Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

doi: 10.3791/51679 Published: August 1, 2014

Summary

הפרוטוקול כדי לזהות תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי במוח ולב על ידי צביעה ישירה עם הכיתה השנייה dextramers המורכב histocompatibility הגדול תואר בדוח זה. לניתוח מקיף, שיטה אמינה כדי למנות את התדרים של תאים מסוג CD4 + T אנטיגן הספציפי באתר היא גם המציאה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השימוש מורכב histocompatibility הגדול (MHC) בכיתה השנייה tetramers לזיהוי של תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי כבר אתגר 1-7. כדי לשפר את רגישות זיהוי של MHC הכיתה השני tetramers, צוות המחקר יצר tetramers של הדור הבא, המיועד "dextramers" 8. Dextramers להכיל עמוד השדרה dextran בי moieties streptavidin-fluorophore המרובים מצומדת, כך שיכולים להיות מצורפים כמה, מונומרים MHC biotinylated פפטיד קשור למולקולת dextran אחד 9. לפיכך, אגרגטים גדולים של dextramers MHC שמכיל כמה מתחמי MHC-פפטיד יכולים לקיים אינטראקציה עם קולטנים מרובים תא T (TCRs).

קבוצה זו נוצרה בזמן אחרון dextramers לאנטיגנים עצמיים שונים והוכיחה כי רגישות זיהוי של dextramers הייתה כ פי חמש יותר מאשר tetramers 8. המערכות הניסיוניות כוללות Encephalomyelitis אוטואימוניות ניסיוני (EAE) מושרה עם חלבון proteolipid (PLP) 139-151 בעכברי SJL; EAE מושרה עם גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (MOG) 35-55 בC57Bl / 6 עכברים; ודלקת שריר הלב ניסויי אוטואימוניות (EAM) מושרה עם שרשרת α שרירן לב הכבד (Myhc) 334-352 בעכברים / י. מחקר זה מדגים את השימוש בPLP 139-151 - וMyhc 334-352 dextramers כדי לזהות תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי באתר עם ​​סגוליות ידי פיתוח פרוטוקול מכתים ישיר, ובכך מבטל את הצורך להגביר את האותות מבאמצעות נוגדני fluorophore, מתקרב מועסק בדרך כלל עם השימוש של tetramers. בנוסף, שיטה מקיפה של הערכת רקמות יש גם המציאה כדי למנות באופן מהימן את התדרים של תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי באתר 10. זיהוי של תאי T אנטיגן ספציפי באתר מאפשר תיחום של אירועים שנגרמו על ידי גירויי אנטיגני ספציפיים מאלה הנגרמים על ידי הפעלה עובר אורח. כמו כן, הטכניקה באתרו גם providהזדמנויות es כדי לעקוב אחר קינטיקה של חדירות תא T אנטיגן ספציפי באיברי המטרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הצהרת אתיקה:

נהלי כל החיה שנערכו בהתאם להנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי אוניברסיטת נברסקה לינקולן, לינקולן, NE.

1. אינדוקציה של EAE

  1. כדי לגרום EAE, להכין תחליב פפטיד / adjuvant של פרוינד המלא (CFA), כפי שמתואר ב11 בשינויים הבאים: שלב 1.1:. להכין PLP 139-151 בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר בופר פוספט 1x (PBS) שלב 1.4:. להשתמש 200 μl של תחליב המכיל CFA של PLP 139-151 100 מיקרוגרם לכל חיה שלב 1.4.1: לחסן את עשרה בעלי חיים, להכין 2 מיליליטר של תחליב על ידי ערבוב 1 מיליליטר של PLP 139-151 (1 מ"ג / מיליליטר ב1x . PBS) ונפח שווה של CFA שלב 1.5: להזריק 200 μl של אמולסיה במינונים מפוצלים מתחת לעור בשני אזורים מפשעתי (~ 75 μl כל אחד) ואזור עצם חזה (~ 50 μl) של חמישה עד שישה שבועות בן FEMAעכברי le SJL / י. צעדים 1.7 ו1.8 אינם ישימים לזירוז של EAE.

2. ניקוד קליני עכברים EAE וקצירה של Cerebrums

  1. לפקח על בעלי החיים להופעת סימנים קליניים, ואת ציון המחלה החומרה יומית מpostimmunization 9 היום באופן הבא: 0 - בריא; 1 - הצליעה חולשת גפיים או זנב אחורית אבל לא את שניהם; 2 - הצליעה חולשת גפיים זנב ואחורי; 3 - שיתוק חלקי של גפיים אחוריות; 4 - שיתוק של גפיים אחוריות מלא; 5 - גוסס או מת 12.
  2. להרדים את העכברים כשהם מגיעים לציון נוירולוגית של 3 או 4 באמצעות CO 2. כדי להרדים את העכברים, מראש למלא את תא המתת חסד ראשון עם CO 2 על ידי הפיכת הרגולטור של טנק ה-CO 2 שלא יעלה על 6 psi ולאפשר חיות להישאר בתוך החדר למשך כ 5 דקות כדי להשיג חנק מוחלט. משרים את החיות מורדמים באלכוהול 70%. מייד, הנח את החיות על משטח סופג ובעזרת זוג סטרילי עבורפטריות לבנות ומספריים לחשוף את לבם על ידי חיתוך דרך חלל בית החזה. לנקב את auricles הנכון וינקב על ידי הזרקת 10 מיליליטר של 1x PBS הקר לתוך חדריו שמאלי של הלב.
  3. לחפור את הגולגולת על ידי לגזום את הגולגולת בצורה מעגלית באמצעות מספריים מעוגלים, ובזהירות, להעיף את עצמות גולגולת עם מלקחיים. לקצור את המוח על ידי להקהות נתיחה ובאמצעות אזמל נקי, מוח גדול נפרד מהמוח הקטן. מניחים את המוח בצינור המכיל קר 1x PBS ולהשאיר את הצינור על קרח עד לעיבוד.

3. בהכתמה באתרו של סעיפים מוחין עם MHC Class II (IA ים) / PLP 139-151 Dextramers

  1. כן 4% שנאגרו-PBS agarose התכה נמוכה, להמס על ידי חימום ב50 ° C ולהשאיר אותה באמבט המים C ° 40 עד לשימוש.
  2. מניחים את המוח בקלטת היסטולוגיה עובש בסיס עמוק חד פעמית שמר על קרח, ויוצקים agarose המותך (40 מעלות צלזיוס). באופן מיידי, לחץ על המוח בעדינותעם מלקחיים כדי להטביע את הרקמה. השאר את הקלטת על קרח למשך 15-20 דקות עד להתמצקות היא מוחלטת.
  3. מלא את האמבטיה vibratome עם מצונן 1x PBS. למלא את החלל סביב vibratome אמבטיה עם קוביות קרח כדי לשמור על הטמפרטורה של PBS בין 0 ל 2 ° C. תקן את סכין גילוח נקי לvibratome ולקבוע את זווית הלהב ל15 °.
  4. מיקום של רקמה בvibratome. Trim agarose עודף מכל הצדדים של הרקמה משובצת ומעט לחשוף את פני השטח הגחון של המוח הגדול.
    1. למרוח vibratome גוש רקמה עם דבק סופר ולהעביר את הרקמות מוטבעות agarose על פני השטח המודבק על ידי הנחת משטח הגחון החשוף של המוח הגדול על הדבק לחתך רוחבי. אל תזיזו את הרקמה, ברגע שהרקמה מוגדרת על הבלוק.
    2. מניחים את גוש vibratome המכיל רקמות מוטבעות agarose על קרח, ולאפשר לדבק להתייבש במשך 15 דקות.
  5. בינתיים, הנח את צ'אם הרקמהBers אחד לכל טוב של צלחת 24 גם. למלא את הבארות המכילות תאי רקמה עם 1 מיליליטר של 1x PBS הקר, ולהשאיר את הצלחת על קרח.
    1. הכן את תאי רקמות על ידי הצמדת ניילון דק רשת כדי לחתוך סוף פיפטה פוליפרופילן 25 מיליליטר באמצעות דבק סופר; לאחר זמירה הרשת העודפת סביב פיפטה, לחתוך את פיפטה אורך של 1 סנטימטר מהרשת.
  6. מנמיכים את להב vibratome לרמה של המשטח העליון של רקמות; להגדיר את מהירות vibratome ל0.22 מ"מ / השני ולהתחיל חתך עם תנועה קדימה לעשות 200 מיקרומטר חלקים עבים. העבר את הסעיף מוחי אחד לכל גם בעזרת מברשת רכה בצבעי מים לתאי הרקמה ממוקמים בתוך הבארות של צלחת 24 גם. שמור את הצלחת על קרח עד חתך הוא מלא על מנת למנוע ניוון רקמות. הערה: בצע את השלבים הבאים כדי להשיג בשלושה חלקים בסך הכל, לזווג משלושה אזורים שונים של מוח הגב אל פני השטח הגחון (איור 2). חלק אחד מכל זוג (בשלושה חלקים בסך הכל) ממוקם בשלושה תאי רקמה בודדים מיועדים לצביעה עם dextramers הספציפי (ים IA / PLP 139-151) ואנטי CD4. כמו כן, קבוצה נוספת של שלושה חלקים אשר ממוקמים בשלושה תאי רקמה בודדים מיועדות לצביעה עם dextramers שליטה (IA / שעות TMEV 70-86) ואנטי CD4.
  7. העבר את שלושת תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers הספציפי לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם תא אחד בכל טוב שבו, PLP 139-151 dextramers 300 μl של קוקטייל המכיל allophycocyanin (APC) מצומדות (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואנטי CD4-phycoerythrin (PE; 5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון (1x PBS עם 2% נסיוב עזים נורמלים) נוספו בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה.
  8. בדומה לכך, להעביר את שלושת תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers שליטה לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם חדר אחד לכולנוll בי, 300 μl של קוקטייל המכיל TMEV APC-מצומדות 70-86 dextramers (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואנטי CD4-PE (5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון נוסף בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה. הערה: עיין בMassilamany ואח', 8 להכנת dextramers, ומולקולות dextran להכין dextramers סופקו באדיבות על ידי Immudex, קופנהגן, דנמרק..
  9. לתייג את הבארות, ולעטוף את הצלחת עם נייר אלומיניום ומניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה להגדיר לסיבובים עדינים ל1.5 שעות בחושך ב RT.
  10. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף חלקי רקמות על פלטפורמת הנדנדה, על ידי העברת תאי הרקמה טרי גם מכילה 1 מיליליטר של 1x PBS הקר, ולהימנע מכדרור את תוכנו של אחד גם לתוך השני. חזור על שטיפה שלוש פעמים, מה שמאפשר לפחות 10 דקות לכל לשטוף. להבטיח כי חלקי הרקמות לא מקבלים מיובשים כפי שהם יכולים להיצמד לדפנות של החדר.
  11. לתקן את הסעיפים על ידי העברת צ'אם הרקמהbers לתוך באר טרי בצלחת 24 גם מכילה 1ml של 4% paraformaldehyde המסונן נאגר-PBS (pH 7.4) על פלטפורמת נדנדה במשך שעה 2 עם סיבובים עדינים.
  12. חזור על שטיפה שלוש פעמים כמתואר בשלב 3.10.
  13. מניחים את החלקים המוכתמים וקבועים בשקופית מיקרוסקופית נקייה בעזרת מברשת רכה בצבעי מים. נגב את עודפי מים בלי לגעת בסעיף, ולעגן את הסעיף באמצעות הרכבה בינונית. כסה עם coverslip מיקרוסקופי ולאפשר את השקופיות לייבוש על RT O / N בחדר החשוך.
  14. אחסן את השקופיות בקופסא אחסון שקופיות אור ההוכחה ב 4 ° C.

4. אינדוקציה של EAM ואוסף לבבות

  1. לגרום EAM כמתואר בהתייחסות 11.
  2. להרדים את העכברים בpostimmunization יום 21 באמצעות חדר נקי מצויד עם CO 2 בלון גז, ולהשרות את בעלי החיים באלכוהול 70%. מייד, הנח את החיות על משטח סופג ובעזרת זוג מלקחיים ומספריים לחשוף את הלבים על ידי חיתוך דרך חלל בית החזה. לנקב את auricles הנכון וינקב על ידי הזרקת 10 מיליליטר של 1x PBS הקר לתוך חדריו שמאלי של הלב. לאסוף את לבם ואת המקום בצינורות המכילים קר 1x PBS.

5. בהכתמה באתרו של מדורים לב עם MHC Class II (k IA) / Myhc 334-352 Dextramers

  1. הכן 4% שנאגר PBS נמוך היתוך agarose, להמס על ידי חימום ב50 ° C ולהשאיר אותה ב40   ° C אמבט מים עד לשימוש.
  2. מניחים את הלב בקלטת היסטולוגיה חד פעמית עמוקה עובש בסיס כל הזמן על קרח, ויוצקים מותכת 40 מעלות צלזיוס עד agarose הרקמות שקועות לחלוטין כמתואר בשלב 3.2.
  3. בצע את השלב 3.3.
  4. Trim agarose עודף מכל הצדדים של הרקמה משובצת ומעט לחשוף את הבסיס של הלב. למרוח vibratome גוש רקמה עם דבק סופר ולהעביר את הרקמות מוטבעות agarose על פני השטח המודבק על ידי הנחת המשטח החשוף שללב על הדבק. אל תזיזו את הרקמה, ברגע שהרקמה מוגדרת על הבלוק.
    1. מניחים את גוש vibratome המכיל רקמות מוטבעות agarose על קרח, ולאפשר לדבק להתייבש במשך 15 דקות.
  5. בצע את פעולות 3.5 ו3.6.
  6. להעביר את חלקי לב באמצעות מברשת רכה בצבעי מים לתאי הרקמה ממוקמים בתוך הבארות של צלחת 24 גם. שמור את הצלחת על קרח עד חתך הוא מלא כדי למנוע השפלה של רקמה. הערה: בצע את השלבים הבאים כדי להשיג בסך הכל, שמונה סעיפים לזווג מהקודקוד לבסיס של הלב (איור 2). מניחים את כל הסעיפים בתאי רקמה, הקצאה של עד 3 חלקים לכל תא. סעיף אחד מכל זוג (בשמונה חלקים בסך הכל) מיועד לצביעה עם dextramers הספציפי (IA k / Myhc 334-352) ואנטי CD4. כמו כן, קבוצה נוספת של שמונה סעיפים מיועדות לצביעה עם dextramers שליטה (IA k / RNase 43-56) ואנטי CD4.
  7. העברשלושה תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers הספציפי לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם תא אחד בכל טוב שבו, 300 μl של קוקטייל המכיל Myhc 334-352 dextramers APC-מצומדת (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ו אנטי CD4-PE (5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון נוסף בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה.
    1. בדומה לכך, להעביר את שלושת תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers שליטה לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם תא אחד בכל טוב שבו, 300 μl של קוקטייל המכיל RNase APC-מצומדות 43-56 dextramers (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואנטי CD4-PE (5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון נוסף בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה.
  8. לתייג את הבארות, ולעטוף את הצלחת עם נייר אלומיניום ומניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה להגדיר לסיבובים עדינים ל1.5 שעות בחושך ב RT.
  9. בצע את הפעולות, 3.10-3.11
  10. thr חזור כביסהקרח כמתואר בשלב 3.10.
  11. מניחים את החלקים המוכתמים וקבועים (עד שלושה חלקים / שקופיות) בשקופית מיקרוסקופית נקייה בעזרת מברשת רכה בצבעי מים. נגב את עודפי מים בלי לגעת בחלקים, ולעלות את החלקים באמצעות הרכבה בינונית. כסה עם coverslip מיקרוסקופי ולאפשר את השקופיות לייבוש על RT O / N בחדר החשוך.
  12. אחסן את השקופיות בקופסא אחסון שקופיות אור ההוכחה ב 4 ° C.

6. ניתוח Dextramer + (+ dext) CD4 + T תאים על ידי סריקת הלייזר Confocal מיקרוסקופ (LSCM) (משותפים למוח ומדורי לב שני)

  1. השתמש במערכת מיקרוסקופ confocal 90i ניקון A1-Eclipse לסריקה ולרכישת תמונות שבשגרה. כדי להתחיל לחץ פתוח, תוכנת ש"ח האלמנטים AR (גרסת 4.13).
    1. בחר "TRITC" וערוצים "Cy5" מהלוח. אורכי גל העירור / פליטת בהתאמה לערוצי TRITC וCy5, 561.5 ננומטר / 553-618 ננומטר ו640.7 ננומטר / 663-738 ננומטר מופיעים כברירת מחדל.
    2. הקצה את pseudocolors "ירוק" ו "אדום" לTRITC (CD4-PE) וCy5 ערוצים (dextramer-APC), בהתאמה.
    3. מניחים את השקף כדי להיבחן על הבמה המיקרוסקופית ולהתמקד באופן ידני תחת הגדלה של X100. הגדר את "HV" ל110 וקזז ל "0". לחץ על "פוקוס" ולהתאים את "המתח" כדי לייעל את הלייזרים.
    4. לחץ על "פוקוס"; לסרוק את הסעיף מלמעלה עד למטה, ולהגדיר את הרמה "Z" לרכישת תמונה. לחץ על "סדרת CH" ולרכוש את רצף התמונה. זהה dext + CD4 + T תאים המופיעים תאי punctate צהובים כמבוססים על שיתוף לוקליזציה של אותות שנוצרו משני האדום (dextramers) והירוק (CD4) ערוצים.
  2. השתמש במיקרוסקופ confocal FV500-BX60 אולימפוס לספירה כמותית קלה של תאים + CD4 + T dext. כדי להתחיללחץ פתוח, תוכנת FluoView (גרסת 4.3).
    1. בחר את הצבעים "Cy3" ו "Cy5" מהתפריט הנפתח, ולחץ על "חלים" כדי לטעון את הלייזרים, בהתאמה. הערה: אורכי גל עירור / פליטה לCy3 (543 ננומטר / pseudocolored "ירוקים"; CD4-PE) וCy5 (633 ננומטר / pseudocolored "אדום"; dextramer-APC) ערוצים.
    2. מניחים את השקף כדי להיבחן בשקופית המיקרוסקופית, ולמקד אותה באופן ידני בהגדלה נמוכה (4X או 10X). לחץ על "פוקוס", ואילו לייזר Cy3 הוא על, ולהתמקד ההתמקדות הדלקתית.
    3. לשנות את המטרה להגדלת 100x. הגדר את גודל קובץ ל" 512/512 "מהתפריט הנפתח. לחץ על "פוקוס" ולהתאים את הערכים עבור "PMT", "רווח" ו "אופסט" פרמטרים כדי לייעל את הלייזרים בנפרד עבור Cy3 וCy5.
    4. לחץ על "שלב Z" ולאחר מכן לחץ על "פוקוס", ואילו את שני הלייזרים נמצאים. ערכההעובי של "שלב Z" על ידי לחיצה על "למעלה" וחצים "למטה". הגדר את המרווח "Z" ל2 מיקרומטר.
    5. לחץ על "עצור", ובחר באפשרות "Seq123". לאחר מכן, לחץ על "XYZ" ולהתחיל לרכוש תמונות סדרה "Z" לאזור שנבחר בתוך המוקד דלקתי. שמור את "תמונות סידורי Z" כקבצי AVI. כדי לשמור קבצי תמונה, בחר את התמונה מ" התמונה סידורי Z ", ולאחר מכן לשמור כפורמט" ריב ".
  3. בחן את שלושה חלקים לזווג מהמוח הגדול שבו קבוצה אחת של שלושה חלקים הייתה מוכתמת בים IA / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 והסט האחר של שלושה חלקים עם של IA / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 לבצע ניתוח כמוני.
    1. באופן דומה, לנתח שמונה סעיפים לזווג ללב, שבו, סט אחד משמונה קטעים היה מוכתם בIA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 ואחר set של שמונה חלקים עם RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. לבחון 10-15 מוקדים דלקתיים לכל סעיף במוח גדול, ובכל פוקוס, לרכוש סט של 15-25 תמונות ברצף סדרתי.
    1. לבחון כולל של 20 מוקדים דלקתיים מכל שמונה הסעיפים של לב ומכל מוקד לרכוש 10-15 תמונות סידורי ברצף. קח תמונות סדרתי "Z" על ידי סריקת השקופיות בתנועה 'אופקית אנכית מעלה אופקית אנכית כלפי מטה ", כך שהחזרה של סדרה" Z "בתוך אותו המוקד הוא התחמקה.
    2. ברגע שתמונות סדרתי "Z" הם כבשו, תנו שם לקבצים על ידי זיהוי מספרי שקופיות, שמו של החלקים, ומספר תמונות סדרתי "Z" שצולמו.
      1. השתמש בתוכנת 'ImageJ' לספור תאים + CD4 + T dext ביחס למספר הכולל של תאי CD4 + T. בחר את "הסוג של דלפק 'ב' ImageJ, לבדוק ו# 8216; להציג את כל 'ולהתחיל לספור על ידי לחיצה על מרכזו של כל תא וימשיך לספור בשונות', 'תמונות סידורי Z באמצעות חצים בצד. לאחר ספירת כל תאי T מסוג CD4, לבחור סוג אחר של דלפק ולספור CD4 + dext + תאי T. לחץ על כרטיסיית התוצאות כדי לקבל את המספר הכולל של תאים נספרו עם שני מונים שונים.
      2. כדי לקבל את המספר הכולל, להוסיף את מספר התאים בכל תמונות סדרתי "Z" המייצגות את כל שלושה חלקים במוח, או בכל חלקי לב שמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בדו"ח זה, באיתור באתרו של אנטיגן ספציפי, תאי T מסוג CD4 אוטוריאקטיבים ידי צביעה ישירה עם כיתת MHC II dextramers מתואר. חלקים במוח שנכרתו זה נגזרו מעכברי EAE ומוכתם עם קוקטיילים המכילים PLP 139-151 (ספציפי) או TMEV 70-86 dextramers (שליטה) ואנטי CD4. הלוחות העליונים באיור 1 מציג ניתוח LSCM סעיפים מוחין costained עם PLP 139-151 dextramers (אדום) ונוגדנים מסוג CD4 (ירוק), שבו התאים כפולים חיוביים הופיעו צהובים. כגון תכונה נעדרה בסעיפים מוכתמים בTMEV 70-86 dextramers (שליטה) (פנלים תחתון). תאי costained (dext + CD4 +) הראו נקודות punctate ברחבי הפריפריה. ניתוח כמותי של תאי T PLP ספציפי בסעיפי המוח מעורב בשלבים הבאים (איור 2): 1) סעיפים של שלושה זוגות שנעשו, וסעיף אחד מכל זוג היה מוכתם באופן אישי עם אנטי CD4 וPLP 139-151 dextramers. כמו כן, קבוצה נוספת של שלושה חלקים הוכתמו אנטי CD4 ובקרה (TMEV 70-86) dextramers. 2) מסעיף נתון, מוקדים דלקתיים (10-15) זוהו מבוססים על צביעה אנטי CD4. 3) קבוצה של תמונות 'Z' סידוריים (15-25) נלקחו מכל רצף מוקד מלמעלה למטה עם מרווח של 2 מיקרומטר בין כל אחד. בעיקרו של הדבר, 10-15 סטים דומים של תמונות סדרתי "Z" המייצגים את המספר שווה של מוקדים דלקתיים נותחו בכל סעיף. 4) בתמונות בודדות, תאי CD4 + (ירוק), התאים חיוביים עבור שתי dextramers (אדום) וCD4 (ירוק) שהופיע תאי punctate צהובים כנפקדו על ידי סימונם באופן פרטני באמצעות תוכנת הקוד הפתוחה, ImageJ, ולבסוף, סכום כולל שהושג עבור כל מקטע על ידי הוספת מספר התאים נספרו בכל תמונות סדרתי "Z". בגלל שהתאים היו מסומנים, האפשרות לספר את התאים במספר רבים של תמונות, כי הםחפיפה חוסלה. לפיכך, ספירה אמינה של תאים + dext ביחס למספר הכולל של תאי מבטאים CD4 יכולה להיות מושגת.

מחקר זה הורחב עוד יותר כדי להדגים את השימוש בחומרים כימי dextramer לאיתור תאי T רגיש אנטיגן באתר בEAM מושרה עם Myhc 334-352 בעכברים / J, שהיא גם מחלה בתיווך תא T 13,14. שמונה סעיפי לב לזווג התקבלו, כל 200 מיקרומטר עבה, מעכברי EAM (איור 2). מכל זוג, סעיף אחד (עם סך של סעיפים 8) היה מוכתם בMyhc 334-352 dextramers ואנטי CD4, ואילו קבוצה נוספת של סעיפים (8 בסך הכל) הייתה מוכתמת בRNase 43-56 dextramers (שליטה) ואנטי -CD4. עשרים סטים של תמונות סדרתי "Z" המקביל שלמוקדים דלקתיים רבים המייצגים את כל שמונת החלקים נרכשו ברצף כאמור לעיל (איור 2). בעיקרו של דבר, קבוצת נתונה של im סדרתי "Z"גילים כללו 10-15 בודדים מיוצגים מוקד דלקתי אחד. ניתוח של תמונות אלה על ידי LSCM הראה הנוכחות של תאים חיוביים לMyhc 334-352 dextramers (אדום), וCD4 (ירוק) וכצפוי, התאים מאוגדים עם שתי dextramers וCD4 הופיע תאי punctate צהובים (איור 3, לוחות העליונים) . מכתים הרקע לdextramers שליטה היה זניח (איור 3, פנלים תחתון). המספרים הכולל של תאים + CD4 + T dext ואת המספר הכולל של תאים מסוג CD4 + T נקבעו לכל קטע וספירה מכל הסעיפים נוספו יחד כדי לגזור את המספר הכולל של כל קבוצת משנה (תאים + CD4 + T dext; CD4 + T תאים).

איור 1
איור 1. איתור של תאי T מסוג CD4 PLP ספציפיים על ידי באתר צביעה עם PLP 139-151 dextramers. EAE היה מושרה בעכברי SJL ידי חיסון החיות עם PLP 139-151 בCFA. בסיום, cerebrums נאסף מעכברי EAE היו משובץ ב4% agarose, והסעיפים נעשו באמצעות vibratome. לאחר צביעה עם קוקטיילים המכילים גם 139-151 dextramers/anti-CD4 PLP או TMEV 70-86 dextramers (שליטה) / אנטי CD4 ותקן עם 4% paraformaldehyde נאגר-PBS, חלקים נשטפו ורכובים לבדיקה על ידי LSCM. לוחות העליונים: שני חלקים נפרדים מוכתמים עם PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. פנלים תחתון: שני חלקים נפרדים מוכתמים בTMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. פנל משמאל: CD4, ירוק; פנל התיכון: dextramers, אדום; פנל ימני: התמזג (תאי חצים, dext + CD4 + T). 1,000 X (שאומץ על ההגדלה מקורית:.. Massilamany אח' 2014 מכתים ישיר עם Dextramers סרן histocompatibility כיתת הקומפלקס השני היתרי איתור של, תא אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 אנטיגן ספציפיבאתרו של PLoS ONE 9 (1):.. e87519) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
חלקי איור 2. גישה לכמת תאים + dext במוח ובלב. מותאמים עשויים ממוח או לב נכרת אפרכסת כפי שמוצג (לוח 1). סעיף אחד מכל זוג המתאים לאיברים שצוינו היה מיועד לצביעה עם dextramers הספציפי (מוח גדול, PLP 139-151 dextramers; לב, Myhc 334-352 dextramers), וקבוצה אחרת של סעיפים לdextramers שליטה (המוח הגדול, TMEV 70 - 86; לב, RNase 43-56). לאחר תיקון והרכבה, החלקים נבדקו לאיתור מוקדים דלקתיים המבוסס על צביעה עם CD4 ידי LSCM (mag המקוריnification, 40X) (לוח 2). בכל מוקד דלקתי כמו דמיינו בתצוגה תלת ממדי (3D) (לוח 3) היה נתון למערכת של הרצף "Z" תמונות סדרתי (4 בלוח). בכל התמונות, תאים חיוביים עבור שתי dextramers ספציפי או שליטה וCD4, או CD4 לבד נספרו באמצעות התוכנה 'ImageJ' (שאומצה:.. Massilamany אח' 2014 מכתים ישיר עם Dextramers השני הכיתה מורכבת סרן histocompatibility היתרי איתור של אנטיגן ספציפי, תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 באתרו PLoS ONE 9 (1):.. E87519) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איתור של תאי T מסוג CD4 שרירן ספציפי לב על ידי באתר + CD4 + (שאומץ:.. Massilamany אח' 2014 מכתים ישיר עם Dextramers סרן histocompatibility כיתת הקומפלקס השני היתרי איתור של, תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי באתרו PLoS ONE 9 (1):. E87519). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שלא כמוני tetramers כיתת MHC, השימוש בMHC הכיתה השני tetramers ליישומים שיגרתי ממשיך להיות מאתגר, במיוחד כדי למנות את תדרי המבשר של תאים בעלת זיקה נמוכה אוטוריאקטיבים T מסוג CD4, נובעים בחלקו תלות ההפעלה שלהם 6,15-17. לאחרונה, בעיה זו נעקפה על ידי יצירת הדור הבא של tetramers, שנקרא "dextramers", המאפשרת לנו לזהות תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי למספר autoantigens, כגון 139-151 PLP, MOG 35-55 וMyhc 334 - 352 8. בדו"ח זה, בפעם הראשונה, את השירות של MHC הכיתה השני dextramers כדי לזהות ולכמת תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי באתרם הודגם שימוש בחלקים במוח מעכברי EAE, וחתכים לב מעכברי EAM. על בסיס תגובה, dextramers מציע את היתרון של צורך בכמות קטנה של מתחמי MHC / פפטיד. בפרוטוקול זה, כל תגובה דורשת רק 0.75 מיקרוגרם של מונומרים MHC / פפטיד. בנוסף, STAining עם dextramers היא תגובת צעד אחד, שכן הם dextramers coincubated עם אנטי CD4, וההליך כולו, מרקמות חתך לצביעה, ניתן לסיים בפחות מיום. לעומת זאת, בפרוטוקולים שפורסמו עבור מכתים אתרו עם tetramers הקונבנציונלי בדרך כלל כרוכים בהליכי הגברה שבה אותות הניאון הם מוגברים באמצעות נוגדנים משניים עבור fluorophores. כתוצאה מכך, ייתכן שנהלים מכתים להימשך עד שלושה ימים כדי להשלים 18-20.

יתר על כן, השימוש בdextramers בסעיפים מוחי מאפשר זיהוי של תאי T אנטיגן הספציפי עמוקים בחלקי הרקמות, אפילו עד 50 מיקרומטר. צוין כי PLP 139-151 + CD4 + תאי dext נמצאו להיות ממוקם perivascularly שניהם וגם בתוך parenchyma. יתר על כן, את עוצמת האותות שנוצרו מMyhc 334-352 dextramers הייתה נמוכה בסעיפי לב בהשוואה לPLP 139-151 dextramers בשניות מוחtions (איור 1), ווריאציה כזו עשוי לשקף את המאפיינים ייחודיים לכל איברים. משתנה אחד כזה הוא תוכן השומנים שהוא מצוי בכמויות גבוהות ברקמת המוח בניגוד לרקמת לב שמכילה סיבי שריר בעיקר מפוספסים שעלולים להגביל את הדיפוזיה קלה של dextramers אל המוקד דלקתי. בתמיכה לרעיון זה, Myhc 334-352 + תאי dext התגלו רק עד לעומק של עד 20 מיקרומטר ברוב חלקי לב. בנוסף, Myhc 334-352 dext + תאים נכחו פזורים בכל דרך שריר הלב המצביע על האופי המפוזר של מחלחל דלקתי בנגעי myocarditic.

באופן כללי, שני גורמים עיקריים יכולים להשפיע לרעה על זיהוי של תאי T אנטיגן הספציפי באתרו על ידי LSCM. ראשית, אותות מספיקים הנפלטים על ידי fluorophores יכולים להוביל לצורך להגביר את האותות באמצעות נוגדני fluorophore. שנית, כתם כזה עקיףing יכול לערער את הספציפיות, כמכתים רקע לחומרים כימיים שליטה יכול גם להגדיל באופן יחסי 18,19. מגבלות אלה לעקיפה על ידי צביעה ישירה עם dextramers. אמנם, זיהוי של תאי T מסוג CD4 הוכח בהצלחה עם קטעים טריים, השימוש בחומרים כימי dextramer ברקמות קפוא דורש מחקרים נוספים, אשר יכול להיות אתגר כמו השמירה של רקמות יושרה עלול להיות קשה בגלל הנטייה לרקמות כדי לקבל התפרק בזמן הצביעה שונות על השלבים 18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הוכרזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי והקרן לילדים קרדיומיופתיה (SDG2462390204001), והמכון הלאומי לבריאות (HL114669). CM הוא נמען של מענק מלגת מחקר פוסט דוקטורט הוענק על ידי קרן דלקת שריר הלב, ניו ג'רזי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73, (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310, (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9, (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219, (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182, (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92, (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166, (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13, (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170, (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165, (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268, (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
<em>באתרו</em> איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter