlinjer (Figur 4, pilar), med den mest uppenbara effekten uppstår i MDCK cell i kontakt med T-eller TL. Däremot blir ZO-1 internaliseras och ses i intracellulära vesiklar. Exakt samlokalisering med antingen TJ eller AJ längs sidomembran cellen kan inte särskiljas genom att bara titta på toppen av monolager utan snarare genom att erhålla en "sida"-bild av cellkontakter 29. Konfokal lasermikroskopi tillåter sådan vy längs xz-axeln såsom visas i figurerna 3 och 4 under varje xy vy. Dessa bilder visar ett tydligt uttalande om proteiner samlokalisering med TJ på den mest apikala delen av den laterala membran eller om de är ganska belägnaNedan TJ eller över TJ på apikala membranet. I figur kan observeras 3 (pilspetsar), en exakt co-lokalisering av EhCPADH112 komplex med ZO-1, tydligt avslöjar TJ som platsen för åtgärden för denna virulensfaktor. Däremot, som E. histolytica invasion skridit (30 min av interaktion) i epitel, EhCPADH112 penetrerade mot intercellulära utrymmet som färgnings längs den laterala membran visade (Figur 4, pilspetsar). I vår senaste papper, denna metod tillät oss att skilja mellan TJ och AJ eftersom denna komplexa endast samlokaliserade med TJ markörer occludin och claudin-1 men inte med AJ markör β-catenin vid 2 min av interaktion 10.
Internalisering av TJ-komponenter, såsom kan ses i immunfluorescensfärgningar i figur 4, vanligen åtföljs av en förlust av barriärfunktionen, som kan mätas av transepitelial elektrisk resistans (TER). TERspeglar jonflöde över den epiteliala monoskiktet och kan mätas med användning av elektroder, som visas i figur 2B. När monolager är ännu inte helt bildas eller störd på grund av extracellulära signaler, är ett fritt flöde av joner över cellskiktet indikeras av en låg TER. TER mättes av en kontrollsammanflytande monolager som inte har varit i kontakt med amöbaprodukter eller monolager i kontakt med trofozoiter (Figur 5). Parasit kontakt störde epitelbarriär funktion indikeras av en TER nedgång på 90% i jämförelse med kontrollmonolager. För att undersöka de mekanismer genom vilka trofozoiter påverkar barriärfunktion, vi förinkuberas de trophozoites med en antikropp mot EhCPADH112 att förhindra vidhäftning av denna komplexa eller med proteashämmare, för att blockera den proteolytiska aktiviteten av denna komplexa och andra proteaser viktiga för mål cellskador. Båda behandlingarna ledde till en nästan total omsvängning av TER droppe, vilket tyder på att både proteolytiska aktivitet och vidhäftningsegenskaper är viktiga virulensfaktorer i detta komplex under E. histolytica invasion.
Figur 1. Typiska tillväxtkurva av axeniskt odlade E. histolytica trophozoites. Inokula av 2 x 10 5 trofozoiter av E. histolytica HMI-IMSS klon A fick tillväxa i 6 brunnar med TYI-S-33-medium och efter varje 24 hr cellantal bestämdes med användning av en hematocytomer. Celltillväxt övervakades genom Ijusmikroskopi och morfologi av växande celler avbildas i den övre panelen. Mängden trofozoiter övervakades under 6 dagar (d) och värdena ritas i diagrammet nedan. Data representerar medelvärdet och standardfelet för medelvärdet av tre oberoende mätningar. Bar = 10 pm./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk representation av växelverkan bland MDCK-celler och olika villkor E. histolytica. A) Olika villkor för E. histolytica visas: levande trofozoiter (T), totalt trofozoiter lysat (TL) och molekyler som utsöndras av trofozoiter i mediet (SP). Alla experimentella villkor analyserades för 2 och 30 minuter av inkubation med sammanflytande MDCK celler. Efter inkubering MDCK-celler abundantly tvättas för att avlägsna trofozoiter eller obundna parasit molekyler. Då prover bearbetades för immunofluorescens analyser, anställa mαEhCPADH112 och pαZO-1 Antibodtalet samar lokalisera den parasit komplexa EhCPADH112 och TJ markör ZO-1, respektive. Senare var artspecifika sekundära antikroppar kopplade till olika fluorokromer användas för att detektera båda proteinerna genom konfokalmikroskopi. B) Tillsats av trofozoiter endast eller trofozoiter förinkuberades med mαEhCPADH112 eller proteasinhibitorer för 20 min vid 4 ° C i den övre avdelningen av transwells innehållande sammanflytande MDCK-celler. TER i epitelceller övervakades med hjälp av en stx2 elektrod kopplad till en EVOM voltohmeter, under 30 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Lokalisering av EhCPADH112 vid TJ av MDCK monolager. MDCK-celler var incubetas med live trofozoiter (t), den totala trofozoiter lysat (TL) och molekyler som utsöndras av trofozoiter i mediet (SP) för 2 min. Övre panel: faskontrast bilder av MDCK celler. EhCPADH112 och ZO-1-proteiner identifierades genom mαEhCPADH112 och pαZO-1-antikroppar och sedan med FITC-och TRITC-sekundära antikroppar, respektive. Kärnor färgades med DAPI. Pilar: protein lokalisering vid cellgränserna. Arrowheads i xz-plan: protein lokalisering vid TJ. Bar = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Interna av EhCPADH112 i MDCK celler. MDCK celler inkuberades med levande trofozoiter (T), totalt trofozoiter lysates (TL) och molekyler som utsöndras av trofozoiter i mediet (SP) under 30 min. Övre panel: faskontrast bilder av MDCK celler. EhCPADH112 och ZO-1-proteiner identifierades genom mαEhCPADH112 och pαZO-1-antikroppar och sedan med FITC-och TRITC-sekundära antikroppar, respektive. Kärnor färgades med DAPI. Pilar: protein lokalisering vid cellgränserna. Arrowheads i xz-plan: protein lokalisering vid lateral membran (pilspetsar). Bar = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. E. histolytica via EhCPADH112 inducerar epitelbarriär störningar. MDCK monolager inkuberades med levande trofozoiter(T) eller T förinkuberades med proteashämmare (PI) eller mαEhCPADH112 antikropp (α) under 30 min och TER utvärderades vid olika tidpunkter. TER normaliserades enligt det ursprungliga värdet för varje transwell (~ 3,200 Ω · cm 2). Medel och standardavvikelser för de medel representeras för varje tidpunkt. Statistisk analys utfördes med GraphPad Prism 5 programvara med envägs ANOVA-test. *** P <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att studera in vitro värd-patogen interaktioner under epitel infektion av E. histolytica, är det viktigt att arbeta med väletablerade kulturer av både epitelceller och trophozoites. Till exempel, tidigare, E. histolytica kulturer hade vanligtvis upprättats i samband med vissa arter av bakterier eller trypanosomatids 22,23. Emellertid samodling av E. histolytica kulturer är kontraproduktivt för studier av värd-patogen interaktioner eftersom observerade effekterna på värdceller som inte entydigt kan hänföras till de ameobas utan kan snarare vara en effekt av de co-odlade celler. Sålunda kan en axenical kultur av E. histolytica är önskvärt att undersöka specifika värd-patogen interaktioner. Den medföljande protokoll beskriver hur en sådan axenisk odling av E. histolytica kan uppnås att specifikt utnyttja sådana kulturer för infektionsstudier. Dessutom timingenför skörd av E. histolytica är också kritisk. E. histolytica skörd rekommenderas under sena stadier av exponentiell tillväxt för att säkerställa en hög avkastning av celler med hög lönsamhet.
Å andra sidan, är en väletablerad monolager av epitelceller också obligatoriskt att få reproducerbara resultat. För att efterlikna ett fysiologiskt tight epitelial monolager, odlade celler måste användas på rätt timing. Monoskiktet måste vara helt bildas utan några hål. Dessutom rätt bildandet av TJ och AJ kräver en tid efter cellkontakter etableras. Vanligtvis epitelceller är kontakt-inhiberad, vilket innebär att cellerna slutar prolifererande i ett sammanhängande monoskikt, så att det vanligen bättre att ge cellerna en annan dag av tillväxt. Men detta bör inte utvidgas eftersom denna kontakt hämning är inte obegränsad och celler kan någon gång börjar växa över varandra. Om detta observeras det att vara nödvändigt att dela upp eller skivaard celler och inte använda dem i analyser. Bildandet av snäva epiteliala monolager är bäst kontrolleras genom att mäta TER. Detta kräver dock tillväxten i Transwell filter, som är ganska dyra. Att utveckla ett öga för ett bra monolager kan det vara till hjälp för oerfarna försöksledaren att jämföra celltillväxt i samma odlings format efter att sprida olika cellnummer.
Tidpunkten för värd-parasit interaktionen analysen är en annan avgörande faktor. Efter 2 min av interaktion kunde observeras någon epitelskada utan ett samspel av EhCPADH112 med TJ molekylen ZO-1 var redan uppenbar. Men efter 30 min interaktion, var svår epitelskada observeras såsom visas av TJ demontering och en droppe av TER (10 och denna studie). Dessa data tyder på att en tidig adhesiv interaktion med den apikala epitelial sida är nödvändig för att lossa kontakterna och tillåta penetrering av andra molekyler, såsom proteaser som därefter bidrar tillnedbrytning av andra TJ, AJ och Desmosome molekyler. Koncentrationen av trofozoiter proteiner är också viktigt. Notera, kunde olika resultat observeras vid tillämpningen levande trofozoiter eller bara lysat eller utsöndrade produkter av E. histolytica. Den relativa andelen trofozoiter till epitelceller har tidigare visat 10 och till och med när förhållandet mellan MDCK-till-utsöndras biprodukter från amöba var hög (1:10), var det epitelskada inte lika allvarliga. Detta visar inte bara att koncentrationen av en enda virulens protein är viktigt, men att det också kan vara samspelet mellan olika faktorer som leder till en effektiv epitelskada för att möjliggöra en snabb invasion av amöbor. Exempelvis Chadee grupp betonade vikten av en annan amöba-härledda proteas, EhCP5, att framkalla epitelskada 16. Det verkar troligt att ett samspel av virulensfaktorer är in vivo krävs för att inducera amoebiasis och att saknade interaktioner på grund inhibition av ett enda protein kan förklara det faktum att i de flesta fall infektioner är vilande. I detta avseende är det också viktigt att nämna att epithelial produkter såsom muciner är viktiga för att skydda mot infektion. Särskilt mucin2 knock-out-möss är mer mottagliga för EhCP5-inducerade TJ ombyggnader och infektion 16. Således förändringar på epitel sidan måste också beaktas för att bedöma amöba invasiv.
En viktig begränsning av de beskrivna teknikerna för att upptäcka co-lokalisering är att det inte entydigt fastställa en direkt interaktion. I detta fall kan en co-lokalisering eller interaktion skall också medieras av ett annat protein som är helt enkelt inte visualiseras. För att detektera en direkt interaktion, kommer det att vara nödvändigt att producera rekombinanta tagged (såsom GST eller 10xHis) proteiner och utför immunoutfällning för en tagg och Western blöt för det andra. Ändå, immunfluorescensfärgningar har den fördelen att avslöjande exact cellulär lokalisering av proteinkomplexet och ge försöksledaren en uppfattning om de proteiner som ska testas i en sådan in vitro interaktionsanalys. En annan nackdel är att det finns endast några amöba-specifika antikroppar finns tillgängliga. Alltså, om man vill studera vissa amöba proteiner i sådana interaktionsstudier, det kommer sannolikt att kräva generering av en antikropp. Om antikroppar finns tillgängliga, de beskrivna metoder kan tillämpas för att studera betydelsen av andra amöba proteiner (utsöndras eller ytbundet) för värd-patogen interaktioner.
Detta dokument beskriver en enkel modell för att upptäcka samlokalisering och växelverkan mellan molekyler av värd och parasit. Kunskapen från dessa cellbaserade experiment kan användas i in vivo infektion modeller med hjälp av hamstrar eller möss för att bekräfta den fysiologiska relevansen värd invasion av parasiten. Dessa data kan sedan användas för utveckling av ny behandling stragier.
Sammanfattningsvis ger vi detaljerade protokoll för odling av E. histolytica och epitelceller för användning i värd-patogen interaktionsstudier, i synnerhet analyser som möjliggör utvärdering av samlokalisering och TJ demontering. Timingen av odlingarna såväl som den för varje analys är avgörande för att säkerställa reproducerbarhet av erhållna resultat. Även om tidpunkten för kulturerna kan påverkas genom att variera antalet spridda celler, tidpunkten för experimenten i sig beror på den typ av analys och typen av proteiner som undersöktes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
