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Immunology and Infection

Détection in situ de autoréactifs T CD4 des cellules dans le cerveau et le cœur à l'aide majeur d'histocompatibilité Dextramers classe II

doi: 10.3791/51679 Published: August 1, 2014

Summary

Le protocole pour détecter les cellules autoréactives T CD4 dans le cerveau et le cœur par coloration directe avec les grands complexes dextramers d'histocompatibilité de classe II a été décrite dans le présent rapport. Pour une analyse complète, une méthode fiable pour énumérer les fréquences de cellules T CD4 + spécifiques de l'antigène in situ est également conçu.

Introduction

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L'utilisation de complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères pour la détection de cellules spécifiques de l'antigène T CD4 a été un défi 1-7. Pour améliorer la sensibilité de détection de tétramères CMH de classe II, l'équipe de recherche a créé des tétramères de la prochaine génération, désignés "dextramers" 8. Dextramers contiennent des squelettes de dextrane dans lequel de multiples fragments de streptavidine fluorophore sont conjugués, tels que plusieurs monomères du CMH biotinylés, des peptides attachés peuvent être attachés à une molécule de dextran 9. Ainsi, de grands agrégats de dextramers CMH qui contiennent plusieurs complexes CMH-peptide peut interagir avec plusieurs récepteurs de cellules T (TCR).

Ce groupe a récemment généré dextramers pour différents auto-antigènes et a démontré que la sensibilité de détection de dextramers était environ cinq fois plus que les tétramères 8. Les systèmes expérimentaux comprennent encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la protéine protéolipidique (PLP) 139-151 chez la souris SJL; EAE induite par la glycoprotéine de la myéline des oligodendrocytes (MOG) 35-55 dans C57BL / 6 souris; et la myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induite avec la myosine cardiaque chaîne lourde α-(MyHC) 334-352 chez des souris A / J. Cette étude démontre l'utilisation de PLP 139-151 - 334-352 dextramers MyHC et pour détecter les cellules spécifiques de l'antigène T CD4 in situ avec une spécificité en développant un protocole de coloration directe, éliminant ainsi la nécessité pour amplifier les signaux en utilisant des anticorps à partir de fluorophores, un approcher couramment employé à l'utilisation de tétramères. En outre, un procédé global de l'évaluation des tissus ont également été mis au point pour énumérer de manière fiable les fréquences des cellules T CD4 spécifiques de l'antigène in situ 10. La détection de cellules T spécifiques de l'antigène in situ permet la délimitation des événements provoqués par des stimuli antigéniques spécifiques de ceux causés par l'activation de l'observateur. De même, la technique in situ également PROVIDes possibilités pour suivre la cinétique d'infiltrations de cellules T spécifiques de l'antigène dans les organes cibles.

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Protocol

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Déclaration d'éthique:

Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par l'Université de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

Une. Induction de l'EAE

  1. Pour induire l'EAE, préparer l'émulsion de peptide / de l'adjuvant complet de Freund (CFA), comme décrit dans 11 avec les modifications suivantes: Etape 1.1:. Préparer PLP 139-151, à une concentration de 1 mg / ml dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) Étape 1.4:. utiliser 200 ul de FCA émulsion contenant 100 ug de PLP 139-151 par animal étape 1.4.1: pour immuniser des dix animaux, préparer 2 ml d'émulsion en mélangeant 1 ml de PLP 139-151 (1 mg / ml dans 1 x . PBS) et un volume égal de CFA étape 1.5: injecter 200 pi d'émulsion en doses fractionnées voie sous-cutanée dans les deux régions inguinales (~ 75 pi de chacun) et région sternale (~ 50 pi) de cinq à six semaines d'âge FEMAsouris le SJL / J. Les étapes 1.7 et 1.8 ne sont pas applicables pour l'induction de l'EAE.

2. Notation clinique des souris EAE et récolte de cerebrums

  1. Surveiller les animaux pour apparition des signes cliniques, et marquer la maladie gravité tous les jours de 9 jours après immunisation comme suit: 0 - sain; 1 - mou queue ou des membres postérieurs faiblesse, mais pas les deux; 2 - mou queue et des pattes postérieures faiblesse; 3 - paralysie partielle des membres postérieurs; 4 - la paralysie complète des membres postérieurs; 5 - morts ou moribonds 12.
  2. Euthanize la souris quand ils atteignent un score neurologique de 3 ou 4 à l'aide de CO 2. Pour euthanasier les souris, pré-remplir la chambre d'euthanasie d'abord avec le CO 2 en tournant le régulateur du réservoir de CO 2 ne dépassant pas 6 psi et permettre aux animaux de rester dans la chambre pendant environ 5 min pour atteindre l'asphyxie complète. Faire tremper les animaux euthanasiés dans 70% d'alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l'aide d'une paire de stérile pourcèpes et ciseaux exposent les cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs.
  3. Creuser le crâne en coupant le crâne de façon circulaire à l'aide d'une paire de ciseaux courbes, et soigneusement, retourner les os du crâne avec une pince. Récolter le cerveau par émousser la dissection et l'aide d'un scalpel propre, cerveau séparé du cervelet. Placez le cerveau dans un tube contenant froid 1x PBS et laisser le tube sur la glace jusqu'à ce que le traitement.

3. In Situ coloration des sections cérébrales avec CMH de classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Préparer 4% PBS tamponnée d'agarose bas point de fusion, fondu par chauffage à 50 ° C et laisser dans un bain-marie à 40 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Placez le cerveau dans un moule de base profonde cassette histologie disponible conservés sur de la glace, et versez fondu (40 ° C) agarose. Immédiatement, appuyez doucement sur le cerveauavec une pince pour s'immerger le tissu. Laisser la cassette sur la glace pendant 15-20 min jusqu'à ce que la solidification est terminée.
  3. Remplir la baignoire vibratome avec réfrigéré 1x PBS. Remplir l'espace autour vibratome bain de glaçons pour maintenir la température de PBS entre 0 et 2 ° C. Fixer une lame de rasoir propre dans le vibratome et régler l'angle de la lame à 15 °.
  4. Placement de tissu dans vibratome. Coupez l'excédent agarose de tous les côtés du tissu intégré et légèrement exposer la surface ventrale du cerveau.
    1. Étaler vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d'agarose-intégré sur la surface collée en plaçant la face ventrale du cerveau exposé sur la colle pour le sectionnement transversal. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc.
    2. Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min.
  5. Dans le même temps, placez le cham de tissuBers un par puits d'une plaque de 24 puits. Remplir les puits contenant les chambres de tissu avec 1 ml de PBS froid 1x, et laisser la plaque sur la glace.
    1. Préparer les chambres de tissu en attachant un nylon mince filet à la coupe en bout d'une pipette 25 ml de polypropylène en utilisant de la colle super; après la coupe du treillis en excès autour de la pipette, la pipette à couper une longueur de 1 cm à partir de la maille.
  6. Abaisser la lame vibratome au niveau de la surface supérieure du tissu; régler la vitesse de vibratome à 0,22 mm / s et commencer la coupe avec un mouvement vers l'avant pour faire 200 um sections épaisses. Transférer une partie cérébrale par puits en utilisant une brosse douce d'aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d'une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu'à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation des tissus. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir un total, trois sections paires de trois régions différentes du cerveau dorsale à la face ventrale (figure 2). Une section dechaque paire (sur un total de trois sections) placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers spécifiques (s IA / PLP 139-151) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de trois sections qui sont placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers de commande (IA s / TMEV 70-86) et anti-CD4.
  7. Transférer les trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pl de cocktail contenant une allophycocyanine (APC) conjugués PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) et anti-CD4-phycoérythrine (PE; 5 pg / ml) dans une solution de blocage (PBS 1x avec 2% de sérum normal de chèvre) a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle.
  8. De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de contrôle dans trois puits dans une plaque de 24 puits avec une chambre pour nousll dans laquelle, à 300 pl d'un cocktail contenant TMEV APC conjugué 70-86 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. Remarque: Reportez-vous à Massilamany et al, 8 pour la préparation de dextramers, et les molécules de dextran pour préparer dextramers ont été aimablement fournies par Immudex, Copenhague, Danemark..
  9. Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d'aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l'obscurité à la température ambiante.
  10. Après la période d'incubation, laver les coupes de tissus sur la plate-forme à bascule, en transférant les chambres de tissu pour un nouveau puits contenant 1 ml de PBS froid 1x, et éviter le dribble le contenu d'un bien dans l'autre. Répéter le lavage trois fois, ce qui permet au moins 10 min par lavage. Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas séchés car ils peuvent coller aux parois de la chambre.
  11. Fixer les sections en transférant le cham de tissubres dans un nouveau puits en plaque de 24 puits contenant 1 ml de filtre 4% de paraformaldéhyde tampon PBS (pH 7,4) sur une plate-forme à bascule pendant 2 heures avec des rotations douces.
  12. Répétez trois fois le lavage comme décrit à l'étape 3.10.
  13. Placez les coupes colorées et fixes sur une lame de microscope propre à l'aide d'une brosse douce de l'aquarelle. Essuyez l'excès d'eau sans toucher la partie, et monter la section en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire.
  14. Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C.

4. L'induction de l'EAM et Collection de coeurs

  1. Induire EAM comme décrit dans la référence 11.
  2. Euthanasier les souris au jour 21 après immunisation utilisant chambre propre équipé CO 2 bouteille de gaz, et tremper les animaux dans 70% d'alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l'aide d'une paire de pinces et des ciseaux exposer le cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs. Recueillir les coeurs et les placer dans des tubes contenant de froid 1x PBS.

5. In Situ coloration de coeur sections avec CMH de classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers

  1. Préparer 4% tampon PBS bas point de fusion d'agarose, faire fondre par chauffage à 50 ° C et le laisser dans un 40   ° C bain d'eau jusqu'à son utilisation.
  2. Placez le coeur dans une profonde cassette histologie de moule de base jetable conservé dans la glace, et versez fondu à 40 ° C jusqu'à ce que les tissus agarose sont complètement submergés, comme décrit dans l'étape 3.2.
  3. Suivez l'étape 3.3.
  4. Enlever l'excès d'agarose à partir de tous les côtés du tissu enrobé et légèrement exposer la base du cœur. Enduire vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d'agarose-intégré collé sur la surface en plaçant la surface exposée de l'coeur sur la colle. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc.
    1. Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min.
  5. Suivez les étapes 3.5 et 3.6.
  6. Transférer les sections de coeur avec une brosse douce d'aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d'une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu'à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation du tissu. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir au total, huit sections paires du sommet à la base du cœur (Figure 2). Placez toutes les sections de chambres de tissu, affecter jusqu'à 3 sections par chambre. Une section de chaque paire (sur un total de huit sections) est désignée pour la coloration avec dextramers spécifiques (IA k / MyHC 334-352) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de huit sections est désigné pour la coloration avec dextramers de commande (IA k / RNase 43-56) et des anti-CD4.
  7. Transférer letrois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d'un cocktail contenant des conjugués APC-MyHC 334-352 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle.
    1. De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de commande dans trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d'un cocktail contenant RNase APC conjugué 43-56 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle.
  8. Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d'aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l'obscurité à la température ambiante.
  9. Suivez les étapes, 3.10 à 3.11
  10. Répétez laver thrglace comme décrit à l'étape 3.10.
  11. Placez les coupes colorées et fixes (jusqu'à trois sections / diapositives) sur une lame de microscope propre à l'aide d'une brosse douce de l'aquarelle. Essuyez l'excès d'eau sans toucher les sections, et monter les sections en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire.
  12. Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C.

6. Analyse des Dextramer + (dext +) cellules T CD4 + par microscopie confocale à balayage laser Microscope (LSCM) (communs à l'cerveau et le cœur articles)

  1. Utilisez Nikon A1-Eclipse système de microscope confocal 90i pour la numérisation de routine et d'acquisition d'images. Pour commencer Cliquez ouvert, le logiciel NIS Elements AR (version 4.13).
    1. Choisissez "TRITC" et chaînes "Cy5" du panneau. Les excitation / émission des longueurs d'onde respectivement pour les canaux TRITC et Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm et 640,7 nm / 663-738 nm apparaissent par défaut.
    2. Attribuer la pseudocouleurs "vert" et "rouge" pour la TRITC (CD4-PE) et Cy5 (dextramer-APC) canaux, respectivement.
    3. Placer la lame d'être examiné sur la scène microscopique et mise au point manuellement sous un grossissement de 100X. Réglez le "HV" à 110 et le décalage de "0". Cliquez sur "Focus" et régler la «tension» pour optimiser les lasers.
    4. Cliquez sur "Focus"; numériser la section de haut en bas, et définir le niveau «Z» pour l'acquisition de l'image. Cliquez sur "série CH" et d'acquérir l'image séquentielle. Identifiez dext + cellules T CD4 + apparaissant cellules ponctuées comme jaunes sur la base de la co-localisation des signaux générés à la fois du rouge (dextramers) et vert (CD4) canaux.
  2. Utilisez Olympus FV500-BX60 microscope confocal pour l'énumération quantitative facile des cellules T CD4 + + DEXT. Pour commencercliquez ouverte, le logiciel de FluoView (version 4.3).
    1. Sélectionnez le colorants "Cy3» et «Cy5" dans le menu déroulant, puis cliquez sur "Appliquer" pour charger les lasers respectifs. Remarque: les longueurs d'onde d'excitation / émission pour Cy3 (543 nm / pseudocolored "vert"; CD4-PE), les canaux et Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored "rouge").
    2. Placer la lame d'être examiné sur la lame de microscope, et de se concentrer manuellement à faible grossissement (4X ou 10X). Cliquez sur "Focus" tandis que le laser Cy3 est sur, et de se concentrer le foyer inflammatoire.
    3. Modifier l'objectif à grossissement de 100X. Définissez la taille du fichier à "512/512" dans le menu déroulant. Cliquez sur "Focus" et ajuster les valeurs pour "PMT", "gain" et "Offset" paramètres pour optimiser les lasers séparément pour Cy3 et Cy5.
    4. Cliquez sur "étape de Z" puis cliquez sur "Focus" alors que les deux lasers sont sur. Setl'épaisseur de la "scène de Z" en cliquant sur le "haut" et "bas" flèches. Définissez l'intervalle "Z" à 2 pm.
    5. Cliquez sur "Stop", et choisissez "Seq123". Ensuite, cliquez sur "XYZ" et commencer à acquérir des images de la série "Z" pour la zone sélectionnée dans le foyer inflammatoire. Enregistrez les images "Z" de série dans un fichier AVI. Pour enregistrer des fichiers image, sélectionnez l'image de l '«image de série Z", puis enregistrer au format "tiff".
  3. Examiner trois sections appariées du cerveau où un ensemble de trois sections a été colorée avec / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 IA et l'autre ensemble de trois sections avec / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 IA pour effectuer analyse quantitative.
    1. De même, analyser huit sections appariées pour le coeur, dans lequel, un ensemble de huit sections a été colorée avec IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 et un autre soit de huit sections avec RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Examiner 10 à 15 foyers inflammatoires par section cerveau, et dans chaque foyer, d'acquérir un ensemble de 15 à 25 images en série séquentielle.
    1. Examiner un total de 20 foyers inflammatoires de toutes les huit sections de coeur et de chaque foyer acquérir 10 à 15 images en série séquentielle. Prenez les 'Z' images série en balayant les diapositives dans un mouvement «horizontal-vertical-vous-horizontal-vertical vers le bas» de sorte que la répétition de la série «Z» dans le même foyer est évitée.
    2. Une fois les images en série 'Z' sont capturés, nommer les fichiers en identifiant les numéros de diapositives, le nom des sections, et le nombre de 'Z' images prises en série.
      1. Utilisez le logiciel «ImageJ» pour compter les cellules T CD4 + + DEXT par rapport au nombre total de cellules T CD4 +. Sélectionnez le 'type de compteur »dans« ImageJ, consultez &# 8216; montrer tous »et commencer à compter en cliquant sur le centre de chaque cellule et continuer à compter dans différents 'Z' images en série à l'aide de flèches latérales. Après avoir compté toutes les cellules T CD4, choisir un autre type de compteur et le nombre de CD4 + dext + cellules T. Cliquez sur l'onglet des résultats pour obtenir le nombre total de cellules comptées avec les deux compteurs différents.
      2. Obtenir le nombre total, ajouter le nombre de cellules dans l'ensemble des images en série 'Z' représentent tous les trois sections cérébraux ou toutes les sections huit cardiaques.

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Representative Results

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Dans ce rapport, la détection in situ de spécifiques de l'antigène, auto-réactifs cellules T CD4 par coloration directe avec dextramers CMH de classe II en est décrite. Sections cérébrales fraîchement coupées ont été obtenues à partir de souris EAE et colorées avec des cocktails contenant PLP 139-151 (spécifique) ou TMEV 70-86 (contrôle) dextramers et anti-CD4. Les panneaux supérieurs de la figure 1 montre l'analyse LSCM de sections cérébrales costained avec PLP 139-151 dextramers (rouge) et CD4 (vert), où les cellules doubles positives apparues jaune. Une telle caractéristique est absente dans les sections colorées avec TMEV 70-86 Les dextramers (de contrôle) (panneaux inférieurs). Les cellules costained (DEXT + CD4 +) ont montré points ponctuées autour de la périphérie. L'analyse quantitative des cellules T spécifiques de PLP dans les sections cérébrales comportait les étapes suivantes (figure 2): 1) Les articles de trois paires sont faites, et une section de chaque paire était tachée individuellement avec anti-CD4 et PLP 139-151 dextramers. De même, une autre série de trois sections ont été colorées avec dextramers anti-CD4 et de contrôle (TMEV 70-86). 2) A partir d'une section donnée, foyers inflammatoires (10 à 15) ont été identifiés sur la base de la coloration anti-CD4. 3) Un ensemble d'images 'Z' de série (15 à 25) ont été pris de chaque foyer séquentiellement de haut en bas avec un intervalle de 2 um entre chaque. Pour l'essentiel, 10 à 15 ensembles d'images similaires en série 'Z' représentent le même nombre de foyers inflammatoires ont été analysées dans chaque section. 4) En images individuelles, les cellules CD4 + (vert), les cellules positives pour les deux dextramers (rouge) et CD4 (vert) qui sont apparus cellules ponctuées comme jaunes ont été dénombrées en les marquant individuellement à l'aide du logiciel open source, ImageJ, et enfin, un grand total a été obtenu pour chaque section en ajoutant le nombre de cellules comptées dans tous les 'Z' images en série. Parce que les cellules ont été marquées, la possibilité de recomptage des cellules dans plusieurs images qui sontchevauchement a été éliminé. Ainsi, le dénombrement fiable des cellules DEXT + par rapport au nombre total de cellules exprimant CD4 peut être obtenue.

Cette étude a été étendue pour démontrer l'utilisation de réactifs dextramer pour détecter les lymphocytes T sensibilisés à l'antigène in situ dans EAM induite avec MyHC 334-352 chez des souris A / J, qui est aussi une maladie médiée par les cellules T 13,14. Huit sections de coeur appariés ont été obtenus, chaque 200 um d'épaisseur, à partir de souris EAM (figure 2). De chaque paire, une section (avec un total de 8 articles) a été coloré avec MyHC 334-352 dextramers et anti-CD4, tandis qu'un autre ensemble de sections (8 au total) a été coloré avec de la RNase 43-56 dextramers (contrôle) et de la lutte -CD4. Vingt ensembles d'images en série 'Z' correspondant à celles de nombreux foyers inflammatoires représentant les huit parties ont été acquises séquentiellement comme ci-dessus (Figure 2). Pour l'essentiel, un ensemble donné d'im série "Z"âges étaient composés de 10 à 15 individu représenté un foyer inflammatoire unique. L'analyse de ces images par LSCM a montré la présence de cellules positives pour MyHC 334-352 dextramers (rouge), et CD4 (vert) et on pouvait s'y attendre, les cellules liées avec les deux dextramers et CD4 est apparu cellules ponctuées comme jaune (figure 3, les panneaux supérieurs) . La coloration de fond pour dextramers de contrôle était négligeable (Figure 3, panneaux inférieurs). Les nombres totaux de cellules + T CD4 + DEXT et le nombre total de cellules T CD4 + ont été déterminées pour chaque section, et les chiffres de toutes les sections ont été ajoutés ensemble pour obtenir le nombre total de chaque sous-ensemble (cellules + T CD4 + DEXT; CD4 + cellules T).

Figure 1
Figure 1. Détection des cellules T CD4 spécifiques de PLP in situ par coloration avec PLP 139-151 dextramers. EAE a été induite chez des souris SJL par l'immunisation des animaux avec PLP 139-151 en CFA. À la terminaison, cerebrums collectées à partir de souris atteintes d'EAE ont été noyées dans 4% d'agarose, et les coupes ont été faites en utilisant vibratome. Après coloration avec des cocktails contenant soit PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 ou TMEV 70-86 dextramers (contrôle) / anti-CD4 et fixant à 4% paraformaldéhyde tampon PBS, les coupes ont été lavées et montées pour examen par LSCM. Top panneaux: deux sections distinctes colorées avec PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Panneaux de fond: deux sections distinctes colorées avec TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Le panneau de gauche: CD4, vert; Panneau Moyen: dextramers, rouge; Panneau de droite: fusionné (cellules flèches, DEXT + T CD4 +). Grossissement 1000 X (adoptée:.. Massilamany et al, 2014 coloration directe avec majeur d'histocompatibilité de classe II du complexe Dextramers permet la détection de l'antigène spécifique, autoréactifs CD4 des cellules Ts In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Sections Figure 2. Une approche pour quantifier DEXT cellules + dans les cerveaux et les cœurs. Paires sont fabriqués à partir de cerveau ou le cœur de l'oreillette excisées comme indiqué (Groupe 1). Une section de chaque paire correspondant aux organes indiqués a été désigné pour la coloration avec dextramers spécifiques (cerveau, PLP 139-151; dextramers coeur, MyHC dextramers 334-352), et l'autre série de sections pour dextramers de commande (cerveau, TMEV 70 - 86; coeur, RNase 43-56). Après la fixation et de montage, les coupes ont été examinées pour localiser les foyers inflammatoires basée sur la coloration avec CD4 par LSCM (mag d'originenification, 40X) (Groupe 2). Chaque foyer inflammatoire comme visualisé en trois dimensions (3D) vue (Groupe 3) a été soumis à une série d'images en série séquentielle 'Z' (Groupe 4). Dans toutes les images, les cellules positives à la fois pour dextramers spécifiques ou de contrôle et CD4 ou CD4 seul ont été comptées en utilisant le logiciel «ImageJ» (adoptée:.. Massilamany et al, 2014 coloration directe avec majeur d'histocompatibilité de classe II du complexe Dextramers permet la détection de l'antigène spécifique, autoréactifs CD4 cellules T In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Détection des cellules cardiaques spécifiques myosine T CD4 par in situ + CD4 + (adoptées:.. Massilamany et al, 2014 coloration directe avec majeur d'histocompatibilité de classe II du complexe Dextramers permet la détection de l'antigène-spécifiques, autoréactifs CD4 cellules T In Situ PLoS ONE 9 (1):. E87519). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Contrairement tétramères CMH de classe I, l'utilisation de tétramères CMH de classe II pour les applications de routine continue d'être difficile, surtout pour énumérer les fréquences de précurseurs de cellules T CD4 autoréactifs de faible affinité, en partie à cause de leur dépendance à l'égard d'activation 6,15-17. Récemment, ce problème a été contourné par la création de la prochaine génération de tétramères, appelé "dextramers," ce qui nous permet de détecter les cellules spécifiques de l'antigène T CD4 pour un certain nombre d'auto-antigènes, comme PLP 139-151, MOG 35-55 et MyHC 334 - 352 8. Dans ce rapport, pour la première fois, l'utilité de dextramers CMH de classe II pour détecter et quantifier les cellules autoréactives T CD4 in situ a été démontrée en utilisant des coupes de cerveau de souris atteintes d'EAE, et les sections de coeur de souris EAM. Sur une base de réaction, dextramers offrent l'avantage de nécessiter une petite quantité de complexes CMH / peptide. Dans ce protocole, chaque réaction ne nécessite que 0,75 pg de monomères du CMH / peptide. En outre, staining avec dextramers est une réaction en une étape, étant donné que dextramers sont co-incubées avec des anticorps anti-CD4, et le procédé entier, à partir de tissu de sectionnement de coloration, peut être terminée en moins d'un jour. En revanche, les protocoles publiés pour la coloration in situ avec des tétramères classiques impliquent couramment dans les procédures d'amplification dans lequel les signaux fluorescents sont amplifiés en utilisant des anticorps secondaires de fluorophores. En conséquence, les procédures de coloration peuvent prendre jusqu'à trois jours pour compléter 18-20.

En outre, l'utilisation de dextramers en sections cérébrales permet la détection de cellules T spécifiques de l'antigène de profondeur dans les coupes de tissus, même jusqu'à 50 um. Il a été noté que PLP 139-151 CD4 + cellules DEXT + ont été trouvés à être situé à la fois périvasculaire et également dans le parenchyme. En outre, l'intensité des signaux générés à partir de MyHC 334-352 dextramers était faible dans les sections cardiaques par rapport aux PLP 139-151 dextramers dans le cerveau sections (Figure 1), et une telle variation peut refléter les caractéristiques uniques de chaque organe. Une de ces variables est la teneur en lipides qui est présente en grande quantité dans le tissu cérébral, par opposition à un tissu cardiaque qui contient les fibres musculaires striées principalement pouvant potentiellement limiter la diffusion aisée de dextramers dans le foyer inflammatoire. À l'appui de cette notion, MyHC 334-352 cellules DEXT + ont été détectés seulement à une profondeur de 20 um dans la majorité des sections cardiaques. En outre, MyHC 334-352 DEXT + cellules étaient présents dispersés à travers le myocarde suggérant la nature diffuse des infiltrats inflammatoires dans les lésions myocarditic.

En général, les deux principaux facteurs peuvent influencer négativement la détection de cellules T spécifiques de l'antigène in situ par LSCM. En premier lieu, les signaux émis par l'insuffisance des fluorophores peuvent conduire à la nécessité d'amplifier les signaux en utilisant des anticorps fluorophores. Deuxièmement, une telle tache indirecttion peut porter atteinte à la spécificité, comme la coloration de fond pour les réactifs de contrôle peut également augmenter proportionnellement 18,19. Ces limites ont été contournées par coloration directe avec les dextramers. Bien que, la détection de cellules T CD4 a été démontré avec succès sections frais, l'utilisation de réactifs dextramer dans les tissus congelés nécessite des études supplémentaires, qui peut être un défi que la conservation de tissus intégrité peut être difficile en raison de la tendance pour les tissus pour obtenir désintégré lors de diverses étapes coloration 18,19.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association et de la Fondation cardiomyopathie des enfants (SDG2462390204001) et les Instituts nationaux de santé (de HL114669). CM est un bénéficiaire d'une subvention de bourse de recherche postdoctorale décerné par la Fondation myocardite, NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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References

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Détection <em>in situ</em> de autoréactifs T CD4 des cellules dans le cerveau et le cœur à l&#39;aide majeur d&#39;histocompatibilité Dextramers classe II
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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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